МР 4.2.0265-21. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы идентификации и количественного определения ГМ-сои GMB151 И ГМ-рапса DP-073496-4. Методические рекомендации
(утв. Роспотребнадзором 01.11.2021)
Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
А. Ю. Попова
1 ноября 2021 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ГМ-СОИ GMB151 И ГМ-РАПСА DP-073496-4
МР 4.2.0265-21
1. Разработаны ФБУН «Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека» (Г.Ф. Мухаммадиева, А.Б. Бакиров, Д.О. Каримов, Э.Р. Кудояров, Л.Ш. Назарова, Т.Г. Якупова, Я.В. Валова, М.М. Зиатдинова, Д.Д. Каримов, Э.Ф. Репина, Г.В. Тимашева, Н.Ю. Хуснутдинова, Д.А. Смолянкин, С.С. Байгильдин).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российский Федерации А.Ю. Поповой 1 ноября 2021 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. В условиях роста использования генно-инженерно-модифицированных организмов (далее — ГМО) растительного происхождения, увеличения сложности генетических конструкций, вовлечения новых генов и регуляторных элементов сохраняется необходимость совершенствования методов их идентификации. Контроль и мониторинг продукции, содержащей ГМО, обеспечивает биобезопасность Российской Федерации, предупреждая проникновение и расселение ГМО на территории Российской Федерации.
1.2. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) содержат описание методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК, характерной для уникальных трансформационных событий генно-инженерно-модифицированной сои (далее — ГМ-сои) GMB151 и генно-инженерно-модифицированного рапса (далее — ГМ-рапса) DP-073496-4 (ГМ-специфичной ДНК).
Данные методы, основанные на полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (далее — ПЦР-РВ) по технологии TaqMan <1>, могут быть использованы для контроля за ГМО в пищевых продуктах, а также в сырье (семена, зерна и другой материал растительного происхождения).
<1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченного флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.
1.3. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО основаны на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
1.4. МР могут применяться при контроле растительного сырья и пищевых продуктов на наличие ГМО на этапах гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза и реализации в Российской Федерации.
1.5. МР предназначены для органов и организаций Роспотребнадзора, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
II. Сущность метода
2.1. Метод выявления компонентов ГМО, не зарегистрированных в Российской Федерации, основан на использовании ПЦР-РВ. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО базируется на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.
2.2. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:
- одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);
- другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).
2.3. Для построения калибровочных кривых могут быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее — ССО <2>) с известным содержанием ДНК. Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) — по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.
<2> Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM) [ec.europa.eu/jrc/en/reference-materials/catalogue], ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (American Oil Chemists Society; AOCS) [www.aocs.org/crm] или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.
III. Оборудование и материалы
3.1 Испытательное и вспомогательное оборудование:
- амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени с программным обеспечением;
- дозаторы механические с переменным объемом дозирования;
- центрифуга настольная со скоростью вращения не менее 11000g со сменными роторами для пробирок на 1,5 и на 0,5 мл по ГОСТ IEC 61010-2-020 [3];
- аппарат для встряхивания типа «Вортекс» или микроцентрифуга «Вортекс» (максимальное ускорение 450g) по ТУ 64-1-1081;
- ламинарный бокс или бокс для ПЦР со встроенной системой УФ-облучения;
- холодильник с отделениями на плюс 2 — плюс 8 °C и на минус 24 — минус 16 °C по ГОСТ 26678 [1];
- термостат твердотельный для пробирок полипропиленовых с крышкой объемом 0,5 мл и 1,5 мл, диапазон температур — от комнатной до плюс 99 °C;
- весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ Р 53228 [2].
Примечание. Допускается использование испытательного и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.
3.2 Расходные материалы:
- пробирки полипропиленовые с крышкой вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 мл;
- наконечники одноразовые с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 100; 200 и 1000 мкл.
Примечание. Допускается использование расходных материалов с характеристиками не хуже указанных.
3.3 Реактивы:
- реакционная смесь для ПЦР согласно протоколу JRC для количественного определения соответствующего трансформационного события;
- вода деионизованная;
- специфичные праймеры и ДНК-зонды, перечисленные в табл. 2, 6, 10.
Методика может быть реализована с помощью готовых наборов реактивов.
Примечание. Допускается применение других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.
IV. Метод идентификации и количественного определения ГМ-сои линии GMB151
4.1. Метод идентификации и количественного определения сои линии GMR151 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного GMB151, расположенная на границе геномной ДНК сои и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для сои целевая последовательность — ген leI, кодирующий лектин.
4.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 0,03% в 200 нг ДНК сои; предел количественного определения метода составляет не менее 0,08% в 200 нг ДНК сои.
4.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых, протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 1 - 4. Для приготовления раствора 1 (табл. 1) может быть использован сертифицированный стандартный образец, содержащий 10% сои линии GMB151 (кат. № ERM-BF443e) (исходя из расчета, что масса 265487 копий молекул ДНК гаплоидного генома сои равна 1,13 пкг [7]). Для количественного определения трансформационного события GMB151 используется реакционная смесь (табл. 3) согласно протоколу Joint Research Centre (Объединенный Научный Центр Европейского Союза, далее — JRC) [6].
Примечание. Допускается применение других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК, GMB151 | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер PRIM1040 (10 мкМ) | 400 нМ | 1,0 |
| Праймер PRIM1041 (10 мкМ) | 400 нМ | 1,0 |
| Зонд M1789 (10 мкМ) | 200 нМ | 0,5 |
| Вода деионизированная | - | 5,0 |
| Образец ДНК | - | 5,0 |
| Итого: | 25 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК, leI | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 12,5 |
| Праймер KVM164 (10 мкМ) | 200 нМ | 0,5 |
| Праймер KVM165 (10 мкМ) | 200 нМ | 0,5 |
| Зонд TM1242 (10 мкМ) | 200 нМ | 0,5 |
| Вода деионизированная | - | 6,0 |
| Образец ДНК | - | 5,0 |
| Итого: | 25 мкл | |
<*> Реакционная смесь, содержащая урацил-ДНК-гликозилазу, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события GMB151 [6]. Допускается применение других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.
Температурно-временной режим амплификации <*>
<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события GMB151, температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя, реакционной смеси.
| Стадия | Температура | Время (с) | Детекция | Циклы |
| Активация урацил-ДНК-гликозилазы | 50 | 120 | нет | 1 |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 40 |
| 60 | 60 | да |
4.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
4.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события GMB151 и референсного гена сои leI (табл. 3).
4.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями хорошо перемешивают на аппарате для встряхивания типа «Вортекс» и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
4.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события GMB151 и одну для референсного гена сои leI).
4.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 70 мкл реакционной смеси или реакционных смесей для трансформационного события GMB151 и для референсного гена сои leI в подготовленные пробирки. Добавляют по 17,5 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Перемешивают каждую пробирку на аппарате для встряхивания типа «Вортекс» около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
4.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 25 мкл в пробирки.
4.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.
4.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал FAM (или аналогичный канал для указанного флуорофора в зависимости от используемого прибора) для детекции амплификации трансформационного события GMB151 и канал JOE (или аналогичный канал для указанного флуорофора в зависимости от используемого прибора) для детекции амплификации референсного гена leI и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 4).
4.1.11. Помещают пробирки с аликвотами в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.
V. Метод идентификации и количественного определения ГМ-рапса линии DP-073496-4
5.1. Метод идентификации и количественного определения рапса линии DP-073496-4 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:
- область ДНК, специфичная для трансформационного события DP-073496-4, расположенная на границе геномной ДНК рапса и генно-инженерной генетической конструкции;
- таксон-специфичная для рапса масличного целевая последовательность — ген ацил-ACP-тиоэстеразы (FatA(A)), присутствующий в геноме A, видов рода Brassica (B, napus, B. rapa, B. juncea).
5.1.1. Предел обнаружения метода составляет не менее 0,04% в 100 нг ДНК рапса; предел количественного определения метода составляет не менее 0,08% в 100 нг ДНК рапса.
5.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (масса 1 генома рапса равна 1,15 пкг [4]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 5 - 8. Растворы 1 - 5 (табл. 5) могут быть получены путем смешивания определенного количества ДНК 100% ГМ-рапса линии DP-073496-4 (кат. № ERM-BF434b) с ДНК его традиционного аналога (кат. № ERM-BF434a). Для количественного определения трансформационного события DP-073496-4 используется реакционная смесь (табл. 7) согласно протоколу JRC [5].
Примечание. Допускается применение других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.
DP-073496-4 в растворах ДНК, используемых
для построения калибровочной кривой
| Компонент | Конечная концентрация | Объем, мкл/реакция |
| ГМ-специфичная ДНК, DP-073496-4 | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 10,0 |
| Праймер 09-0-2824 forward primer (10 мкМ) | 600 нМ | 1,2 |
| Праймер 09-0-2825 reverse primer (10 мкМ) | 600 нМ | 1,2 |
| Зонд 09-QP-83 probe (10 мкМ) | 250 нМ | 0,5 |
| Вода деионизированная | - | 2,1 |
| Образец ДНК (100 нг) | - | 5,0 |
| Итого: | 20 мкл | |
| Таксон-специфичная ДНК, FatA(A) | ||
| Реакционная смесь <*> | 1x | 10,0 |
| Праймер 09-0-3249 forward primer (10 мкМ) | 300 нМ | 0,6 |
| Праймер 09-0-3251 reverse primer (10 мкМ) | 900 нМ | 1,8 |
| Зонд 09-QP-87 probe (10 мкМ) | 150 нМ | 0,3 |
| Вода деионизированная | - | 2,3 |
| Образец ДНК (100 нг) | - | 5,0 |
| Итого: | 20 мкл | |
<*> Реакционная смесь, не содержащая урацил-ДНК-гликозилазу, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события DP-073496-4 [5]. Допускается применение других реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных.
Температурно-временной режим амплификации <*>
<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события DP-073496-4. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.
| Стадия | Температура | Время (с) | Детекция | Циклы |
| Предварительная денатурация | 95 | 600 | нет | 1 |
| Амплификация | 95 | 15 | нет | 40 |
| 60 | 60 | да |
5.1.3. Для проведения ПЦР реагенты размораживают, перемешивают и центрифугируют. Размороженные реагенты хранят на льду.
5.1.4. В две пробирки добавляют компоненты в указанном ниже порядке (за исключением образцов ДНК), чтобы приготовить реакционные смеси для выявления трансформационного события DP-073496-4 и референсного гена рапса FatA(A) (табл. 7).
5.1.5. Содержимое пробирок с реакционными смесями хорошо перемешивают на аппарате для встряхивания типа «Вортекс» и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования.
5.1.6. Для каждого анализируемого образца ДНК (стандартные образцы, исследуемые образцы и контрольные образцы) готовят две реакционные пробирки по 0,5 мл (одну для трансформационного события DP-073496-4 и одну для референсного гена рапса FatA(A)).
5.1.7. Для каждого образца ДНК добавляют по 52,5 мкл реакционной смеси или реакционных смесей для трансформационного события DP-073496-4 и для референсного гена рапса FatA(A) в подготовленные пробирки. Добавляют по 17,5 мкл образца ДНК в каждую из двух пробирок. Перемешивают каждую пробирку на аппарате для встряхивания типа «Вортекс» около 10 секунд. Пробирки кратковременно центрифугируют.
5.1.8. Каждый из приготовленных объемов реакционных смесей с ДНК делят на аликвоты по 20 мкл в пробирки.
5.1.9 Закрывают пробирки крышкой и кратковременно центрифугируют.
5.1.10. В соответствии с инструкцией производителя выбирают канал FAM (или аналогичный канал для указанного флуорофора в зависимости от используемого прибора) для детекции амплификации трансформационного события DP-073496-4 и референсного гена рапса FatA(A) и устанавливают температурно-временной режим амплификации (табл. 8).
5.1.11. Помещают пробирки с аликвотами в амплификатор нуклеиновых кислот в режиме реального времени и запускают термоциклирование.
VI. Интерпретация результатов определения трансформационного события GMB151
6.1. Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по каждому каналу детекции (FAM, JOE) для каждой реакции с использованием программного обеспечения прибора.
6.2. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct для каждой реакции.
6.3. Калибровочная кривая представляет собой линию линейной регрессии зависимости пороговых циклов Ct калибровочных точек от значений логарифма количества копий генома сои в растворах 1, 2, 3, 4 и 5 (табл. 1), которая может быть построена с помощью электронных таблиц или непосредственно в программном обеспечении прибора. По полученным калибровочным кривым путем линейной интерполяции рассчитывается количество копий ГМ-специфичной ДНК и таксон-специфичной ДНК в анализируемых пробах.
6.4. Содержание трансформационного события GMB151 в пробе представляет собой отношение количества копий ГМ-специфичной ДНК к количеству копий таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:
\text{ГМО},\% = \frac{(\text{Количество ГМ} - \text{специфичной ДНК})}{(\text{Количество таксон} - \text{специфичной ДНК})} \times 100.
VII. Интерпретация результатов определения трансформационного события DP-073496-4
7.1. Перед началом количественного анализа результатов по каналу FAM для каждой реакции определяется значение порогового цикла Ct. Затем для каждой реакции рассчитывается значение \Delta Ct , равное величине абсолютной разницы между двумя значениями пороговых циклов, определенных для каждого калибровочного раствора из табл. 5 в двух параллельных реакциях амплификации ГМ- и таксон-специфичной ДНК рапса соответственно.
7.2. Для построения калибровочной кривой используются точки на координатной плоскости, образованные значениями \Delta Ct и десятичного логарифма процентного содержания ГМ-специфичной ДНК. Значения десятичного логарифма процентного содержания ГМ-специфичной ДНК в калибровочных растворах откладываются по оси абсцисс (x), а соответствующие им значения \Delta Ct по оси ординат (y). К построенной калибровочной кривой рассчитывается уравнение линейной регрессии (y = ax + b, где a — коэффициент наклона, b — коэффициент сдвига) и строится линия линейной регрессии, по которым определяют процентное содержание ГМ-специфичной ДНК в анализируемых пробах путем линейной интерполяции и последующего потенцирования.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. ГОСТ 26678 «Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия».
2. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».
3. ГОСТ IEC 61010-2-020 «Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам».
4. Arumuganathan K., Earle E.D., 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9: 208 — 218.
5. Event-specific Method for the Quantification of Oilseed Rape DP-073496-4 Using Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-12VP-EFSA-Corr1.pdf.
6. Event-specific Method for the Quantification of Soybean GMB151 Using Real-time PCR. URL: https://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-01-18-VM.pdf.
7. Plant DNA C-values Database. Royal Botanic Gardens, Kew. URL: http://data.kew.org/cvalues/.