МР 4.2.0163-20. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Методы идентификации и количественного определения ГМ-кукурузы MON87403, DP4114, MON87411 и ГМ-сои MON87751. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 03.02.2020)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

1. Разработаны ФБУН «Уфимский научно-исследовательский институт медицины труда и экологии человека» (Г.Ф. Мухаммадиева, Д.О. Каримов, Э.Р. Кудояров, Т.Г. Кутлина, Я.В. Валова, М.М. Зиатдинова, Д.Д. Каримов).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 февраля 2020 г.

I. Общие положения и область применения

1.1. Значительное увеличение производства и импорта трансгенной продукции, увеличение вероятности поступления пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников или содержащей их компоненты, на внутренний рынок Российской Федерации определяет необходимость разработки методики выявления компонентов генно-инженерно-модифицированных организмов (далее — ГМО), не зарегистрированных в Российской Федерации. Контроль и мониторинг продукции, содержащей ГМО, обеспечивает биобезопасность Российской Федерации, предупреждая проникновение и расселение ГМО на территории Российской Федерации.

Существует множество разработанных в разных лабораториях мира стратегий скрининга и идентификации ГМО. Современной тенденцией является создание систем, способных осуществлять скрининг максимального количества известных в настоящее время ГМО в процессе одного исследования. Другой современной тенденцией является комбинирование таких систем с базами данных, что позволяет существенно увеличить эффективность скрининга [5, 10 - 12].

1.2. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) содержат описание методов идентификации и количественного определения событие-специфичной рекомбинантной ДНК (ГМ-специфичной ДНК), характерной для уникальных трансформационных событий генетически модифицированной кукурузы (далее — ГМ кукурузы) MON87403, DP4114, MON87411 и генетически модифицированной сои (далее — ГМ сои) MON87751, не зарегистрированных в Российской Федерации.

<1> Основана на использовании Taq-полимеразы, обладающей 5'-экзонуклеазной активностью, и флуоресцентного TaqMan-зонда, меченного флуорофором (5'-конец) и гасителем флуоресценции (3'-конец). В интактном зонде флуоресценция, испускаемая флуорофором, поглощается расположенным рядом гасителем. На этапе отжига праймеров зонд гибридизуется с ампликоном и разрушается во время элонгации благодаря 5'-экзонуклеазной активности полимеразы, при этом испускаемая флуорофором энергия уже не поглощается гасителем. Накопление сигнала флуоресценции регистрируется по мере накопления продуктов ПЦР.

1.3. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО основаны на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.

1.4. МР могут применяться при контроле растительного сырья и пищевых продуктов на наличие ГМО на этапах гигиенической экспертизы, государственной регистрации, закупки, ввоза и реализации в Российской Федерации.

1.5. МР предназначены для лабораторий организаций Роспотребнадзора, осуществляющих контроль за качеством и безопасностью продовольственного сырья и пищевых продуктов, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке.

II. Сущность метода

2.1. Метод выявления компонентов ГМО, не зарегистрированных в Российской Федерации, основан на использовании ПЦР-РВ. Интерпретация результатов ПЦР-РВ и расчет содержания ГМО базируется на применении относительного анализа по двум калибровочным кривым.

2.2. Идентификация и количественное определение ГМО методом относительного анализа по двум калибровочным кривым включает использование двух независимых систем ПЦР-РВ (реакций, проводимых в отдельных пробирках), каждая из которых имеет специфичные ДНК-праймеры и флуоресцентно-меченые зонды:

• одна ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего трансформационного события (ГМ-специфичная ДНК);
• другая ПЦР-система выявляет последовательность области ДНК, специфичной для соответствующего вида растения (таксон-специфичная ДНК).

2.3. Для построения калибровочных кривых могут быть использованы соответствующие сертифицированные стандартные образцы (далее — ССО <2>) с известным содержанием ДНК. Построение первой калибровочной кривой (для ГМ-специфичной ДНК) выполняется по результатам ГМ-специфичной ПЦР-РВ, а второй (для таксон-специфичной ДНК) — по результатам таксон-специфичной ПЦР-РВ.

<2> Могут использоваться ССО Института контрольных материалов и измерений (Institute for Reference Materials and Measurements (JRC-IRMM) [ec.europa.eu/jrc/en/reference-materials/catalogue], ССО Американского общества химиков масложировой промышленности (American Oil Chemists Society; AOCS) [www.aocs.org/crm] или эквивалентные образцы, применение которых приводит к тем же результатам.

III. Оборудование и материалы

3.1. Испытательное и вспомогательное оборудование

Примечание. Допускается использование испытательного и вспомогательного оборудования с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.

3.2. Расходные материалы

Примечание. Допускается использование расходных материалов с характеристиками не хуже указанных.

3.3. Реактивы

Методика может быть реализована с помощью готовых наборов реактивов.

Примечание. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

IV. Методы идентификации и количественного определения линий ГМ кукурузы (MON87403, DP4114, MON87411)

4.1. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON87403 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

• область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87403, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной конструкции;
• таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген hmg, кодирующий синтез группы ядерных белков с высокой подвижностью (high mobility group, HMG).

4.1.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 200 нг ДНК кукурузы.

4.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг [1]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 1 - 4. Для приготовления раствора 1 (табл. 1) может быть использован 100% ССО, кат. № AOCS 0216-A. Для количественного определения трансформационного события MON87403 используется реакционная смесь (табл. 3) согласно протоколу Joint Research Centre (Объединенный исследовательский центр Европейского союза, далее — JRC) [7]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 1

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87403. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87403. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

4.2. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии DP4114 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

• область ДНК, специфичная для трансформационного события DP4114, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;
• таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген hmg.

4.2.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,01% в 300 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,09% в 300 нг ДНК кукурузы.

4.2.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг [4]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 5 - 8. Для приготовления раствора 1 (табл. 5) может быть использован 10% ССО, кат. № ERM-BF439e. Для количественного определения трансформационного события DP4114 используется реакционная смесь (табл. 7) согласно протоколу JRC [6]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 5

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события DP4114. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события DP4114. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

4.3. Метод идентификации и количественного определения кукурузы линии MON87411 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

• область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87411, расположенная на границе геномной ДНК кукурузы и генно-инженерной генетической конструкции;
• таксон-специфичная для кукурузы целевая последовательность — ген hmg.

4.3.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК кукурузы; предел количественного определения метода составляет не менее 0,085% в 200 нг ДНК кукурузы.

4.3.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома кукурузы, равной 2,73 пкг [4]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 9 - 12. Для приготовления раствора 1 (табл. 9) может быть использован 100% ССО, кат. № AOCS 0215-B. Для количественного определения трансформационного события MON87411 используется реакционная смесь (табл. 11) согласно протоколу JRC [8]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 9

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87411. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87411. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

V. Метод идентификации и количественного определения ГМ сои линии MON87751

5.1. Метод идентификации и количественного определения сои линии MON87751 основан на ПЦР-РВ. Мишенями для анализа являются:

• область ДНК, специфичная для трансформационного события MON87751, расположенная на границе геномной ДНК сои и генно-инженерной генетической конструкции;
• таксон-специфичная для сои целевая последовательность — ген le1, кодирующий лектин.

5.1.1. Предел обнаружения метода составляет как минимум 0,04% в 200 нг ДНК сои; предел количественного определения метода составляет не менее 0,09% в 200 нг ДНК сои.

5.1.2. Схема разведений и концентрации растворов для построения калибровочных кривых (из расчета массы генома сои, равной 1,13 пкг [4]), протокол состава праймеров и зондов, состав реакционных смесей и режим амплификации представлены в табл. 13 - 16. Для приготовления раствора 1 (табл. 13) может быть использован 100% ССО, кат. № AOCS 0215-A. Для количественного определения трансформационного события MON87751 используется реакционная смесь (табл. 15) согласно протоколу JRC [9]. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

Таблица 13

<*> Реакционная смесь, согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87751. Допускается применение других реактивов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже указанных.

<*> Согласно протоколу JRC для количественного определения трансформационного события MON87751. Температурно-временной режим должен быть скорректирован с учетом рекомендаций производителя реакционной смеси.

VI. Интерпретация результатов

6.1. Полученные в ходе испытания данные (кривые накопления флуоресцентного сигнала) анализируют по одному каналу детекции с использованием программного обеспечения прибора.

6.2. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов, что соответствует значению порогового цикла Ct для каждой реакции.

6.3. Калибровочными точками являются значения пороговых циклов Ct, которым соответствуют логарифмы количества копий ДНК растворов, приготовленных из ССО. Калибровочная кривая строится по калибровочным точкам, что может быть сделано с помощью электронных таблиц или непосредственно в программном обеспечении прибора. По полученным калибровочным кривым путем линейной интерполяции рассчитывается количество копий ГМ-специфичной ДНК и таксон-специфичной ДНК в анализируемых пробах.

6.4. Содержание ГМО в пробе представляет собой отношение количества копий ГМ-специфичной ДНК к количеству копий таксон-специфичной ДНК, выраженное в процентах. Расчет производят по формуле:

\text{ГМО},\% = \frac{\text{Количество ГМ } - \text{специфичной ДНК}}{\text{Количество таксон} - \text{специфичной ДНК}} \times 100

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. ГОСТ 26678 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия.

2. ГОСТ Р 53228 Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.

3. ГОСТ IEC 61010-2-020 Безопасность электрических контрольно-измерительных приборов и лабораторного оборудования. Часть 2-020. Частные требования к лабораторным центрифугам.

4. Arumuganathan K., Earle E.D., 1991. Nuclear DNA content of some important plant species. Plant Molecular Biology Reporter, 9: 208 — 218.

5. Barbau-Piednoir, E. Inter-laboratory Testing of GMO Detection by Combinatory SYBR Green PCR Screening (CoSYPS)/E. Barbau-Piednoir, P. Stragier, N. Roosens, M. Mazzara, C. Savini, G. Van den Eede, M. Van den Bulcke//Food Analytical Methods. 2014. Vol. 7, no. 8. P. 1719 — 1728.

6. Event-specific Method for the Quantification of maize DP - O/O/4114 - 3 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-14-VP.pdf.

7. Event-specific Method for the Quantification of maize MON87403 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-02-15-VM.pdf.

8. Event-specific Method for the Quantification of maize MON87411 by Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-01-15-VP.pdf.

9. Event-specific Method for the Quantification of Soybean MON87751 Using Real-time PCR. URL: http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/summaries/EURL-VL-03-14-VP-Corrected-Version-1.pdf.

10. Scholtens, I. Practical experiences with an extended screening strategy for genetically modified organisms (GMOs) in real-life samples/I. Scholtens, E. Laurensse, B. Molenaar, Zaaijer S., H. Gaballo, P. Boleij, E. Kok//Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013. Vol. 61, no. 38. P. 9097 — 9109.

11. Van den Bulcke, M. A theoretical introduction to «Combinatory SYBR Green qPCR Screening», a matrix-based approach for the detection of materials derived from genetically modified plants/M. Van den Bulcke, A. Lievens, E. Barbau-Piednoir, G. MbongoloMbella, N. Roosens, M. Sneyers, A.L. Casi//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010. Vol. 396, no. 6. P. 2113 — 2123.

12. Waiblinger, H.-U. A practical approach to screen for authorised and unauthorised genetically modified plants/H.-U. Waiblinger, L. Grohmann, J. Mankertz, D. Engelbert, K. Pietsch//Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2010. Vol. 396, no. 6. P. 2065 — 2072.