МР 4.2.0327-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Молекулярное типирование энтеровирусов. Методические рекомендации
(утв. Роспотребнадзором 06.06.2023)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 6 июня 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МОЛЕКУЛЯРНОЕ ТИПИРОВАНИЕ ЭНТЕРОВИРУСОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 4.2.0327-23
1. Разработаны ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора (Л.Н. Голицына, С.Г. Селиванова, В.В. Зверев, Н.В. Пономарева, Н.А. Новикова).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 6 июня 2023 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) определяют алгоритм проведения молекулярного типирования энтеровирусов способом частичного секвенирования области VP1 генома.
1.2. Молекулярное типирование с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей региона VP1 является прямым методом идентификации серотипа энтеровируса, обладает высокими показателями специфичности.
На основании молекулярно-биологических свойств энтеровирусы разделены на 4 вида, включающие вирусы более 100 серотипов (приложение 1 к настоящим МР): Enterovirus A, Enterovirus B, Enterovirus C, Enterovirus D (приложение 1 к настоящим МР). К виду Enterovirus C относятся полиовирусы 3 типов <1>. Наибольшее количество случаев заболеваний энтеровирусной инфекцией связано с вирусами видов Enterovirus A и Enterovirus B.
<1> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний: www.picornaviridae.com (в свободном доступе).
Тип энтеровируса определяется с использованием молекулярного типирования, которое основано на определении нуклеотидной последовательности области генома, кодирующей капсидный белок VP1. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип вируса.
1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы специалистами научно-исследовательских и медицинских организаций.
II. Показания к исследованию
2.1. Метод молекулярного типирования энтеровирусов применяется при осуществлении эпидемиологического надзора за энтеровирусной инфекцией, в том числе для проведения:
- мониторинга циркуляции энтеровирусов разных типов;
- расследования вспышек энтеровирусной инфекции;
- расследования атипичных, тяжелых и летальных случаев энтеровирусной инфекции.
2.2. Для проведения метода молекулярного типирования энтеровирусов необходимы условия для работы с возбудителями III группы патогенности и материалом, инфицированным или потенциально инфицированным диким полиовирусом <2>.
<2> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. Техника безопасности
3.1. Организация рабочих помещений и техника безопасности при работе с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней, а также с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом, осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <3>, а также методическими документами <4>.
<3> Главы IV, XXXII СанПиН 3.3686-21.
<4> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009 (далее — МУ 1.3.2569-09).
IV. Оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы
4.1. Настоящими МР рекомендуется применять оборудование, расходные материалы, питательные среды, реагенты и реактивы, приведенные в приложении 2.
V. Материал к исследованию
5.1 Для определения типа энтеровируса исследуются:
- нативные и пассированные в культуре ткани пробы клинического материала и объектов окружающей среды, в которых обнаружены энтеровирусы;
- нетипирующиеся ЦПА, выделенные от больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию и из объектов окружающей среды;
- энтеровирусы, выделенные и типированные в реакции нейтрализации в культуре ткани.
5.2. Для проведения молекулярного типирования энтеровирусов используются следующие образцы материала: положительные на присутствие энтеровирусов суспензии фекалий, спинномозговая жидкость, мазки из ротоглотки, носо/ротоглоточные смывы, мокрота, содержимое везикул, секционный материал, концентраты проб воды; культуральная жидкость пассированных образцов (содержащая неполиомиелитные энтеровирусы или нетипируемые ЦПА). В качестве исходного материала могут быть использованы препараты РНК, экстрагированные из перечисленных образцов (в случае, если с момента экстракции прошло не более 24 часов, препарат хранят при температуре плюс 4 °C, замораживание не допускается), или кДНК (допускается хранение препарата кДНК при температуре плюс 4 °C, замораживание не рекомендуется).
5.3. Сбор, обработку, упаковку, хранение и транспортировку материала осуществляют в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <5>, а также методическими документами <6>.
<5> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
<6> МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 23.12.2005.
При проведении молекулярно-генетических исследований используются стерильные наконечники для микропипеток и микропробирки, все операции проводятся в одноразовых перчатках, защитных очках. При работе с исходными образцами и материалом, содержащим нуклеиновые кислоты, применяются наконечники с аэрозольным барьером.
VI. Молекулярное типирование энтеровирусов с использованием секвенирования области VP1 генома
6.1 Порядок проведения исследований.
Определение типа энтеровирусов проводится путем анализа области VP1 генома, включающего:
- выделение РНК;
- постановку реакции обратной транскрипции;
- дифференциальную амплификацию фрагмента кДНК с праймерами, специфичными в отношении видов Enterovirus A и Enterovirus B (приложение 3 к настоящим МР);
- в случае отрицательного результата видоспецифичной амплификации проводят реакцию с праймерами, универсальными для видов Enterovirus A — D;
- очистку фрагмента кДНК;
- мечение фрагмента кДНК;
- очистку меченого фрагмента кДНК;
- определение нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК в автоматическом режиме;
- определение типа энтеровируса методом сравнения полученной последовательности с последовательностями энтеровирусов, представленными в международной базе нуклеотидных последовательностей <7>.
<7> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей — blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (в свободном доступе).
На стадиях выделения РНК, постановки обратной транскрипции и амплификации кДНК рекомендуется введение отрицательного контроля.
6.2 Выделение РНК.
Проводят согласно инструкции по применению комплектов реагентов для выделения РНК.
6.3 Реакция обратной транскрипции.
Реакцию проводят в 20 мкл непосредственно после получения РНК пробы. Реагенты:
- ревертаза (M-MLV-обратная транскриптаза 200 ед./мкл) с 5-кратным ОТ-буфером, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, раствор дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ОТ, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;
- праймеры AN32, AN33, AN34, AN35.
- приготовить смесь праймеров — указанные праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл смешать в отдельной пробирке в равных объемах;
- в промаркированные амплификационные пробирки внести по 1 мкл смеси праймеров AN32 — 35 (конечная концентрация 2 пкмоль/мкл каждого);
- индивидуальными наконечниками с фильтром внести по 10,2 мкл исследуемых проб, кратко центрифугировать;
- инкубировать при 65 °C в течение 1 мин;
- используя только индивидуальные для каждого реагента наконечники, в отдельной пробирке приготовить реакционную смесь для анализа необходимого числа проб (табл. 1), смесь перемешать;
- в пробирки с пробами внести по 8,8 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;
- инкубировать по программе: 42 °C — 30 мин; 95 °C — 5 мин;
- в каждую пробирку внести по 20 мкл ТЕ-буфера, кратко центрифугировать.
Приготовление реакционной смеси для обратной транскрипции
По 5 мкл полученной кДНК перенести в промаркированные пробирки отдельно для каждого способа амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов. Оставшуюся часть кДНК — хранить при температуре плюс 4 °C.
6.4 Амплификация фрагментов кДНК области VP1 генома энтеровирусов.
- Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с «отложенным стартом» 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; ДМСО; деионизованная вода, свободная от РНКаз; или наборы реагентов для постановки ПЦР;
- праймеры: для дифференциальной и универсальной амплификации области VP1 генома энтеровирусов методом двухраундовой ПЦР используют комбинации праймеров (табл. 2).
Комбинации олигонуклеотидных праймеров, используемых на разных этапах амплификации и секвенирования кДНК области VP1 генома энтеровирусов
Амплификацию кДНК с праймерами, специфичными в отношении вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B или универсальными для Enterovirus A — D, проводят отдельно в разных пробирках в 2 раунда.
6.4.1 Первый раунд ПЦР.
Реакцию проводят в 15 мкл смеси. Порядок проведения работы:
- приготовить смесь праймеров для 1-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));
- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 3);
- в амплификационные пробирки, содержащие по 5 мкл кДНК, внести по 10 мкл реакционной смеси, кратко центрифугировать;
- инкубировать в амплификаторе по программе для 1-го раунда ПЦР области VP1 генома:
[95 °C — 1 мин (95 °C — 20 сек; 42 °C — 20 сек; 60 °C — 20 сек) x 40 циклов, 60 °C — 5 мин] <8>.
<8> Примечание: не допускается электрофоретическая детекция продукта первого раунда ПЦР перед постановкой второго раунда.
Приготовление реакционной смеси для 1 раунда ПЦР
6.4.2 Второй раунд ПЦР.
Реакцию проводят в 30 мкл смеси. Порядок проведения работы:
- приготовить смесь праймеров для 2-го раунда ПЦР (в отдельных пробирках смешать необходимые праймеры с концентрацией 20 пкмоль/мкл в равных объемах (табл. 3));
- отдельно для каждого способа амплификации приготовить необходимое количество реакционной смеси (табл. 4);
- в промаркированные амплификационные пробирки, содержащие по 25 мкл реакционной смеси, внести по 5 мкл амплификата 1 раунда ПЦР, кратко центрифугировать;
- инкубировать в амплификаторе по программе для 2-го раунда ПЦР области VP1 генома:
[95 °C — 15 мин (95 °C — 10 сек; 60 °C — 10 сек; 72 °C — 10 сек) x 42 цикла, 72 °C — 5 мин].
Приготовление реакционной смеси для 2-го раунда ПЦР
| Реагенты | Объем реакционной смеси в пересчете на количество пробирок (мкл) | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| ПЦР-буфер | 6,0 | 12,0 | 18,0 | 24,0 | 30,0 | 36,0 | 42,0 | 48,0 | 54,0 | 60,0 |
| дНТФ | 1,8 | 3,6 | 5,4 | 7,2 | 9,0 | 10,8 | 12,6 | 14,4 | 16,2 | 18,0 |
| Смесь праймеров | 0,4 | 0,8 | 1,2 | 1,6 | 2,0 | 2,4 | 2,8 | 3,2 | 3,6 | 4,0 |
| Taq полимераза <*> | 0,2 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 1,0 | 1,2 | 1,4 | 1,6 | 1,8 | 1,0 |
| ДМСО | 0,6 | 1,2 | 1,8 | 2,4 | 3,0 | 3,6 | 4,2 | 4,8 | 5,4 | 6,0 |
| Вода | 16,0 | 32,0 | 48,0 | 64,0 | 80,0 | 96,0 | 112,0 | 88,0 | 144,0 | 160,0 |
| Примечание: <*> для 2-го раунда используют химически модифицированную Taq ДНК-полимеразу для ПЦР с «отложенным стартом». | ||||||||||
В результате ПЦР области VP1 генома синтезируют продукт размером 375 п.н., который визуализируют методом электрофореза в 1,5%-м агарозном геле. При постановке проверочного электрофореза в лунку наносят 5 мкл амплификата. Электрофорез проводится при напряжении 150 В в течение 15 — 20 мин.
6.5 Очистка полученных фрагментов ДНК для секвенирования.
Для очистки используют весь оставшийся объем амплификата (25 мкл). Очистку проводят из амплификата (если отсутствуют фрагменты ДНК неспецифичного размера) или агарозного геля (если в результате электрофореза наряду со специфичным продуктом визуализируются фрагменты ДНК неспецифичного размера) с использованием соответствующих наборов выделения ДНК для молекулярно-генетических исследований. Концентрацию очищенной ДНК определяют методом электрофореза относительно концентрационного стандарта или на спектрофотометре при длине волны 280 нм.
6.6 Секвенирование кДНК энтеровирусов в автоматическом режиме.
Набор реагентов для мечения ДНК выбирают в зависимости от модели используемого секвенатора, реакцию проводят согласно инструкции по применению. В случае использования капиллярных секвенаторов мечение фрагментов кДНК энтеровирусов проводят с использованием праймеров AN232 и AN233 или AN233m в соответствии со способом амплификации (табл. 2).
Очистку меченой ДНК и секвенирование в автоматическом режиме осуществляют в соответствии с протоколом производителя.
Меченые и очищенные фрагменты ДНК секвенируют в автоматическом режиме.
В случае использования капиллярных секвенаторов устанавливают нуклеотидные последовательности двух цепей фрагментов кДНК. При успешном секвенировании хроматограмма не имеет посторонних сигналов и читается до позиции, соответствующей длине анализируемого фрагмента ДНК (пики примерно одинаковой высоты). Для обеспечения достоверности филогенетического анализа каждый нуклеотид прочитывают по одному разу в каждом из направлений.
Установленную нуклеотидную последовательность идентифицируют методом сравнения с имеющимися в международной базе нуклеотидными последовательностями энтеровирусов с использованием программного обеспечения <9>. Принадлежность нуклеотидной последовательности фрагмента кДНК области VP1 генома энтеровируса того или иного типа определяют на основании уровня гомологии со сравниваемой последовательностью типового референтного штамма не менее 75,0%.
<9> Официальный сайт идентификации нуклеотидных и белковых последовательностей blast.ncbi.nlm.nih.gov (в свободном доступе). Примечание: допускается использование аналогичных или с лучшими характеристиками программных средств для сравнения установленной нуклеотидной последовательности.
6.7. Результаты молекулярного типирования энтеровирусов загружаются в федеральную государственную информационную систему сведений санитарно-эпидемиологического характера (ФГИС СЭХ) <10>.
<10> Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 № 2178 «Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера».
6.8 Интерпретация результатов.
Типирование энтеровирусов с использованием амплификации и секвенирования нуклеотидных последовательностей VP1 региона является прямым методом и характеризуется высокой специфичностью. Установленный с использованием данного метода тип вируса соответствует типу, определяемому в реакции нейтрализации с использованием набора гипериммунных сывороток. Если гомология установленной последовательности ни с одной из представленных последовательностей энтеровирусов известных типов не превышает 75,0%, то предполагают выявление энтеровируса нового типа. Образцы, содержащие изоляты, соответствующие данным критериям, направляются для дальнейшего изучения в референс-центр по мониторингу за энтеровирусными инфекциями ФБУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора <11>, а также могут быть направлены в подведомственные организации Роспотребнадзора <12>.
<11> Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
<12> Дальневосточный региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ХНИИЭМ Роспотребнадзора; Урало-Сибирский региональный научно-методический центр по изучению энтеровирусных инфекций ФБУН ФНИИВИ «Виром» Роспотребнадзора.
6.9 Эффективность метода.
Данный алгоритм молекулярного типирования энтеровирусов был испытан на панели, содержащей 100 энтеровирус-положительных образцов. Тип энтеровируса установлен в 96% случаев. Включение в алгоритм исследований способа дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома вирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B, в дополнение к способу универсальной амплификации генома энтеровирус видов Enterovirus A — D, повышает эффективность молекулярного типирования на 46,97%.
ТАКСОНОМИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ ВИДОВ ENTEROVIRUS A — D <13>
<13> Официальный сайт группы изучения пикорнавирусов Института профилактики и контроля вирусных заболеваний www.picornaviridae.com (в свободном доступе).
ОБОРУДОВАНИЕ, РАСХОДНЫЕ МАТЕРИАЛЫ, ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, РЕАГЕНТЫ И РЕАКТИВЫ <14>
<14> Примечание: допускается применение оборудования, расходных материалов, питательных сред, реагентов и реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.
1. Материально-техническое обеспечение:
- стандартное оборудование для ПЦР-лаборатории <15> (дополнительно для постановки 2-го раунда ПЦР отдельный ПЦР-бокс и набор автоматических дозаторов);
- стандартное оборудование для секвенирования ДНК <10> (перечень оборудования, необходимого для проведения секвенирования продуктов амплификации, определяется в соответствии с инструкциями по эксплуатации производителей автоматических секвенаторов (например, капиллярные секвенаторы, приборы для нанопорового секвенирования));
- компьютер с выходом в информационно-коммуникационную сеть Интернет.
<15> МУ 1.3.2569-09.
2. Реагенты и тест-системы, зарегистрированные на территории Российской Федерации <16>:
- для выделения РНК: наборы реагентов для выделения РНК;
- для постановки обратной транскрипции: ревертаза (M-MLV обратная транскриптаза 200 ед./мкл), 5-кратный ОТ-буфер, готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ, ингибитор РНКаз 20 ед./мкл, ТЕ-буфер; или комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК;
- для постановки ПЦР: Taq ДНК-полимераза 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; химически модифицированная Taq ДНК-полимераза для постановки ПЦР с «отложенным стартом» 5 ед./мкл в комплекте с 5-кратным ПЦР-буфером, содержащим 15 мМ MgCl2; готовая смесь дНТФ с концентрацией 2,5 мМ для ПЦР; деионизованная вода, свободная от РНКаз; диметилсульфоксид (далее — ДМСО); или комплект реагентов для постановки ПЦР;
- маркер длины фрагментов ДНК в диапазоне 100 — 1000 п.н.;
- олигонуклеотидные праймеры (рабочая концентрация праймеров амплификации в агарозном геле);
- наборы реагентов для очистки ДНК, предназначенные для выделения ДНК из агарозного геля или из реакционных смесей;
- реагенты для мечения очищенной кДНК (приобретаются в зависимости от модели используемого секвенатора).
<16> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий»; приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий» (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2012, регистрационный № 24852).
ПРАЙМЕРЫ, РЕКОМЕНДУЕМЫЕ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ЭНТЕРОВИРУСОВ
| Обозначение праймера | Последовательность 5' — 3' | Назначение |
| AN32 | GTYTGCCA | Синтез кДНК области VP1 генома [[2]](#p100436) |
| AN33 | GAYTGCCA | |
| AN34 | CCRTCRTA | |
| AN35 | RCTYTGCCA | |
| 486 | TGGTAICARACIAAITWYGTIGTNC | 1 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [2, 3] |
| 488 | GTIGGRTAICCITCITARAACCAYTG | |
| 490 | TGIGTIYTITGYRTICCITGGAT | |
| 492 | GGRTTIGTIGWYTGCCA | |
| 224 | GCIATGYTIGGIACICAYRT | |
| 222 | CICCIGGIGGIAYRWACAT | |
| EvAR | TACTGGACCNCCNGGNGGNRCRWACATRTA | 2 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [[1]](#p100435) |
| EvBR | TACTGGACCNCCNGGNGGNAYRTACATNA | |
| AN89 | CCAGCACTGACAGCAGYNGARAYNGG | 2 раунд амплификации фрагмента кДНК области VP1 генома [[2]](#p100436) |
| AN88 | TACTTGACCACCTGGNGGNAYRWACAT | |
| 232 | CCAGCACTGACAGCA | Секвенирование фрагмента кДНК области VP1 генома [[2]](#p100436) |
| 233 | TACTGGACCACCTGG | |
| 233m | TACTGGACCGCCGGG |
Нормативные и методические документы
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».
3. Постановление Правительства Российской Федерации от 02.12.2021 № 2178 «Об утверждении Положения о федеральной государственной информационной системе сведений санитарно-эпидемиологического характера».
4. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
5. Приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий».
6. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
7. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
8. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биологических материалов в микробиологическую лабораторию».
9. МУ 3.1.1.2363-08 «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции».
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Патент № 2743352 Российская Федерация. Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B: № 2020117726: заявл. 19.05.2020: опубл. 17.02.2021 / Голицына Л.Н.; правообладатель ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора // Бюллетень ФИПС «Изобретения. Полезные модели». 2021. № 5. 17.02.2021.
2. Nix W.A., Oberste M.S., Pallansch M.A. Sensitive, seminested PCR amplification of VP1 sequences for direct identification of all enterovirus serotypes from original clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 2006. Vol. 44. P. 2698 — 2704.
3. Oberste M.S., Maher K., Williams A.J., Dybdahl-Sissoko N., Brown B.A., Gookin M.S., Pe\tilde{n}aranda S., Mishrik N., Uddin M., Pallansch M.A. Species-specific RT-PCR amplification of human enteroviruses: a tool for rapid species identification of uncharacterized enteroviruses // J. Gen. Virol. 2006. Vol. 87 (Pt 1). P. 119 — 128.