МР 4.2.0108-16. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Организация и проведение лабораторной диагностики лихорадки денге. Методические рекомендации
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2016)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный Российской Федерации А. Ю. Попова 1 февраля 2016 г.
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОРГАНИЗАЦИЯ И ПРОВЕДЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 4.2.0108-16
1. Разработаны Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, Н.В. Шеенков); ФБУН ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора (В.А. Терновой, О.В. Пьянков, И.В. Плясунова, А.П. Агафонов, В.Н. Михеев); ФКУЗ «Российский противочумный институт „Микроб“ Роспотребнадзора (Т.Ю. Красовская, С.А. Щербакова, И.Н. Шарова, В.В. Кутырев); ФГБУ „Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи“ Минздрава России, подразделение „Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (А.М. Бутенко, В.Ф. Ларичев); ГБУЗ „Инфекционная клиническая больница № 1“ ДЗМ г. Москвы (Н.А. Малышев, М.А. Сайфуллин).»
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2016 г.
Список сокращений
1. Область применения
1.1. Методические рекомендации (далее — МР) определяют порядок организации и проведения лабораторной диагностики лихорадки денге (далее — ЛД) и носят рекомендательный характер.
1.2. Настоящие МР предназначены для специалистов лабораторий, осуществляющих диагностические, мониторинговые и научные исследования с возбудителями опасных инфекционных болезней.
2. Нормативные ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 № 569 «О положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации».
3. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.11.2013 № 64 «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 „Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)“ (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2014, регистрационный номер 32325).»
4. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 30.04.2003 № 85 «О введении в действие санитарно-эпидемиологических правил СП 1.2.1318-03 „Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I — IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами“ (зарегистрировано в Минюсте России 19.05.2003, регистрационный номер 4558).»
5. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.05.2007 № 27 «О реализации Международных медико-санитарных правил (2005)» (зарегистрировано в Минюсте России 31.05.2007, регистрационный номер 9575).
6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 04.02.2016 № 11 «О представлении внеочередных донесений о чрезвычайных ситуациях санитарно-эпидемиологического характера» (зарегистрировано в Минюсте России 24.03.2016, регистрационный номер 41525).
3. Общие положения
Лихорадка денге относится к острым природно-очаговым арбовирусным инфекционным заболеваниям с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя, характеризующимся лихорадкой, общей интоксикацией, миалгией, артралгией, лимфоаденопатией, экзантемой, иногда геморрагическим синдромом.
Возбудитель ЛД — вирус денге (Dengue virus), входящий в семейство Flaviviridae, род Flavivirus, серогруппу вируса денге (Dengue virus group), относится ко II группе патогенности (опасности) по классификации патогенности, действующей на территории Российской Федерации. Существует 4 субтипа вируса денге, различающихся серологически и генетически. Все четыре разновидности вируса денге способны вызвать ЛД, в том числе ее геморрагическую форму. Как правило, эта тяжелая форма возникает при повторном инфицировании другим субтипом вируса.
Ареал ЛД охватывает территории более чем 100 тропических и субтропических стран Африки, Америки, Южной и Юго-Восточной Азии, Океании и Австралии. Имеется информация об эпидемиях и вспышках этого заболевания в южных регионах Европы. В Российской Федерации существует вероятность формирования аутохтонных очагов ЛД на территории Черноморского побережья (Сочи и Сочинский район, Крым).
В последнее время в связи с развитием массового туризма, интенсификацией миграционных процессов и деловых связей возникла проблема завозных случаев этих заболеваний из тропических и субтропических стран в неэндемичные районы. Известны данные об импортированных случаях ЛД в Швеции, Финляндии, других европейских странах, в США, лихорадки Чикунгунья в Японии, Германии, Италии и других государствах Европы, Китае, Израиле, москитной лихорадки Тоскана (эндемичной в Средиземноморском регионе) в США, Германии и Швеции. Имеется информация о завозных случаях других арбовирусных инфекций. В течение шести лет (2009 — 2014 гг.) сотрудниками Инфекционной больницы № 1 г. Москвы и НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздрава России было диагностировано в общей сложности 178 лабораторно верифицированных случаев: лихорадки денге (152), лихорадки Чикунгунья (16), лихорадки Западного Нила (6), москитных лихорадок (3) и японского энцефалита (1) среди лиц, госпитализированных после возвращения из поездок в тропические страны.
По данным Роспотребнадзора в Российской Федерации наблюдалась следующая динамика регистрации завозных случаев ЛД: в 2012 г. — 63, в 2013 г. — 170, за 8 месяцев 2014 г. — 77, за 10 месяцев 2015 года — 100.
В эндемичных странах мира ежегодно регистрируются до 100 млн случаев ЛД в классической форме и примерно 500000 в виде геморрагической лихорадки, летальность при которой достигает 15 — 20%. Источником инфекции являются больные люди, обезьяны, возможно летучие мыши. Известны 2 эпидемиологические формы ЛД: джунглевая и городская. Переносчиками вируса при джунглевой форме являются комары Aedes niveus (нападающие как на обезьян, так и на людей), при городской эпидемиологической форме лихорадки — синантропные комары преимущественно Aedes aegypti и Aedes albopictus. Вирус способен размножаться в комарах при температуре воздуха не ниже 22 °С.
Вирусный геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 11 тыс. нуклеотидов. РНК кодирует три структурных (С, prM/М, Е) и семь неструктурных (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5) белков.
Основным иммуногенным белком вириона является белок Е, который играет доминирующую роль в генерации нейтрализующих антител и индукции иммунного ответа. На поверхности инфицированных клеток экспрессируется неструктурный гликопротеин № S1, который может секретироваться, инициирует активацию системы комплемента и играет важную роль в развитии шока при геморрагической ЛД.
Инкубационный период ЛД составляет от 2 до 15 дней после укуса инфицированного комара (чаще 5 — 7 дней), после чего развивается лихорадка, продолжающаяся 6 — 7 дней и иногда носящая двухфазный характер. Заболевание начинается внезапно с повышения температуры до 39 — 40 °С, появления озноба, болей в костях и мышцах поясничного отдела позвоночника, прямых мышцах живота, крестце, коленных суставах. Отмечается резкая слабость, головная боль, боли в глазных яблоках, светобоязнь, головокружение, потеря аппетита, возможна тошнота и рвота, бессонница, ощущение сухости во рту и сухости губ. У большинства больных увеличиваются периферические лимфатические узлы. Часто появляется экзантема, для которой характерен полиморфизм. Могут быть геморрагические проявления различной степени выраженности (от петехий до органных кровотечений). Лихорадка продолжается 2 — 7 дней, иногда она носит двухфазный характер и, как правило, закачивается выздоровлением. Заболевание сопровождается ретроорбитальными болями, миалгией и артралгией. Отмечается покраснение кожи лица и груди с выраженной дерматографией. Примерно в 50% случаев регистрируется макулопапулезная сыпь. В крови регистрируется лейкопения и тромбоцитопения, повышение уровня трансаминаз. По клиническому течению различают 2 формы ЛД: лихорадочную форму (классическую) и геморрагическую (протекает более тяжело, возможно развитие шокового состояния). В Международной классификации болезней 10-го пересмотра классическая ЛД имеет код A90, геморрагическая ЛД — A91.
Особенностью иммунопатогенеза геморрагической ЛД является то, что специфические антитела могут опосредовать феномен антителозависимого усиления инфекции. Антителозависимое усиление включает повышение связывания вируса с клетками, экспрессирующими рецепторы к Fc фрагментам иммуноглобулинов, после опсонизации антителами. Этот механизм может способствовать утяжелению течения заболевания, часто наблюдаемому при повторном инфицировании гетерологичным вирусом денге.
При геморрагической ЛД летальность достигает 5%, а среди детей — до 15 — 20%. ЛД является ведущей причиной госпитализации и смерти детей в Юго-Восточной Азии.
У реконвалесцентов, перенесших ЛД, типоспецифический иммунитет сохраняется в течение примерно 2 лет. Перекрестная устойчивость к инфицированию другим типом вируса непродолжительна и редко превышает 12 недель, поэтому уже через 2 — 3 месяца возможно повторное заболевание за счет заражения гетерологичным типом вируса. В течение жизни человек может последовательно переболеть ЛД, вызванной всеми типами вируса.
4. Методы лабораторной диагностики лихорадки денге
4.1. Для специфической диагностики ЛД используют иммунологические, молекулярно-генетические и вирусологические методы исследований.
4.2. С начала клинических проявлений и до 7 дня болезни вирус денге может быть обнаружен методом ОТ-ПЦР в сгустке крови, цельной крови, сыворотке крови, плазме, а также в аутопсийном материале (печень, легкие, лимфатические узлы, тимус, красный костный мозг). Список коммерческих наборов для проведения ОТ-ПЦР приведен в прилож. 4. При получении положительного результата ОТ-ПЦР проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования.
4.3. Для выделения вируса денге используют новорожденных белых мышей и культуры клеток (Vero, BHK-21), а также комариные культуры, например, С6/36. Процесс выделения и идентификации вируса денге довольно длительный и проводится в специализированных лабораториях с высоким уровнем защиты (BSL-3). Для выделения вируса используют пробы крови, сыворотки крови, плазмы, обогащенной лейкоцитами, полученные в острый период заболевания (первые 7 — 10 дней болезни), суспензии органов, взятых при аутопсии.
4.4. Основным методом серодиагностики ЛД является иммуноферментный анализ (ИФА-IgM). Специфические антитела класса IgM выявляются у 50% пациентов, начиная с 3 — 5 суток после начала заболевания, а к 10 дню уже у 99%. Максимальные титры IgM наблюдаются через 2 недели после появления симптомов, постепенное снижение происходит в последующие 2 — 3 месяца. Возможна циркуляция IgM-антител в крови до полугода. Помимо ИФА-IgM антитела к вирусам денге можно выявлять в сыворотке или плазме больных непрямым методом МФА и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме или цельной крови). Иммуноглобулины класса G (IgG) в низких титрах обычно обнаруживаются к концу первой недели заболевания, значительно нарастают в последующий период и, вероятно, персистируют в течение всей жизни. Для выявления сероконверсии IgG вторая проба сыворотки обследуется с интервалом в 10 — 14 дней. Пик IgG антител приходится на 3 — 4 неделю заболевания, затем их концентрация снижается и остается, как правило, на определяемом уровне в течение длительного времени.
При вторичном инфицировании гетерологичным вирусом денге титры антител нарастают быстрее в основном за счет иммуноглобулинов класса G. Титр IgM во время инфекции, вызванной гетерологичным типом вируса, значительно ниже, чем при первой встрече с возбудителем. Обнаружение IgG-антител имеет значение при ретроспективной диагностике заболевания и дифференциации первичной и вторичной инфекции, вызванной вирусами денге разных типов. Количественное определение IgM и IgG к вирусу денге позволяет определить первичное или вторичное инфицирование, что особенно важно для прогноза исхода заболевания.
4.5. Белок NS1 (NS1-антиген) вируса денге детектируют методом ИФА (в сыворотке крови пациентов и в аутопсийном материале) и методом иммунохроматографии (в сыворотке, плазме, цельной крови) в течение примерно 10 дней с момента появления клинических признаков заболевания, что объясняется высокой концентрацией и продолжительной персистенцией вируса в крови, достигающей 106 — 108 инфекционных вирусных частиц на мл. Обнаружение NSl-антигена указывает на присутствие вируса денге в организме больного.
4.6. Другие серологические методы диагностики ЛД, такие как реакция нейтрализации (РН), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция связывания комплемента (РСК) в настоящее время используются редко. РН хотя и обладает высокой специфичностью (при ее использовании возможна идентификация серотипа вируса денге и дифференциация от других флавивирусных инфекций), однако является трудоемким неэкспрессным методом и может использоваться лишь в специализированной вирусологической лаборатории. РТГА также достаточно специфична, но, как и РСК, обладает низкой чувствительностью. РСК эффективна на поздних этапах заболевания, однако при ее использовании, как и в случае применения ИФА и МФА, возникают сложности по дифференциации ЛД от других родственных флавивирус ных инфекций.
4.7. В настоящее время в Российской Федерации для серологической диагностики ЛД используются ИФА- и ПЦР-тест-системы. Перечень наборов реагентов и тест-систем для использования при лабораторной диагностике ЛД приведен в прилож. 4. Импортные наборы для выявления NS1-антигена вируса денге и антител классов IgM и IgG на основе метода иммунохроматографии могут быть скомбинированы в один тест, что удобно в использовании. Однако зарубежные тест-системы для постановки ИФА, МФА и иммунохроматографии пока не нашли применения в диагностических лабораториях России.
4.8. Для постановки точного дифференциального диагноза ЛД серологическое обследование крови больных с подозрением на эту инфекцию необходимо проводить наиболее специфичным методом ИФА-IgM в четырех тест-системах: ИФA-IgM-дeнгe, ИФА-IgМ-лихорадка Западного Нила (ЗН), ИФА-IgМ-желтая лихорадка (ЖЛ), ИФА-IgМ-японский энцефалит (ЯЭ). Эти заболевания имеют часто сходные ареалы распространения, этиологически связаны с родственными флавивирусами, перекрестно реагирующими в серологических реакциях. Кроме того, ЛД целесообразно дифференцировать от близкой по клинической картине лихорадки Чикунгунья, распространенной как и ЛД в Африке, Южной Азии, а в последнее время — в Южной Америке и Европе.
4.9. Лабораторное подтверждение диагноза ЛД основывается на наличии как минимум одного положительного результата на следующие тесты:
- обнаружение РНК вирусов денге методом ОТ-ПЦР;
- наличие NS1-антигена в одном образце сыворотки;
- наличие IgM в одном образце сыворотки;
- нарастание титра IgG в парных сыворотках, взятых с интервалом 2 — 3 недели, в четыре раза и более.
4.10. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, иммунохимии и иммунохроматографии на базе вирусологических лабораторий, лабораторий особо опасных инфекций в субъектах Российской Федерации, а также, при необходимости, в региональных центрах по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II — IV групп патогенности, в референс-лабораториях.
4.11. В соответствии с приказом Роспотребнадзора от 17.03.2008 № 88 при выявлении положительных результатов первичного обследования пациентов с геморрагическим синдромом, в том числе случаев с летальным исходом, полученный материал отправляется на подтверждающее тестирование в один из Региональных центров по мониторингу за возбудителями инфекционных болезней I — II групп патогенности с прикрепленными субъектами Российской Федерации и Центров индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, созданных на базе противочумных учреждений или Национальный центр верификации диагностической деятельности, выполняющий функции Государственной коллекции — ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» <*>.
<*> ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (630559, р.п. Кольцово, Новосибирская обл., тел.: (383) 336-60-10, факс (383) 336-74-09, e-mail: vector@vector.nsc.ru.
5. Правила забора, упаковки и транспортирования клинического (или секционного) материала, порядок проведения исследований и координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику заболеваний, вызванных вирусом денге
5.1. Забор, упаковку и транспортирование материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию, вызванную вирусом денге, осуществляют в строгом соответствии с требованиями санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)», санитарных правил СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности» и методических указаний МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».
Забор, упаковку проводят в медицинских организациях. Забор материала от больных производится медицинскими работниками стационара, в который госпитализирован больной, под руководством специалиста Роспотребнадзора, подготовленного по вопросам диагностики особо опасных инфекционных болезней и биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I — II групп патогенности. В случае невозможности быстрого прибытия указанных специалистов забор материала от больного осуществляют два медицинских работника, один из которых должен быть подготовлен по биологической безопасности при работе с клиническим материалом, подозрительным на заражение возбудителями инфекционных болезней I — II групп патогенности.
Секционный материал отбирают медицинские работники патологоанатомических отделений (бюро судебно-медицинской экспертизы) в присутствии специалиста по особо опасным инфекциям. Забор материала производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики ЛД приведены в прилож. 1.
5.2. При подозрении на ЛД от больных для исследования берут кровь. Для серологических исследований, основанных на выявлении нарастания титра антител в парных сыворотках, образцы крови забирают в острую стадию заболевания, а затем через 2 — 3 недели. В случае летального исхода исследуют секционный материал (кровь из сердца, кусочки печени, селезенки, легких, лимфатических узлов, тимуса, красного костного мозга).
5.3. Оптимальные сроки детекции вируса денге и его маркеров в клиническом материале представлены в прилож. 2.
5.4. Отправку секционного материала в лабораторию рекомендуется осуществлять в транспортной таре со стабилизирующей средой (прилож. 3).
5.5. Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР, ИФА, НРИФ, иммунохроматографическим методом, а также выделяя вирус на чувствительной биологической модели (при наличии разрешения на проведение работ с вирусом денге). В случае получения положительного результата ОТ-ПЦР, при наличии соответствующего оснащения лаборатории, проводят определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента к ДНК методом секвенирования. Для секвенирования фрагментов генома и генотипирования вируса денге возможно использование протокола, приведенного в прилож. 5.
5.6. Используемые на этапах первичного исследования материала от больного тест-системы и наборы реагентов должны быть разрешены к применению в Российской Федерации в установленном порядке.
5.7. Результаты исследований направляют в Федеральную службу по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в управление Роспотребнадзора по субъекту Российской Федерации и в учреждение, направившее материал.
СПОСОБЫ ВЗЯТИЯ, УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ
ОПТИМАЛЬНЫЕ СРОКИ ДЕТЕКЦИИ ВИРУСА ДЕНГЕ И ЕГО МАРКЕРОВ В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
СТАБИЛИЗИРУЮЩИЕ ТРАНСПОРТНЫЕ СРЕДЫ
1. Стабилизирующая среда для хранения и транспортирования материала для исследований методом ОТ-ПЦР.
С целью предотвращения разрушения нуклеиновых кислот рекомендуется использование следующих транспортных сред в зависимости от вида исследуемого материала:
- транспортная среда № 1, содержащая: NaCl 137 мМ, КСl 2,7 мМ, NaH2PO4 10 мМ, К2НРO4 2 мМ, сыворотка крупного рогатого скота 20%;
- транспортная среда № 2, содержащая: сахароза 0,218 М, КН2РО4 0,0038 М, К2НРО4 0,0072 М, БСА 1%;
- транспортная среда ESP (или эквивалент), содержащая: саркозил 1%; ЭДТА 0,05 М; свободная от нуклеаз проназа Е 1 мг/мл;
- специальные транспортные среды, разработанные и рекомендованные производителями наборов реагентов.
При необходимости длительного хранения и перевозки в отсутствии низкотемпературных холодильников рекомендуется использовать транспортную среду ESP (или эквивалент). Исследуемый материал может храниться в среде ESP (или эквиваленте) при температуре (25 \pm 5) °С в темном месте в течение 10 дней.
2. Стабилизирующая среда для хранения и транспортирования материала для вирусологических исследований.
Рекомендуется использование следующей стабилизирующей среды для хранения и транспортирования материала от людей для дальнейших вирусологических исследований.
Среда готовится в стерильных условиях, автоклавирование не допускается, можно стерилизовать фильтрованием через нитроцеллюлозный стерильный фильтр в стерильную посуду.
- среда для культур клеток № 199, содержащая 0,5% BSA;
- пенициллин 2 х 106 ед./л, стрептомицин 200 мг/л, полимиксин В 2 х 106 ед./л, гентамицин 250 мг/л, нистатин 0,5 х 106 ед./л.
ТЕСТ-СИСТЕМЫ И НАБОРЫ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ДЕНГЕ
- набор для определения антител IgM к возбудителю ЛД;
- набор для определения антител IgG к возбудителю ЛД;
- наборы реагентов для выявления антигенов вируса денге и антител классов IgM, IgG к нему методом иммуноферментного анализа.
- тест-система иммуноферментная для дифференцированного выявления IgM- и IgG-антител к антигенам вируса;
- тест-система иммуноферментная;
- тест-система иммуноферментная для определения антигена NS1;
- тест-система иммуноферментная для определения IgG/IgM.
Непрямая реакция иммунофлуоресценции (НРИФ):
- система для выявления иммуноглобулинов М вируса денге типов 1 — 4 IIFT (IgM);
- система для выявления иммуноглобулинов G вируса денге типов 1 — 4 IIFT (IgG);
- система для выявления иммуноглобулинов G к вирусу клещевого энцефалита / вирусу Западного Нила / вирусу японского энцефалита / вирусу желтой лихорадки / вирусу денге (типы 1 — 4), IgG;
- система для выявления иммуноглобулинов М к вирусу клещевого энцефалита / вирусу Западного Нила / вирусу японского энцефалита / вирусу желтой лихорадки / вирусу денге (типы 1 — 4), IgM.
- набор реагентов для амплификации кДНК вируса денге (субтипов 1 — 4) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Выделение РНК из исследуемого материала:
Обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение обратной транскрипции и амплификации, секвенирование продуктов амплификации осуществляют в соответствии с нормативными правовыми актами и методическими документами, регламентирующими требования к безопасности работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности) при использовании молекулярно-генетических методов исследования.
Выделение РНК вируса денге осуществляется из 100 мкл исследуемого образца. Обратная транскрипция проводится со статистической смесью гексануклеотидов (статзатравкой) в течение 1 часа при температуре 37 °С. В случае использования коммерческих наборов реагентов для проведения реакции обратной транскрипции руководствуются инструкцией производителя.
Амплификацию фрагментов для секвенирования проводят с праймерами (таблица), специфичными для консервативного участка нетранслируемого региона 5'-UTR и гена capsid protein С.
После обеззараживания исследуемого материала, выделения РНК и реакции обратной транскрипции проводят ПЦР в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
ПЦР проводят, используя программу амплификации, представленную в таблице:
Температурные и временные режимы при проведении ПЦР
| Температура, °С | Время (минуты : секунды) | Количество циклов |
| 95 | 05:00 | 1 |
| 95 | 00:15 | 40 |
| 50 | 00:20 | |
| 72 | 00:40 | |
| 72 | 02:00 | 1 |
| 4 | хранение |
ПЦР-продукты разделяют в 2%-м агарозном геле в присутствии бромистого этидия. Фрагменты необходимой длины вырезают и выделяют из агарозного геля, используя наборы для выделения двухцепочечных молекул ДНК из продуктов ПЦР и агарозных гелей методом фильтрации на мембране.
Секвенирование ПЦР-продуктов проводят с помощью наборов реагентов в соответствии с протоколами производителей, используя прямые и обратные праймеры. Последующий анализ продуктов реакции проводят в автоматическом секвенаторе, использующем капиллярный электрофорез.
Анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей проводят сравнением с известными нуклеотидными последовательностями генотипов вируса денге, депонированными в международной базе данных NCBI/BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).