МР 4.4/3.1.2.0256-21. 4.4. Методы контроля. Общие вопросы по методам контроля. 3.1.2. Эпидемиология. Профилактика инфекционных болезней. Респираторные инфекции. Дифференциация генетических линий вирусов гриппа B (Виктория и Ямагата) в биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Методические указания

(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 01.09.2021)

4.4 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ ПО МЕТОДАМ КОНТРОЛЯ

3.1.2 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ. ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ.

I. Область применения

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее — МР) представлен методологический подход и порядок проведения лабораторного исследования с целью идентификации генетических линий вируса гриппа B (Виктория и Ямагата) с использованием полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) с детекцией в режиме реального времени в биологическом материале.

Данная методика может быть использована при мониторинге за возбудителями гриппа, с целью прогноза эпидемической ситуации, оценки эффективности вакцинации против гриппа и для иных исследовательских целей.

1.2. МР предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты нрав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными, медицинскими и образовательными организациями, проводящими исследования в области эпидемиологии гриппа.

II. Общие положения

2.1. В настоящее время, сменяя друг друга, циркулируют две линии вирусов гриппа B, имеющие значимые антигенные различия (Виктория и Ямагата) [12], разделение которых, предположительно, произошло в 1970-х годах [11].

Всемирная организация здравоохранения (далее — ВОЗ) ежегодно представляет рекомендации <1> по включению штаммов вирусов гриппа в состав вакцины на следующий эпидемический сезон на основании результатов ежегодного мониторинга циркулирующих вирусов гриппа и изучения их генетической и антигенной структуры.

---

<1> Информация в отношении гриппа публикуется на официальном сайте ВОЗ (в свободном доступе): www.euro.who.int/ru/health-topics/communicable-diseases/influenza/publications.

2.2. Для идентификации линий вирусов гриппа B проводят трудоемкие вирусологические исследования, требующие выделения культур вирусов гриппа, с последующим использованием специфических сывороток, что вызывает сложности в связи с возникновением новых антигенных вариантов [12], а также применяется метод секвенирования комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее — кДНК), образуемой в реакции обратной транскрипции геномной рибонуклеиновой кислоты (далее — РНК) вируса гриппа B, что возможно только при наличии достаточно высокой вирусной нагрузки в биологическом материале [8].

2.3. В научных исследованиях с целью идентификации линий вирусов гриппа B применяется метод ПЦР с использованием интеркалирующих красителей с анализом кривых плавления [9, 10, 13, 15, 16], что не требует выделения культуры вирусов или секвенирования кДНК.

Метод ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени отличается более высокой специфичностью и чувствительностью.

III. Описание метода

3.1. Принцип тестирования основывается на одновременной амплификации участков кДНК гемагглютинина (далее — НА) вирусов гриппа B линий Виктория и Ямагата и кДНК экзогенного внутреннего контрольного образца (далее — ВКО) методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

3.2. Амплификация кДНК НА вируса гриппа B проводится при помощи специфичных к этому участку праймеров и фермента ДНК-полимеразы.

3.3. В реакции амплификации участвуют флуоресцентно меченые олигонуклеотиды, комплементарные участкам амплифицируемых кДНК-мишеней, фланкированных праймерами, что позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени.

3.4. С целью контроля качества при проведении ПЦР используется ВКО и контрольные реакции, в которых участвуют положительные и отрицательные контрольные образцы всех этапов ПЦР-анализа.

3.5. ВКО позволяет контролировать все этапы ПЦР-исследования для каждого образца и оценивать влияние ингибиторов на результаты ПЦР-исследования.

3.6. Рекомендуется использовать набор реагентов, позволяющий проводить одновременную амплификацию (в одной пробирке) трех кДНК-мишеней (НА вируса гриппа B линия Виктория, НА вируса гриппа B линия Ямагата и ВКО) и имеющий защиту от контаминации ампликонами за счет применения фермента урацил-ДНК-гликозилазы и дезоксиуридинтрифосфата.

3.7. Перечень материально-технического обеспечения, необходимого для проведения исследования методом ПЦР с детекцией флуоресцентного сигнала в режиме реального времени, представлен в приложении 1 к настоящим МР.

IV. Порядок работы

4.1. Работы с использованием метода ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени проводятся в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <2> и методическими документами <3>.

---

<2> СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» (далее — СанПиН 3.3686-21), утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом 15.02.2021, регистрационный № 62500).

<3> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденные Роспотребнадзором 22.12.2009.

4.2. В работе при выполнении метода ПЦР с использованием гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени используются образцы кДНК, полученные ранее на этапе экстракции и обратной транскрипции из биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки, мокрота/аспираты из трахеи, бронхо-альвеолярная лаважная жидкость, секционный (аутопсийный) материал, культуры вирусов гриппа B), в которых была обнаружена РНК вируса B с помощью наборов реагентов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке <4>.

---

<4> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий»; приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий» (зарегистрировано Минюстом России 09.07.2012, регистрационный номер 24852), с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 25.09.2014 № 557н (зарегистрировано Минюстом России 17.12.2014, регистрационный номер 35201), от 07.07.2020 № 686н (зарегистрировано Минюстом России 10.08.2020, регистрационный номер 59225).

4.3. Допускается хранение образцов кДНК до проведения ПЦР-исследования при температуре от плюс 2 °C до плюс 8 °C 3 суток, при температуре от минус 24 °C до минус 16 °C в течение года и однократное замораживание-оттаивание материала.

4.4 ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

• амплификация кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени;
• анализ и интерпретация результатов.=-

4.5. Выбор пробирок для амплификации зависит от используемого амплификатора с системой детекции в режиме реального времени и формы комплектации реагентов.

4.6. Для внесения в пробирки реагентов, проб кДНК и контрольных образцов используются одноразовые наконечники с фильтрами.

4.7. При подготовке к проведению реакции амплификации (общий объем реакционной смеси 25 мкл, включая объем пробы кДНК 10 мкл) с использованием пробирок с готовой ПЦР-смесью, залитой воском, выполняется следующая последовательность действий:

• отобрать необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью, залитой воском, для амплификации кДНК исследуемых и контрольных образцов;
• убедиться, что воск полностью покрывает раствор на дне пробирок (если это не так, не использовать данные пробирки);
• на поверхность воска внести по 7 мкл смеси буфера с ферментом, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться со смесью под воском;
• в подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб кДНК, полученных в результате экстракции и обратной транскрипции из исследуемых образцов;
• в каждой постановке ПЦР использовать контрольные реакции этапа ПЦР: положительный контроль ПЦР (далее — К+) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К+) и отрицательный контроль ПЦР (далее — К-) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К-).

4.8. При подготовке к проведению реакции амплификации (общий объем реакционной смеси 25 мкл, включая объем пробы кДНК 10 мкл) с формой комплектации ПЦР-смеси, буфера и фермента ДНК-полимераза в отдельных пробирках выполняется следующая последовательность действий:

• рассчитать количество каждого реагента, требующееся для приготовления реакционной смеси (на одну реакцию требуется 10 мкл ПЦР-смеси, 5 мкл буфера и 0,5 мкл ДНК-полимеразы), учитывая, что смесь готовится на общее число исследуемых и контрольных образцов плюс запас на одну реакцию;
• реагенты для приготовления реакционной смеси следует смешивать непосредственно перед проведением ПЦР-исследования, предварительно разморозив, перемешав их содержимое и осадив капли на вортексе;
• в отдельной пробирке объемом 1,5 мл подготовить реакционную смесь, смешав необходимое количество ПЦР-смеси, буфера и ДНК-полимеразы, осадить капли на вортексе;
• отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации кДНК исследуемых и контрольных проб;
• внести в каждую пробирку по 15 мкл приготовленной реакционной смеси, неиспользованные остатки реакционной смеси выбросить;
• в подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб кДНК, полученных в результате экстракции и обратной транскрипции из исследуемых образцов;
• в каждой постановке ПЦР использовать контрольные реакции этапа ПЦР: положительный контроль ПЦР (К+) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К+) и отрицательный контроль ПЦР (К-) (в пробирку с реакционной смесью внести 10 мкл К-).

4.9 Для проведения реакции амплификации на приборе необходимо:

• предварительно запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме реального времени) для выполнения амплификации и детекции флуоресцентного сигнала в соответствии с руководством пользователя прибора и инструкцией к используемому набору (комплекту) реагентов (приложение 2 к настоящим МР);
• установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора, при этом перед установкой в амплификатор планшетного типа необходимо осадить капли со стенок пробирок кратковременным (1 — 3 с) центрифугированием на центрифуге вортекс;
• запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного сигнала;
• по окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации результатов.

4.10. Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР с детекцией в режиме реального времени, ориентируясь на инструкцию и (или вкладыш), прилагаемый к набору (комплекту) реагентов.

4.11. Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены правильные результаты контрольных реакций амплификации кДНК в соответствии с инструкцией и (или) вкладышем, прилагаемым к набору реагентов для типирования (дифференциации линий Виктория и Ямагата) вирусов гриппа B в образцах кДНК, полученных из биологического материала, содержащего РНК вирусов гриппа B, методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации (приложение 3 к настоящим МР).

4.12 Результаты исследования считаются недостоверными в случаях, если:

• для положительного контроля ПЦР (К+) значение порогового цикла по любому из указанных каналов для флуорофоров отсутствует или превышает граничное значение, что требует повторения амплификации и детекции для всех образцов;
• для отрицательного контроля ПЦР (К-) определено значение порогового цикла, что происходит при контаминации лаборатории продуктами амплификации или контаминации реагентов и (или) исследуемых образцов на каком-либо этапе ПЦР-исследования. В этом случае требуется принятие мер по выявлению и ликвидации источника контаминации и повторение амплификации и детекции для всех образцов, в которых обнаружена специфическая кДНК;
• для исследуемого образца определено значение порогового цикла, при этом на графике флуоресценции отсутствует участок характерного экспоненциального подъема (график представляет собой приблизительно прямую линию), что требует проверки правильности выбранного уровня пороговой линии или параметров расчета базовой линии и повторного проведения амплификации и детекции для этого образца при правильном уровне пороговой линии (базовой линии).

---

<5> Примечание: допускается использование основного и вспомогательного оборудования, а также материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; допускается использование других реагентов с аналогичными характеристиками.

1. Набор (комплект) реагентов для типирования (дифференциации линий Виктория и Ямагата) вирусов гриппа B в образцах кДНК методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации.

2. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).

3. Настольный вортекс для пробирок объемом 0,6 мл с возможностью центрифугирования образцов.

4. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени, имеющий не менее 4 каналов детекции флуресцентного сигнала.

5. Автоматические дозаторы переменного объема.

6. Штативы для пробирок объемом 0,2 мл или 0,1 мл.

7. Одноразовые полипропиленовые пробирки мл (при работе с форматом комплектации комплекта реагентов с ферментом в отдельной пробирке):

• завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки объемом 1,5 для приготовления реакционной смеси;
• тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой или плоской оптически-прозрачной крышкой или пробирки объемом 0,2 мл в стрипах по 8 шт. с прозрачными крышками (при использовании прибора планшетного типа);
• тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой или пробирки для ПЦР объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (при использовании прибора роторного типа);
• одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 200 мкл.

8. Холодильник от плюс 2 °C до плюс 8 °C с морозильной камерой от минус 24 °C до минус 16 °C.

9. Емкость для сброса наконечников <6>.

---

<6> Утилизация отходов проводится в соответствии с СанПиН 3.3686-21; СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденными постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 3 (зарегистрировано Минюстом России 29.01.2021, регистрационный № 62297), с изменением, внесенным постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 26.06.2021 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 07.07.2021, регистрационный № 64146); МР 2.1.0246-21 «Методические рекомендации по обеспечению санитарно-эпидемиологических требований к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий», утвержденными Роспотребнадзором 17.05.2021.

10. Лабораторная одежда: халат, шапочка, одноразовые перчатки.

	Приборы роторного типа			Приборы планшетного типа
Цикл	Температура, °C	Время	Кол-во циклов	Температура, °C	Время	Кол-во циклов
1	95	15 мин	1	95	15 мин	1
2	95	10 с	5	95	10 с	5
	54	20 с		54	25 с
	72	10 с		72	25 с
3	95	10 с	40	95	10 с	40
	54	20 с детекция флуоресцентного сигнала		54	25 с детекция флуоресцентного сигнала
	72	10 с		72	25 с
Примечание: Детекция флуоресцентного сигнала назначается по каналам для флуорофоров в соответствии с используемыми флуоресцентными метками олигонуклеотидных зондов.

Контроль	Контролируемый этап ПЦР-исследования	Значение порогового цикла по каналу для флуорофора
		Канал детекции ВКО	Канал детекции амплификации НА вируса гриппа B линии Виктория	Канал детекции амплификации НА вируса гриппа B линии Ямагата
К-	ПЦР	отсутствует	отсутствует	отсутствует
К+	ПЦР	определено меньше граничного <*>	определено меньше граничного <*>	определено меньше граничного <*>
Примечание: <*> Граничные значения пороговых циклов амплификации указываются во вкладыше и (или) инструкциях к набору (комплекту) реагентов.

Значение порогового цикла по канату для флуорофора			Интерпретация результата
Канат детекции ВКО	Канал детекции амплификации НА вируса гриппа B линии Виктория	Канал детекции амплификации НА вируса гриппа B линии Ямагата
Определено меньше граничного	Отсутствует	Отсутствует	Линии вируса гриппа B не определены*
Определено или отсутствует	Определено	Отсутствует	Определена линия Виктория вируса гриппа B
Определено или отсутствует	Отсутствует	Определено	Определена линия Ямагата вируса гриппа B
Отсутствует или больше граничного	Отсутствует	Отсутствует	Невалидный <**>
Примечание: <*> Линии вируса гриппа B могут не определяться в случае низкого содержания РНК вируса гриппа B в образце. <**> В случае получения невалидного результата необходимо провести повторное ПЦР-исследование соответствующего образца, начиная с этапа амплификации к ДНК.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».

3. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

4. СанПиН 2.1.3684-21 «Санитарно-эпидемиологические требования к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

5. Приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий».

6. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

7. МР 2.1.0246-21 «Методические рекомендации по обеспечению санитарно-эпидемиологических требований к содержанию территорий городских и сельских поселений, к водным объектам, питьевой воде и питьевому водоснабжению, атмосферному воздуху, почвам, жилым помещениям, эксплуатации производственных, общественных помещений, организации и проведению санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».

8. Яцышина С.Б., Рентеева А.Н., Валдохина А.В., Елькина М.А. и др. Генетическая характеристика вирусов гриппа A/H3N2 и B, циркулировавших в России в 2013 — 2015 гг.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 5. С. 60 — 72.

9. Arvia R., Corcioli F., Pierucci F., Azzi A. Molecular markers of influenza B lineages and clades//Viruses. 2014. Vol. 6. № 11 P. 4437-46.

10. Biere B., Bauer B., Schweiger B. Differentiation of influenza B virus lineages Yamagata and Victoria by real-time PCR//Clin.Microbiol. 2010. Vol. 48. № 4. P. 1425-7.

11. Chen J.M., Guo Y.J., Wu K.Y., Guo J.F. et al. Exploration of the emergence of the Victoria lineage of influenza B virus//Arch. Virol. 2007. Vol. 152. № 2. P. 415 — 422.

12. Langat P., Raghwani J., Dudas G., Bowden T.A., Edwards S. et al. Genome-wide evolutionary dynamics of influenza B viruses on a global scale.//PLoS Pathog. 2017. Vol. 13, № 12. P. e1006749.

13. Nakauchi M., Takayama I., Takahashi H., Oba K. et al. Real-time RT-PCR assays for discriminating influenza B virus Yamagata and Victoria lineages//J. Virol. Methods. 2014. Vol. 205. P. 110 — 115.

14. Rota P.A., Wallis T.R., Harmon M.W., Rota J.S. et al. Cocirculation of two distinct evolutionary lineages of influenza type B virus since 1983.//Virology. 1990. Vol. 175. № l.P. 59 — 68.

15. Tewawong N., Chansaenroj J., Klinfueng S., Vichiwattana P. et al. Lineage-specific detection of influenza B virus using real-time polymerase chain reaction with melting curve analysis//N. Arch. Virol. 2016. Vol. 161. № 6. P. 1425 — 1435.

16. Zhang N., Fang S., Wang T., Li J. et al. Applicability of a sensitive duplex realtime PCR assay for identifying B/Yamagata and B/Victoria lineages of influenza virus from clinical specimens//Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. Vol. 93. № 2. P. 797 — 805.

Методические рекомендации разработаны ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора (С.Б. Яцышина, М.А. Елькина, М.В. Мамошина, А.А. Артамонова).

---