МР 4.2.0078/1-13. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Использование питательных сред для диагностики гнойных бактериальных менингитов. Методические рекомендации

(утв. Роспотребнадзором 21.10.2013)

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГНОЙНЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕНИНГИТОВ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработаны ФБУН ГНЦПМБ Роспотребнадзора (И. А. Дятлов, Я. В. Подкопаев, Л. В. Домотенко, Т. П. Морозова, М. В. Храмов); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е. Б. Ежлова, А. А. Мельникова, Н. А. Кошкина).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко 21 октября 2013 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

1. Область применения

1.1. Методические рекомендации предназначены для врачей-бактериологов, эпидемиологов, лаборантов и других специалистов, занимающихся проблемами гнойных бактериальных менингитов и других инфекций, вызываемых Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae.

1.2. В методических рекомендациях приведены общие сведения о трех основных возбудителях гнойных бактериальных менингитов: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae. Подробно обсуждаются вопросы, касающиеся свойств и использования питательных сред для выделения и культивирования основных возбудителей гнойных бактериальных менингитов.

2. Общие положения

2.1. Характеристика возбудителей

Гнойные бактериальные менингиты (ГБМ) — заболевания, при которых локализация инфекционного процесса происходит в мягких мозговых оболочках основания головного мозга и верхней части спинного мозга. Этиологическими агентами ГБМ могут быть различные микроорганизмы: N. meningitidis, H. influenzae, S. pneumoniae, Candida albicans, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и другие. Из них более 90% расшифрованных случаев бактериальных менингитов приходится на N. meningitidis, S. pneumoniae и Н. influenzae типа b, из-за чего основные усилия в лабораторной диагностике при подозрении на ГБМ направлены на выделение этих возбудителей.

N. meningitidis — грамотрицательные неподвижные, неспорообразующие кокки. Экзотоксина не образуют, при гибели микробной клетки высвобождается эндотоксин липополисахаридной природы. В соответствии с особенностями строения полисахаридной капсулы менингококки подразделяют на 12 серогрупп: А, В, С, X, Y, Z, W-135, 29-Е, К, Н, L, I. Менингококки чрезвычайно чувствительны к воздействию внешней среды. Температурный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием CO_{2} (5-10%) и влажности. Нуждаются в высокопитательных средах, содержащих нативные белки или кровь животного происхождения.

Н. influenzae — небольшие (0,3-0,4 x 1-1,5 мкм) грамотрицательные, сферические, овальные и палочковидные клетки. Неподвижные, неспорообразующие, медленно окрашиваются анилиновыми красителями. Основной фактор вирулентности — капсула. Капсульные штаммы Н. influenzae содержат капсульный полисахарид одного из 6 типов (а, b, с, d, e, f), которые отличаются по составу входящих в него углеводов и антигенным свойствам. Большинство инвазивных инфекций вызывается штаммами Н. influenzae типа b. Капсула типа b состоит из полирибозилрибитолфосфата, то есть содержит в качестве мономера пентозу (рибозу) в отличие от других типов, содержащих гексозу. Бескапсульные штаммы обозначаются как нетипируемые. Для роста гемофильных палочек необходимо наличие в среде факторов роста X (гемин или гематин) и V (кофермент никотинамидадениндинуклеотид — НАД). Оптимальная температура культивирования 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием CO_{2} (5-10%).

S. pneumoniae — грамположительные овальные, иногда вытянутые вдоль оси ланцетовидные кокки диаметром 0,5-1,0 мкм, располагаются парами и окружены общей капсулой, неподвижны, спор не образуют, являются факультативными анаэробами, хемоорганотрофы. По капсульному антигену проводят типоспецифическую дифференцировку пневмококков, которых насчитывают не менее 90 серотипов. Пневмококки нуждаются в богатых питательных средах с высоким содержанием аминного азота и нативного белка животного происхождения. Температурный оптимум жизнедеятельности 37 °С в атмосфере с повышенным содержанием CO_{2} (5-10%).

2.2. Питательные среды, используемые для лабораторной диагностики бактериальных менингитов

Одним из основных этапов лабораторной диагностики ГБМ является бактериологический посев на питательные среды с целью выделения возбудителя заболевания.

Для выделения N. meningitidis используют полужидкий сывороточный агар, сывороточный, кровяной и шоколадный агары. При культивировании S. pneumoniae предпочтение отдается кровяному агару. Кроме того, S. pneumoniae культивируют на шоколадном, сывороточных агарах и на полужидком сывороточном агаре.

Н. influenzae не растет на простых и сывороточных питательных средах. Кровяные агары не подходят для культивирования Н. influenzae из-за содержащихся в нативной крови никотинамидадениндинуклеотидаз (НАДаз), инактивирующих фактор V. Основной средой для культивирования и выделения Н. influenzae является шоколадный агар. Термическая обработка, которой подвергается кровь в процессе приготовления шоколадного агара, позволяет частично лизировать эритроциты, высвобождая тем самым факторы роста и разрушая НАДазы. Оптимальной средой, поддерживающей рост всех трех основных возбудителей ГБМ, является шоколадный агар. В настоящее время в отечественной практике сывороточный, кровяной и шоколадный агары готовят в лабораторных условиях, в качестве основы используя агар Хоттингера, колумбийский агар, агар для бруцелл, питательную среду для определения чувствительности микробов к антибиотикам (АГВ), эритрит-агар. Руководством по лабораторным методам диагностики бактериальных менингитов, разработанных ВОЗ, для этих целей рекомендованы триптиказосоевый агар (trypticase soy agar), сердечно-мозговой агар (brain heart infusion agar) и гонококковый агар (GC agar).

Биологические и физико-химические показатели качества шоколадного и кровяного агаров зависят от качества и типа используемой крови. Для приготовления данных сред используют дефибринированную баранью, лошадиную кровь и кровь крупного рогатого скота. Человеческая кровь содержит антитела, которые могут ингибировать рост микроорганизмов, поэтому она пригодна только для приготовления шоколадного агара. Кровь, используемая для приготовления питательных сред, не должна содержать консерванты, что ограничивает срок ее годности и температурный режим хранения. Все перечисленные факторы создают проблемы при лабораторном изготовлении кровяных и шоколадных питательных сред. Дополнительные трудности возникают при приготовлении шоколадного агара, поскольку его качество и стандартность зависят не только от качества используемой крови, но и от навыков и умения лаборанта в процессе прогревания питательной среды.

Решение проблемы стандартности питательных сред возможно при использовании коммерческих питательных сред. Ряд иностранных фирм-производителей питательных сред выпускают питательные среды, в которых нативная кровь заменена сухим гемоглобином и ростовыми добавками. Эти среды, как сухие, так и готовые к применению, используются для выделения и культивирования всех трех основных возбудителей ГБМ.

В нашей стране для выделения и культивирования основных возбудителей ГБМ разработаны три питательных среды: питательная среда для выделения возбудителей гнойных бактериальных менингитов, готовая к применению (шоколадный агар); питательная среда для культивирования и выделения гемофильной палочки, готовая к применению (гемофилус-агар) и питательная среда для выделения и культивирования возбудителей гнойных бактериальных менингитов, сухая (ГБМ-агар).

2.3. Гемофилус-агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями рода Haemophilus, a также при работе с чистыми культурами Haemophilus.

2.4. Шоколадный агар

Предназначен для бактериологических исследований в клинической микробиологии при анализе клинического материала от больных с подозрением на бактериальный менингит и другими заболеваниями инфекционной природы, вызываемыми бактериями Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, а также при работе с чистыми культурами Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

2.5. ГБМ-агар

Предназначен для бактериологических исследований с целью выделения и культивирования бактерий Н. influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis.

3. Аналитические и диагностические характеристики питательных сред

3.1. Гемофилус-агар

Обеспечивает рост тест-штаммов Н. influenzae 423 и Н. influenzae АТСС 9006 при посеве по 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 6} через 18-24 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С в атмосфере 5-10% CO_{2} в виде слизистых, круглых, сероватого цвета, полупрозрачных колоний диаметром до 2 мм. Питательная среда подавляет рост тест-штаммов микробов-ассоциантов Streptococcus pyogenes Dick-1 и N. meningitidis A 208 при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10^{- 4} , приготовленной по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85-09П.

3.2. Шоколадный агар и ГБМ-агар

На шоколадном агаре и ГБМ-агаре без введения селективных добавок тест-штаммы растут следующим образом:

• Н. influenzae 423, Н. influenzae АТСС 49247 — в виде слизистых, круглых, полупрозрачных, сероватого цвета колоний диаметром 1,0-2,0 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10^{- 6} через 18-24 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С в атмосфере 5-10% CO_{2} ;
• N. meningitidis A 208, N. meningitidis АТСС 13102 — в виде полупрозрачных, выпуклых с ровными краями колоний диаметром до 2 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10^{- 6} через 18-24 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С в атмосфере 5-10% CO_{2} ;
• S. pneumoniae АТСС 6305 — в виде нежных полупрозрачных четко очерченных, не склонных к слиянию колоний диаметром 0,4-0,6 мм при посеве 0,1 мл взвеси из разведения 10^{- 5} через 18-24 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С в атмосфере 5-10% CO_{2} . Допускается наличие плоских с центральным углублением колоний. В зоне роста культуры на чашках с шоколадным агаром наблюдается позеленение питательной среды, на чашках с ГБМ-агаром — обесцвечивание питательной среды.

При использовании соответствующих селективных добавок шоколадный агар и ГБМ-агар обеспечивают избирательный рост тест-штаммов.

С селективной добавкой СД-Г обе питательные среды обеспечивают рост штаммов Н. influenzae 423 и Я. influenzae АТСС 49247 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 6} и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, N. meningitidis A 208, N. meningitidis АТСС 13102 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 4} через 48 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С.

С селективной добавкой СД-П обе питательные среды обеспечивают рост S. pneumoniae АТСС 6305 при посеве 0,1 мл взвеси тест-штамма из разведения 10^{- 5} и подавляют рост тест-штаммов: N. meningitidis А 208, N. meningitidis АТСС 13102, Н. influenzae 423, H. influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 4} через 48 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С.

С селективной добавкой СД-М обе питательные среды обеспечивают рост N. meningitidis A 208 и N. meningitidis АТСС 13102 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 6} и подавляют рост тест-штаммов: S. pneumoniae АТСС 6305, Н. influenzae 423, Н. influenzae АТСС 49247 и С. albicans АТСС 60193 при посеве 0,1 мл взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^{- 4} через 48 ч. инкубации при температуре (37 \pm 1) °С.

4. Проведение анализа

4.1. Приготовление питательных сред

Питательные среды готовят в соответствии с инструкциями по применению данных препаратов. Для приготовления гемофилус-агара и шоколадного агара бутылки с основами выдерживают в кипящей водяной бане до полного расплавления агара. Возможно расплавление основ питательных сред в автоклаве в режиме «стерилизации текучим паром». Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до (45-50) °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри.

Для приготовления ГБМ-агара навеску основы в количестве, указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной среды, растворяют в дистиллированной воде, стерилизуют автоклавированием. Содержимое флаконов с ростовыми добавками и, при необходимости, с селективными добавками растворяют в стерильной дистиллированной воде и добавляют в остывшую до 45-50 °С основу. Перемешивают и разливают в чашки Петри. Растворы ростовых и селективных добавок не хранить, использовать немедленно после приготовления!

4.2. Посев и инкубация

Перед посевом чашки со средами выдерживают в термостате при температуре (37 \pm 1) °С в течение 10-15 мин. Посев анализируемых образцов производят сразу же после их получения.

Чашки с посевами инкубируют в перевернутом положении (крышкой вниз) в атмосфере, обогащенной углекислым газом (5-10%) при температуре (37 \pm 1) °С, время инкубации зависит от типа образца и целей исследования.

4.3. Учет результатов

Учет результатов проводят визуально по наличию характерных колоний через 18-48 ч. инкубации.

Н. influenzae формирует на всех средах слизистые, круглые, сероватого цвета колонии диаметром до 2 мм.

N. meningitidis формирует на шоколадном агаре и ГБМ-агаре полупрозрачные, выпуклые с ровными краями колонии диаметром до 2 мм.

S. pneumoniae формирует на шоколадном агаре мелкие, нежные, полупрозрачные, четко очерченные колонии с позеленением питательной среды в зоне роста культуры, а на ГБМ-агаре — мелкие, нежные, полупрозрачные, четко очерченные колонии с обесцвечиванием питательной среды в зоне роста культуры.

5. Условия хранения и эксплуатации питательных сред

Бутылки с основами гемофилус-агара, шоколадного агара и флаконы с ростовыми и селективными добавками хранят герметически закрытыми при температуре 2-8 °С. Банки с основой ГБМ-агара хранят герметически закрытыми при температуре от 2 до 25 °С.

Срок годности всех питательных сред в чашках Петри при температуре 2-8 °С — не более 7 дней.

Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкций по применению данных сред.

6. Меры предосторожности

При работе с клиническими образцами и микробными культурами необходимо соблюдать СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV группы патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» и «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения Российской Федерации» (М., 1981).

7. Заключение

Ключевым этапом в диагностике ГБМ является бактериологический посев на питательные среды. От их качества зависит достоверность и воспроизводимость результатов анализа. Применение питательных сред, изготовленных промышленным способом, позволяет стандартизовать и оптимизировать бактериологические исследования, а также повысить эффективность диагностики бактериальных менингитов.

Список литературы

1. Laboratory methods for the diagnosis of meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, and Haemophilus influenza: WHO manual 2nd edition. WHO/IVB.11.09. World Health Organization, Geneva, 2011.

2. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Haemophilus influenzae: методические рекомендации / Под ред. Л. С. Страчунского // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. № 2. С. 93-109.

3. Выделение, идентификация и определение чувствительности к антибиотикам Streptococcus pneumoniae: методические рекомендации / Под ред. Л. С. Страчунского // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. Т. 2. № 1. С. 88-98.

4. Козлов Р.С. Пневмококки: уроки прошлого — взгляд в будущее. Смоленск: МАКМАХ, 2010. 128 с.

---