МР 3.3.0362-24. 3.3. Иммунопрофилактика инфекционных болезней. Применение метода полимеразной цепной реакции для выявления первичных иммунодефицитов в целях прогноза и профилактики инфекционных осложнений. Методические рекомендации

(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 24.12.2024)

3.3 ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

МР 3.3.0362-24

1. Разработаны ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Роспотребнадзора (А.А. Тотолян, Ю.В. Останкова, Н.Е. Любимова, М.А. Сайтгалина); ФБУН «Федеральный научно-исследовательский институт вирусных инфекций „Виром“ Роспотребнадзора (А.В. Семенов); ГБУЗ „Детская городская клиническая больница № 9 (ДГКБ № 9) им. Г.Н. Сперанского ДЗМ“ (А.П. Продеус, М.А. Гордукова, И.А. Корсунский).»

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 декабря 2024 г.

3. Введены впервые.

I. Область применения

1.1. Настоящие методические рекомендации (далее — МР) рекомендуются к применению при проведении исследований крови методом полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) в целях выявления первичных иммунодефицитов для прогноза и профилактики инфекционных осложнений у новорожденных и взрослых лиц.

1.2. В МР представлен способ лабораторного выявления первичных иммунодефицитов у новорожденных и взрослых лиц посредством определения уровней молекул T-рецепторных эксцизионных колец (англ. T-cell receptor excision circles, далее — TREC) и каппа-делеционных рекомбинационных эксцизионных колец (англ. kappa-deleting recombination excision circles, далее — KREC) в крови методом ПЦР.

1.3. Представленный в МР способ лабораторного выявления первичных иммунодефицитов не предназначен для использования в качестве диагностического теста или для скрининга таких первичных иммунодефицитов, как синдром Ди Джорджи или синдром Оменна. В указанных случаях рекомендуется сопровождение результата анализа диагностическим подтверждающим тестированием. Настоящие МР не распространяются на такие случаи.

II. Общие положения

Первичные иммунодефицитные заболевания

2.1. Первичные иммунодефициты (далее — ПИД) представляют собой гетерогенную группу врожденных дефектов иммунной системы, формирующихся вследствие генетических нарушений, являющихся индивидуальными редкими нозологическими формами. В настоящее время включают 406 нозологических форм и более 430 различных генетических мутаций, приводящих к ПИД [1]. ПИД представлены широким спектром клинических фенотипов и обусловлены различными патофизиологическими механизмами. ПИД имеют клинические проявления инфекционного характера: пневмонии, бронхиты, инфекции носовых пазух, дыхательных путей, уха, ротовой полости, кожные инфекции, менингит.

Также для ПИД характерны:

• повышенная восприимчивость к различным инфекциям;
• склонность к хроническому течению инфекционных заболеваний;
• многоочаговость (наличие нескольких очагов инфекции одновременно), в том числе совмещение патогенов разного происхождения (бактериальных, вирусных и грибковых);
• частые, длительные, рецидивирующие инфекции;
• оппортунистические инфекции, которые могут привести к летальному исходу больного с ПИД.

2.2. ПИД относятся к редким болезням, осведомленность о данной патологии в медицинском сообществе и среди больных крайне низка, что приводит к несвоевременной диагностике. Задержка в постановке диагноза может приводить к ранней инвалидизации и высокой смертности больных, в том числе за счет инфекционных осложнений.

2.3. ПИД с относительно легким течением заболевания из-за разнообразия клинической картины могут оставаться не выявленными в детском возрасте. При первичном выявлении заболеваний у взрослых пациентов определяют разнообразную и преимущественно сглаженную клиническую картину. Согласно исследованиям, некоторые ПИД со сглаженным течением, например, общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН), из-за задержки диагностики впервые могут быть определены в возрасте 35 лет и старше [2]. В редких случаях у взрослых пациентов могут быть выявлены более тяжелые формы ПИД.

Выявление тяжелых комбинированных иммунодефицитов

2.4. Тяжелый комбинированный иммунодефицит (далее — ТКИН) является одной из наиболее тяжелых форм ПИД с неблагоприятным прогнозом и характеризуется недостатком T-клеток. B-лимфоциты и NK-клетки могут как присутствовать, так и отсутствовать в зависимости от молекулярного дефекта.

2.5. Согласно результатам программ скрининга, истинная частота ТКИН в мире выше прогнозируемой [3]. Программы, направленные на выявление ПИД, могут обеспечить раннее обнаружение ТКИН и профилактику инфекционных осложнений.

2.6. Для обнаружения заболевания в качестве стратегии рекомендуется выявление T-клеточной лимфопении у новорожденных. Этапы развития методов выявления ТКИН связаны с появлением новых способов лабораторных исследований, развитием представлений об иммунопоэзе, в том числе о созревании T- и B-лимфоцитов:

• первый этап. Подход, основанный на проведении клинического анализа крови для каждого новорожденного с определением количества лимфоцитов. Низкая чувствительность метода;
• второй этап. Исследование пуповинной крови методом проточной цитометрии популяции T-клеток. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью;
• третий этап. Исследование крови (цельной крови и (или) сухой капли крови) методом ПЦР основан на базе понимания закономерностей созревания и дифференцировки T- и B-клеток. Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью.

2.7. Своевременное выявление ТКИН делает возможным и значимым раннее обнаружение заболевания и профилактику осложнений ТКИН [4].

Определение отсутствия/дефицита T-клеток

2.8. TREC представляют собой небольшие кольцевые кусочки эписомальной дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее — ДНК), которые образуются при перестройке T-клеточного рецептора (англ. T-cell receptor, далее — TCR) в наивных T-клетках и являются суррогатными маркерами для недавних эмигрантов тимуса [5]. Молекулы TREC стабильны в периферической крови, не деградируют и не реплицируются с последующим делением клеток, что делает их рекомендуемым маркером для мониторинга пролиферации T-клеток.

2.9. Низкая концентрация TREC выявлена у детей с формами ПИД, отличными от ТКИН, например, при атаксии-телеангиэктазии и комбинированных иммунодефицитных заболеваниях (далее — КИД). Оценка концентрации TREC позволяет выявлять пациентов с КИД, не идентифицированных иным методом, в том числе случаи, когда не определены специфические для заболевания мутации.

2.10. Количественное определение TREC позволяет выявить детей с лимфопенией T-клеток, вызванной другими первичными и вторичными причинами, представленными в табл. 1 приложения к настоящим МР.

2.11. TREC специфичны для наивных T-клеток, показано возрастное снижение их концентрации у здоровых людей и снижение их уровня при ВИЧ-инфекции [6].

2.12. Другие подходы к обнаружению ТКИН включают обследование новорожденных с помощью анализа TREC, а также тандемной масс-спектрометрии для выявления дефицита аденозиндезаминазы (англ. adenozindezaminaza, далее — ADA).

2.13. Большинство алгоритмов выявления первичных иммунодефицитов не оптимизировано для применения в крупномасштабных программах, а также для выявления ПИД у взрослых лиц, рекомендуется модификация алгоритмов для внедрения в рутинную практику [7].

Выявление врожденного наличия дефицита B-клеток

2.14. KREC представляют собой небольшие кольцевые фрагменты эписомальной ДНК, образующихся при перестройке B-клеточного рецептора (англ. B-cell receptor, далее — BCR). Уровни KREC отражают процесс репликации B-клеток во времени и могут использоваться для оценки состояния иммунитета у пациентов [8].

2.15. Мутации в ключевых генах, необходимых для онтогенеза B-клеток, приводят к врожденным нарушениям дефицита B-клеток. Пациенты характеризуются отсутствием B-клеток, крайне низкими или неопределяемыми уровнями иммуноглобулина и повышенной восприимчивостью к тяжелым инфекциям, вызванными бактериями и другими патогенными микроорганизмами [1]. Анализ уровня KREC позволяет выявить новорожденных с B-клеточными нарушениями, показывая, что кольцевые молекулы KREC отсутствуют в образцах крови и сухих пятен крови, полученных из карт Гатри у пациентов с X-сцепленной агаммаглобулинемией (далее — XГБ), возникающей в результате мутации в гене, кодирующем тирозинкиназу Брутона (БТК), и аутосомно-рецессивные XГБ-подобные заболевания [9].

Параллельное определение тяжелых форм первичного иммунодефицита, проявляющихся лимфопенией T- и B-клеток

2.16. Мультиплексный анализ определения концентрации TREC/KREC позволяет одновременно идентифицировать детей с тяжелыми формами ПИД, проявляющимися T- и (или) B-клеточной лимфопенией, представленными в табл. 1 и 2 приложения к настоящим МР [10 - 14]. Мультиплексный анализ TREC/KREC позволяет выявить врожденные дефекты B-клеток, что является преимуществом по сравнению с анализом только TREC, так как способствует обнаружению пациентов с различными формами ПИД, которые могут быть пропущены при определении концентрации только TREC [15 - 19].

2.17. Обнаружение таких ПИД, которые впервые дебютируют или выявляются в подростковом и взрослом возрасте, в основном строится на исследовании клинической картины, анамнеза и исключении вторичной причины снижения уровней сывороточных иммуноглобулинов, оценке их количества в крови и проведении проточной цитометрии для количественной оценки имеющих поверхностно-мембранные Ig субпопуляции B-лимфоцитов в периферической крови. В связи с чем все большее внимание обращают на себя способы выявления первичных T- и (или) B-клеточных иммунодефицитов не только у новорожденных, но и у взрослых лиц.

Ограничения существующих стратегий выявления ПИД

2.18. При выявлении новорожденных с использованием анализа на уровень TREC остаются не обнаруженными заболевания, при которых молекулярный дефект появляется на ранних стадиях перестройки рецептора T-клеток [11]. Анализ на уровень TREC не позволяет выявить случаи, связанные с функциональным дефектом T-клеток при нормальном их количестве.

2.19. Реализуемая в настоящее время стратегия поиска ПИД направлена на новорожденных, в то время как известен ряд ПИД со сглаженным течением, выявляемых в подростковом возрасте и у взрослых людей.

2.20. ПЦР является методом определения количества целевых молекул TREC/KREC, обладает высокими показателями специфичности и чувствительности. Праймеры и зонды для ПЦР подбираются с учетом структур TREC и KREC, чтобы исключить отжиг на матрице геномной ДНК (перестроенной и не перестроенной в T и B лимфоцитах и в любых других клетках человека не лимфоцитарного ряда), а также с учетом минимизации образуемых в мультиплексной реакции праймердимеров.

2.21. В разных экспериментальных условиях при использовании одной и той же комбинации праймеров возможны отличающиеся результаты, поскольку воспроизводимость анализа варьирует в зависимости от метода экстракции нуклеиновых кислот, реагентов для постановки ПЦР и конкретной марки амплификатора, используемого для проведения реакции. Эмпирическая оптимизация и валидация являются важной частью любого эксперимента с количественной ПЦР, апробацией и внедрением методики в рутинную лабораторную практику [20].

III. Сущность метода

3.1. Сущность предлагаемого метода основана на количественном определении содержания TREC и KREC. Применяется амплификация участков ДНК TREC и KREC с помощью специфических праймеров, гибридизационных зондов и Taq-полимеразы с последующим определением накопления специфического флуоресцентного сигнала на амплификаторе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме реального времени. Для контроля анализа в составе предусмотрены праймеры и флюоресцентно меченые зонды, специфичные для участков генов человека, используемых для эндогенного внутреннего контроля. Эндогенный внутренний контроль позволяет контролировать этапы экстракции ДНК и проведения ПЦР, отсутствие в образце ингибиторов ПЦР, оценивать адекватность взятия и количество материала. С учетом эндогенного контроля происходит пересчет количества копий ДНК TREC и KREC в анализируемом образце.

IV. Средства измерений, реактивы, вспомогательное оборудование и материалы <1>

---

<1> Примечание: допускается использование средств измерений, вспомогательного оборудования и материалов с аналогичными или лучшими характеристиками; допускается использование других реактивов с аналогичными характеристиками.

4.1. Лаборатория, использующая методы амплификации нуклеиновых кислот, в соответствии с этапами проведения анализа включает рабочую зону 1 — для выделения (экстракции) нуклеиновых кислот, рабочую зону 2 — для проведения реакции амплификации и учета результатов амплификации при использовании гибридизационно-флуоресцентного метода детекции.

4.2.1 Зона 1. Оборудование для выделения ДНК из исследуемого материала:

• бокс абактериальной воздушной среды биологической безопасности не ниже II класса биологической защиты;
• микроцентрифуга/вортекс;
• центрифуга лабораторная медицинская настольная с ротором для микропробирок (по типу «Эппендорф» или аналоги) объемом 1,5 — 2 мл до 15000 g, ГОСТ Р 50444-2020;
• твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл с диапазоном рабочих температур от плюс 25 до плюс 100 °C;
• вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой;
• отдельный набор дозаторов лабораторных с фиксированными и переменными объемами доз, одноканальные (объемы 0,5 — 10 мкл, 20 — 200 мкл, 50 — 300 мкл, 100 — 1000 мкл), ГОСТ 28311-2021;
• холодильник с камерами, поддерживающими температуру от плюс 2 до плюс 8 °C и не выше минус 16 °C для хранения образцов крови и медицинской продукции в условиях стабильных и низких температур (для хранения наборов, предназначенных для выделения нуклеиновых кислот), ГОСТ 25336-82;
• холодильник с камерой, поддерживающей температуру от плюс 2 до плюс 8 °C для хранения образцов крови и медицинской продукции в условиях стабильных и низких температур (для хранения препаратов нуклеиновых кислот) ГОСТ 25336-82, не допускается хранение препаратов нуклеиновых кислот в одном холодильнике с компонентами набора для выделения нуклеиновых кислот;

4.2.2 Зона 1. Расходные материалы для выделения ДНК из исследуемого материала:

• микропробирки объемом 1,5 мл типа «Эппендорф» или аналоги;
• одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл;
• одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до 100, 200 и 1000 мкл;
• штативы для наконечников, микропробирок на 1,5 мл;
• емкость с дезинфицирующим раствором;
• халат, шапочки, обувь для зоны 1 и одноразовые перчатки <2>.

---

<2> Пункт 7.2 МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности» (далее — МУ 1.3.2569-09).

• одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

4.2.3 Зона 1. Реактивы для выделения ДНК из исследуемого материала:

Наборы реагентов для обработки клинического материала: комплекты реагентов и тест-систем, зарегистрированные и разрешенные для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <3> для выделения ДНК из сухой капли крови, основанные на лизисе клеток детергентами и сорбции или преципитации нуклеиновых кислот.

---

<3> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий» (далее — постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416); приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий» (зарегистрирован Минюстом России 09.07.2012, регистрационный номер 24852), с изменениями, внесенными приказами Минздрава России от 25.09.2014 № 557н (зарегистрирован Минюстом России 17.12.2014, регистрационный № 35201), от 07.07.2020 № 686н (зарегистрирован Минюстом России 10.08.2020, регистрационный № 59225) (далее — приказ Минздрава России № 4н).

4.3.1 Зона 2. Оборудование для проведения ПЦР и учета результатов:

• бокс абактериальной воздушной среды биологической безопасности не ниже II класса биологической защиты или настольный бокс с бактерицидной лампой (ПЦР-бокс; УФ-бокс);
• холодильник с камерами, поддерживающими температуру от плюс 2 до плюс 8 °C и не выше минус 16 °C для хранения образцов крови и медицинской продукции в условиях стабильных и низких температур, (для хранения наборов, предназначенных для постановки ПЦР) ГОСТ 25336-82;
• микроцентрифуга/вортекс;
• отдельный набор дозаторов лабораторных с фиксированными и переменными объемами доз, одноканальные (объемы 0,5 — 10 мкл, 20 — 200 мкл, 50 — 300 мкл, 100 — 1000 мкл) ГОСТ 28311-2021;
• программируемые планшетные или роторные термоциклеры с функцией амплификации в режиме «реального времени» с наличием 4-х каналов детекции флуоресценции (например, JOE/HEX, FAM/Green, ROX, Cy5).

4.3.2 Зона 2. Расходные материалы для проведения ПЦР:

• одноразовые полипропиленовые микропробирки для амплификации объемом 0,2 мл;
• одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с фильтром до 10 мкл, 100 мкл и 200 мкл, свободные от ДНКаз;

---

<4> Пункт 7.2 МУ 1.3.2569-09.

4.3.3 Зона 2. Реактивы для проведения ПЦР:

Наборы реагентов для постановки ПЦР: ПЦР-тест системы, зарегистрированные и разрешенные для использования на территории Российской Федерации, для выявления уровней TREC и KREC в крови, использующих эндогенный внутренний контроль ингибирования ПЦР и линейку калибраторов для оценки прямой концентрации целевых и контрольных молекул в образце, позволяющей посредством пересчета получить информацию о количестве целевых молекул на клетку.

4.4. Для обеспечения санитарно-эпидемического режима в лаборатории при работе с возбудителями III — IV групп патогенности и для предотвращения контаминации продуктами амплификации используются стандартные дезинфицирующие растворы в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <5>, а также методическими документами <6>.

---

<5> Пункты 140, 206, 213 - 215 главы IV СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).

<6> Приложение 3 МУ 1.3.2569-09.

4.5 Материал для исследований:

• сухие пятна крови на картах Гатри. Для получения сухих пятен крови применяются носители на основе фильтровальной бумаги или целлюлозы, содержащие реагенты для лизирования клеток, денатурации белков и защиты нуклеиновых кислот от нуклеаз, окисления и разрушения ультрафиолетовым излучением;
• цельная кровь (для лиц старше 18 лет), стабилизированная этилендиаминтетрауксусной кислотой (далее — ЭДТА).

V. Условия взятия, транспортирования и хранения образцов

Взятие образцов

5.1 Отбор материала осуществляется в установленном порядке <7>.

---

<7> Приложение № 2 приказа Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185 «О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания» (далее — приложение № 2 приказа Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185).

5.1.1. Для получения сухого пятна крови участок карты пропитывают капиллярной кровью, взятой из пятки новорожденного или пальца пациента старшего возраста. Образовавшееся пятно должно быть в диаметре не менее 2 см. Для увеличения достоверности исследования получают 2 — 3 пятна крови. Образец высушивают на воздухе в горизонтальном положении на чистой обезжиренной поверхности не менее 2 ч без применения дополнительной тепловой обработки и попадания прямых солнечных лучей. Прикасаться к пятну сухой капли крови во избежание контаминации и получения неверных результатов недопустимо <8>. После высыхания карты герметично упаковываются в индивидуальный чистый конверт и в специальной упаковке (например, герметичные металлизированные конверты, пакеты-слайдеры с замком zip lock) с соблюдением температурного режима (от плюс 2 до плюс 8 °C) доставляются для проведения исследований в проводящую обследование лабораторию (центр) — рекомендуется доставка в течение 72 ч <9>.

---

<8> Пункт 8 приложения № 2 приказа Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185.

<9> Пункт 10 приложения № 2 приказа Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185.

5.1.2. У лиц старше 18 лет отбор цельной крови может осуществляться из локтевой вены одноразовой иглой в вакуумные одноразовые пробирки, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетрауксусная дикалиевая или трикалиевая соль (6% ЭДТА), или одноразовым шприцем в пластиковые пробирки с цитратом натрия (раствор цитрата натрия в соотношении 1:9). Пробирку с закрытой крышкой аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом. Нельзя встряхивать пробирку, так как это может вызвать пенообразование и гемолиз. В случае образования сгустка крови, выделение ДНК станет невозможным. Гепарин в качестве коагулянта использовать нельзя. Манипуляции по забору образцов выполняются в соответствии с документами по стандартизации. <10>

---

<10> ГОСТ Р 53079.4-2008 «Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа», введенный приказом Ростехрегулирования от 18.12.2008 № 554-ст (далее — ГОСТ Р 53079.4-2008).

5.2. Образцы (карты Гатри или пробирки с кровью) маркируются, упаковываются и плотно закрываются. Сопроводительная документация, оформленная на каждую пробу, прикладывается отдельно от исследуемого материала в соответствии с документами по стандартизации <11>.

---

<11> ГОСТ Р 55992.2-2014 «Изделия медицинские для диагностики in vitro для флюоресцентного и иммунофлюоресцентного анализа „сухого пятна“ крови новорожденного. Часть 2. Расходные материалы (наборы реагентов) для флюоресцентного и иммунофлюоресцентного анализа „сухого пятна“ крови новорожденного», введенный приказом Росстандарта от 02.04.2014 № 289-ст (далее — ГОСТ Р 55992.2-2008).

Транспортирование образцов

5.3.1. Доставка сухих пятен крови на картах Гатри осуществляется в герметичной упаковке при температурах от минус 20 до плюс 37 °C не более 10 дней, после транспортировки не вскрывать герметичную упаковку до момента достижения комнатной температуры (от плюс 18 до плюс 25 °C) <12> [21 - 23].

---

<12> Приложение № 2 приказа Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185; ГОСТ Р 55992.2-2008.

5.3.2. Образцы цельной крови могут транспортироваться в течение 6 часов при температуре от плюс 2 до плюс 8 °C и в течение 2 ч при температуре от плюс 20 до плюс 25 °C в соответствии с методическими документами <13>. Открывать пробирки с образцами крови до момента доставки их на исследование в клинико-диагностическую лабораторию не допускается <14> [21 - 23].

---

Хранение образцов

---

---

---

VI. Выделение ДНК из биологического материала

Выделение ДНК из сухих пятен крови

6.1. При использовании для выделения ДНК из сухих пятен крови коммерческих наборов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <19>, для экстракции ДНК из указанного материала, основанных на лизисе клеток детергентами и сорбции или преципитации нуклеиновых кислот, процедура выполняется согласно инструкции к набору и в общем виде осуществляется следующим образом:

---

11. поместить пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре плюс 65 °C на 5 мин для подсушивания осадка;
12. добавить в пробирки по 100 мкл элюирующего раствора. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре плюс 60 °C на 10 мин, периодически встряхивая на вортексе;
13. центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит ДНК.

Выделенные образцы ДНК используются для проведения ПЦР, допускается хранение в соответствии с инструкцией используемого набора реагентов для выделения ДНК.

Выделение ДНК из цельной крови

6.2. При использовании для выделения ДНК из цельной крови коммерческих наборов, зарегистрированных и разрешенных для использования на территории Российской Федерации в установленном порядке <20>, основанных на лизисе клеток детергентами и преципитации нуклеиновых кислот, — процедура выполняется согласно инструкции к набору и осуществляется следующим образом:

---

<20> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416; приказ Минздрава России № 4н.

1. перед проведением процедуры выделения ДНК из цельной крови требуется провести лизис эритроцитов с целью удаления гемоглобина, так как гемоглобин ингибирует ПЦР;

2. при необходимости (в случае образования в растворе для лизиса кристаллического осадка) прогреть при температуре плюс 65 °C раствор для лизиса до полного растворения кристаллов;

3. отобрать необходимое количество одноразовых пробирок на 1,5 мл с плотно закрывающимися крышками. Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для лизиса. Промаркировать пробирки;

4. в пробирки с раствором для лизиса внести по 100 мкл подготовленных проб, используя наконечники с аэрозольным барьером;

5. содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, центрифугировать в течение 5 с на микроцентрифуге для удаления капель с внутренней поверхности крышки. Поместить пробирки в термостат на 5 мин при температуре плюс 65 °C;

6. добавить по 400 мкл раствора для преципитации в каждую пробирку, содержимое пробирок перемешать на вортексе;

7. центрифугировать в течение 5 мин при 13000 об/мин;

8. отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок;

9. добавить в пробирки по 500 мкл раствора для первого этапа отмывки, плотно закрыть крышки, осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки вверх дном 3 — 5 раз;

10. центрифугировать при 13000 об/мин в течение 1 — 2 мин на микроцентрифуге;

11. отобрать надосадочную жидкость. Добавить в пробирки по 200 мкл раствора для второго этапа отмывки, плотно закрыть крышки и осторожно промыть осадок, переворачивая пробирки 3 — 5 раз;

12. центрифугировать при 13000 об/мин в течение 1 — 2 мин на микроцентрифуге;

13. удалить надосадочную жидкость. Поместить пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре плюс 65 °C на 5 мин для подсушивания осадка;

14. добавить в пробирки по 50 мкл РНК-буфера. Перемешать на вортексе. Поместить в термостат при температуре плюс 65 °C на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе;

15. центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит ДНК.

Выделенные образцы ДНК используются для проведения ПЦР, допускается хранение в соответствии с инструкцией используемого набора реагентов для выделения ДНК.

VII. Постановка ПЦР

7.1. Постановка ПЦР осуществляется с использованием набора реагентов с одним или двумя эндогенными контролями. Для проведения анализа рекомендуется использовать 10 мкл выделенной ДНК из цельной крови или сухих пятен крови человека.

7.2. В набор реагентов входят следующие смеси: ПЦР-буфер, ПЦР-смесь, калибраторы, K-(отрицательный контроль), готовые к использованию. Если Taq-полимераза не входит в состав ПЦР-буфера, то хранится в морозильной камере при температуре не выше минус 20 °C, реагент готов к употреблению и не требует размораживания. Перед применением все растворы (за исключением Taq-полимеразы) необходимо разморозить при комнатной температуре, аккуратно перемешать и осадить капли с крышки пробирки кратким центрифугированием в течение 1 — 3 с. Компоненты реакционной смеси смешивают непосредственно перед проведением ПЦР-исследования.

7.3. Отобрать необходимое для проведения анализа число пробирок объемом 0,2 мл или стрипированных пробирок, промаркировать и расположить в штативе из расчета, что каждый образец будет анализироваться в двух повторах при использовании набора с одним эндогенным повтором, в одном повторе при использовании набора с двумя эндогенными повторами. Расчет количества микропробирок производится по формуле (1):

Количество микропробирок = (2) n + 1, (1)

где: n — количество исследуемых образцов, включая калибраторы и К-.

7.4. В пробирке объемом 1,5 — 2 мл смешать реагенты для приготовления реакционной смеси из расчета на необходимое число микропробирок. Приготовленную смесь перемешать на вортексе и осадить капли с крышки пробирки кратким центрифугированием (1 — 3 с).

7.5. В каждую микропробирку объемом 0,2 мл внести по 15 мкл реакционной смеси. Неиспользованную смесь утилизировать.

7.6. Внести по 10 мкл калибраторов и контрольных образцов в соответствующие пробирки. В остальные внести по 10 мкл выделенных образцов ДНК. Закрыть крышки пробирок. Перед постановкой в ПЦР-машину рекомендуется осадить капли со стенок пробирок кратким центрифугированием (1 — 3 с). Срок годности приготовленной для работы смеси не более 2 ч.

7.7 Установить пробирки для ПЦР в блок амплификатора.

7.8. Запустить программное обеспечение амплификатора. Открыть созданный ранее шаблон или ввести параметры ПЦР, согласно инструкции набора (см. табл. 1), запустить программу амплификации.

Таблица 1

Условия проведения амплификации и детекции результатов

Цикл	Температура, °C	Время	Измерение флюоресценции	Кол-во циклов
1	2	3	4	5
1	95	15 мин	-	1
2	95	10 сек	-	5
	61	30 сек
	72	15 сек

Продолжение табл. 1

1	2	3	4	5
3	95	10 сек	-	40
	60	30 сек <*>	FAM/Green, R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red,
	72	15 сек	-
Примечание:
<*> — детекция флуоресцентного сигнала.

VIII. Регистрация результатов

8.1. Детекцию продуктов амплификации проводят в режиме реального времени с использованием детектирующего ПЦР-амплификатора, согласно инструкции к прибору.

8.2. Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по трем каналам для набора с одним эндогенным контролем — FAM/Green ( \lambda\text{максимум} поглощения 490 нм, \lambda\text{максимум} флуоресценции 520 нм), R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow ( \lambda\text{максимум} поглощения 520 нм, \lambda\text{максимум} флуоресценции 550 нм) и ROX/Orange ( \lambda\text{максимум} поглощения 580 нм, \lambda\text{максимум} флуоресценции 610 нм). Для набора с двумя эндогенными контролями дополнительно анализируют кривые накопления по каналу Cy5/Red ( \lambda\text{максимум} поглощения 646 нм, \lambda\text{максимум} флуоресценции 662 нм). Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что определяет наличие (или отсутствие) для данной пробы значения порогового цикла Ct.

8.3 В пробах-калибраторах прибор должен фиксировать:

• нарастание сигнала флуоресценции в канале FAM/Green и определять значение порогового цикла Ct в канале FAM/Green;
• нарастание сигнала флуоресценции в канале R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow и определять значение порогового цикла Ct в канале R6G/JOE/HEX/VIC/Yellow;
• нарастание сигнала флуоресценции в канале ROX/Orange и определять значение порогового цикла Ct в канале ROX/Orange;
• нарастание сигнала флуоресценции в канале Cy5/Red и определять значение порогового цикла Ct в канале Cy5/Red.

8.4. По каналам для флуорофора ROX/Orange и (или) Cy5/Red регистрируются сигналы внутреннего контроля. Сигнал по указанным каналам должен регистрироваться в каждом анализируемом образце.

8.5. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (ОКО) и (или) отрицательного контроля ПЦР (К-) по какому-либо каналу получено значение Ct, необходимо повторить исследование для всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК. В этом случае результаты ПЦР в режиме реального времени недостоверны из-за наличия контаминации.

IX. Учет и интерпретация результатов анализа

9.1. На основании значений порогового цикла Ct (пересечение кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, которая устанавливается в середине линейного участка прироста флуоресценции положительного контроля в логарифмической шкале) и исходя из заданных значений калибраторов происходит автоматическое построение калибровочной прямой и расчет значений копий TREC, KREC и генов внутреннего контроля в образце ПЦР.

9.2. Эффективность ПЦР рекомендуется от 95 до 105%. Коэффициент корреляции R2 — не меньше 0,97. Если эти условия не соблюдаются, результат постановки ПЦР считается недостоверным. Рекомендуется перестановка ПЦР для всех проб.

9.3. Количество копий TREC (KREC) рассчитывается на 105 ядросодержащих клеток с учетом одного гена внутреннего контроля по формулам 2, 3:

Количество TREC = (количество копий TREC / количество копий эндогенного контроля) x 200000; (2)

Количество KREC = (количество копий KREC / количество копий эндогенного контроля) x 200000. (3)

9.4. Количество копий TREC (KREC) рассчитывается на 105 ядросодержащих клеток с учетом двух генов внутреннего контроля на соматических хромосомах по формулам 4, 5:

Количество TREC = ((4 * количество копий TREC) / (количество копий эндогенного контроля один + количество копий эндогенного контроля два)) x 100000; (4)

Количество KREC = ((4 x количество копий KREC) / (количество копий эндогенного контроля один + количество копий эндогенного контроля два)) x 100000. (5)

9.5. Количество копий TREC (KREC) рассчитывается на 105 ядросодержащих клеток с учетом двух генов внутреннего контроля, в том числе одного гена внутреннего контроля на соматической хромосоме и одного гена внутреннего контроля на X-хромосоме, по формулам (6) для женского пола, (7) для мужского пола:

C_{10}^{5} = ((4 \times C_{0})/C_{X} + C_{C}) \times 100000 ; (6)

C_{10}^{5} = ((4 \times C_{0})/2C_{X} + C_{C}) \times 100000 , (7)

CX — исходная концентрация гена внутреннего контроля на X-хромосоме в мл образца;

CC — исходная концентрация гена внутреннего контроля на соматической хромосоме в мл образца.

9.6. Полученные результаты сравнивают с пороговыми уровнями TREC и KREC, указанными в паспорте или инструкции используемого набора.

9.7. Для выявленных образцов с отсутствием или снижением уровней TREC и (или) KREC осуществляют подтверждение или опровержение полученного результата. Для этого проводят постановку ПЦР TREC и KREC повторно.

X. Ограничение метода

10.1. Результат анализа может быть не достоверным у пациентов, принимающих препараты моноклональных антител; у пациентов, у которых матери во время беременности принимали иммуносупрессивные препараты, а также у пациентов, прошедших процедуру переливания крови за два месяца и менее до анализа, или получавших препараты крови в течение последних двух — трех месяцев.

10.2. В качестве референсных генов рекомендуется использование генов «домашнего хозяйства», которые присутствуют во всех клетках организма, например, ген, кодирующий гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы человека (англ. hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase — HPRT), ген белковой субъединицы p30 рибонуклеазы P (англ. Ribonuclease P protein subunit p30 — RPP30), кодирующий фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (англ. glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase — GAPDH) или ген, кодирующий \beta - \text{актин} (англ. beta-actin — ACTB).

10.3. Популяционные значения и пороговые уровни TREC и KREC разных тест-систем отличаются не только из-за межпопуляционных отличий анализируемых популяций, но и за счет разных способов подсчета эксцизионных колец, способов выделения ДНК и постановки ПЦР, количества человек в выборке, используемой для определения уровней референсной популяционной нормы. Количество TREC и KREC может зависеть от того, какой референсный ген используют в мультиплексной ПЦР. У недоношенных новорожденных отмечаются ложноположительные случаи выявления ПИД по причине низких значений TREC.

XI. Алгоритм определения концентрации эксцизионных колец у обследуемых

11.1. Алгоритм определения концентрации эксцизионных колец у обследуемых представлен на рис. 1.

Рис. 1. Схема алгоритма определения концентрации эксцизионных колец у обследуемого пациента (новорожденного или взрослого человека)

XII. Использование результатов выявления новорожденных с первичными иммунодефицитами в рамках социально-гигиенического мониторинга с целью прогноза и профилактики инфекционных осложнений ПИД

12.1. Выявление новорожденных с ПИД способствует расширению наших знаний о клиническом и патофизиологическом спектре ПИД при обнаружении больных детей на ранних стадиях заболевания.

Гены иммуноглобулинов и T-клеточных рецепторов состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трем классам: вариабельный (англ. variable, далее — V), привносящий разнообразие (англ. diversity, далее — D) и соединительный (англ. joining, далее — J). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. Объединенная последовательность сегментов V(D)J кодирует вариабельные домены каждой из цепей рецептора или антитела [23]. Механизм формирования рецепторов TCR и BCR, определяющих функциональную активность T- и B-клеток, сопровождается процессом V(D)J реаранжировки генов, представляющим собой механизм соматической рекомбинации ДНК, происходящий на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов и приводящий к формированию антиген-распознающих участков антител, уникальных рецепторов антигена B-клеток и T-клеточного рецептора.

12.2. Комитет экспертов по первичным иммунодефицитам международного союза иммунологических обществ (англ. Primary Immunodeficiency Expert Committee of the International Union of Immunological Societies — PID EC of IUIS) каждые два года предлагает обновленную генотипическую классификацию всех этих заболеваний, что облегчает как исследования, так и выявление ПИД во всем мире. С 2013 года, с целью своевременного выявления и профилактики инфекционных осложнений ПИД дополнительно используется фенотипическая классификация [26], адаптированная для врачей клинических специальностей, на основе клинических и лабораторных особенностей, наблюдаемых у пациентов. В общем виде классификация ПИД выглядит следующим образом:

• иммунодефициты, влияющие на клеточный и гуморальный иммунитет;
• комбинированные иммунодефициты с ассоциированными или синдромальными признаками;
• преобладающий дефицит антител;
• нарушения иммунной регуляции;
• врожденные дефекты числа или функции фагоцитов;
• врожденные или внутренние иммунные дефекты;
• аутовоспалительные нарушения, дефицит комплемента, или ПИД-фенокопии.

12.3 Количественное определение ДНК TREC и KREC рекомендуется:

• при обследовании новорожденных для оценки иммунного статуса с целью прогноза и профилактики инфекционных осложнений;
• для оценки иммунного статуса пациентов с инфекционными заболеваниями;
• лечащим врачом, согласно жалобам и анамнезу пациента/родителей/опекунов пациента;
• для популяционной характеристики при наличии соответствующих ресурсов могут проводиться исследования большего охвата (например, определение популяционных норм в различных географических регионах, у различных рас, в закрытых популяциях).

12.4. Дефекты иммунной системы при ПИД приводят к развитию тяжелых хронических инфекций и воспалительному поражению органов и тканей, повышенной заболеваемости и смертности. Несмотря на редкую встречаемость, тяжесть течения ПИД свидетельствует о необходимости исследований, направленных на изучение их распространенности для ранней профилактики инфекционных осложнений. Согласно результатам программ скрининга, истинная частота ПИД в мире выше прогнозируемой. Например, прогнозируемая частота развития ТКИН в США составляет 1:100000, скринирование более 3 миллионов детей выявило частоту заболевания 1:58000, а частота клинически значимой T-клеточной лимфопении составляет 1:7300 [3].

12.5. Своевременная профилактика инфекционных осложнений ПИД, адекватное выявление и последующая терапия приводят к повышению качества и продолжительности жизни, снижению смертности, позволяют больным достигать взрослого возраста без признаков инвалидизации, вести активный образ жизни, иметь здоровое потомство. Проведение массового обследования новорожденных для обнаружения тяжелой наследственной патологии способствует раннему выявлению первичных иммунодефицитов в целях прогноза и профилактики инфекционных осложнений.

12.6. Генетически обусловленные дефекты иммунной системы относятся к врожденным порокам развития, влияющим на заболеваемость и смертность детского населения. Использование результатов массового обследования на ПИД у новорожденных, знаний о механизме формирования рецепторов TCR и BCR, определяющих функциональную активность T- и B-клеток, и его дефектах, приводящих к развитию заболеваний, обновляющаяся классификация заболеваний, новых данных популяционных, био-медицинских иммуногенетических исследований позволят совершенствовать социально-гигиенический мониторинг в рамках оценки информации о состоянии окружающей среды и определении причинно-следственных связей между состоянием здоровья населения и воздействием на него факторов среды обитания.

Приложение к МР 3.3.0362-24

---

<21> Примечание: нарушения, обнаруживаемые при скрининге TREC, KREC, и результаты скрининга новорожденных на первичный иммунодефицит, перечисленные в приложении к настоящим МР, сформированы на основании научных данных, не являются окончательными и могут быть расширены.

Таблица 1

Нарушения, обнаруживаемые при скрининге TREC и KREC

Низкие уровни TREC	Низкие уровни KREC
1	2
Тяжелый комбинированный иммунодефицит <*> 22q делеционный синдром Комбинированный иммунодефицит Атаксия телеангиэктазия Недостаток DOCK 8 EDA-ID Трисомия 21 Трисомия 18 Синдром Кабуки Синдром CHARGE Синдром Нунана Синдром Якобсена Синдром поломки Неймегена <**> Синдром Фринса Шимке иммуно-костная дисплазия Гипоплазия волос хряща ECC Rac2 дефект Синдром Ренпеннинга TAR Другие хромосомные аберрации, включая делецию 6p, кольцевую хромосому 14, кольцевую хромосому 17, удвоение хромосомы 17p, микроделецию 14q	Тяжелый комбинированный иммунодефицит (T-B-) <**> X-сцепленная агаммаглобулинемия (XГБ) XГБ-подобные расстройства Синдром поломки Неймегена <**>

Продолжение табл. 1

1	2
Вторичные причины снижения
Недоношенность Врожденный порок сердца Хилоторакс Множественные врожденные аномалии Желудочно-кишечные аномалии, включая гастрошизис Водянка Неонатальный лейкоз Материнская аутоиммунная болезнь ВИЧ-инфекция у матери Материнская иммуносупрессия Прием матерью лекарства, включая ритодрин	Материнская иммуносупрессия
Примечание: <*> — за исключением дефицита Zap70, дефицита MHCII и дефицита ADA с поздним началом; <**> — низкие уровни TREC и KREC.

Таблица 2

Результаты проспективных программ скрининга новорожденных на первичный иммунодефицит в различных странах мира

Регион	Период скрининга	Стратегия скрининга	Количество обследованных новорожденных	Выявлены случаи первичного иммунодефицита
1	2	3	4	5
США (10 штатов + Территория Навахо) [17]	2008 — 2013 (5,5 лет)	TREC	3030083	ТКИН (n = 52) - Типичный ТКИН (n = 42) - IL2RG (n = 9) - IL7RA (n = 6) - ADA (n = 5) - RAG1 (n = 4) - JAK3 (n = 3) - DCLRE1C (n = 1) - RAG2 (n = 1) - CD3D (n = 1) - TC7A (n = 1) - синдром Паллистера-Киллиана; тетрасомия 12p (n = 1) - молекулярный дефект неизвестен (n = 6) - генетическое тестирование не завершено (n = 4) - негерметичный ТКИН (n = 10)

Продолжение табл. 2

1	2	3	4	5
				- RAG1 (n = 4) - RMRP (n = 2) - IL2RG (n = 1) - DCLRE1C (n = 1) - молекулярный дефект неизвестен (n = 2)
Тайвань [18]	2010 — 2017 (78 месяцев)	TREC	920398	ТКИН (n = 7) - IL2RG (n = 3) - RAG1 (n = 1) - Молекулярный дефект неизвестен (n = 3) Вариант ТКИН, молекулярный дефект неизвестен (n = 8) EDA-HT (n = 1)
Швеция (Стокгольм) [19]	2013 — 2014 (3 года)	TREC/KREC	89462	ТКИН (n = 2) - дефицит Артемиды) (n = 1) - дефицит ADA (n = 1) атаксия телеангиэктазия (n = 1) CID, молекулярный дефект неизвестен (n = 2)
Израиль [20]	2015 — 2017 (18 месяцев)	TREC	290864	ТКИН (n = 13) - типичный ТКИН (n = 10) - DCLRE1C (n = 3) - IL7RA (n = 2) - RMRP (n = 1) - дефицит лигазы 4 (n = 1) - полный синдром Ди Джорджи (n = 1) - Молекулярный дефект неизвестен (n = 2) - негерметичный ТКИН (n = 3) - DCLRE1C (n = 2) - дефицит MHC2/RFX5 (n = 1) Неопределенный ПИД (n = 6)

НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ

1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».

3. Постановление Правительства Российской Федерации от 22.06.2019 № 797 «Об утверждении Правил заготовки, хранения, транспортировки и клинического использования донорской крови и ее компонентов и о признании утратившими силу некоторых актов Правительства Российской Федерации».

4. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

5. Приказ Минздрава России от 06.06.2012 № 4н «Об утверждении номенклатурной классификации медицинских изделий».

6. Приказ Минздравсоцразвития России от 22.03.2006 № 185 «О массовом обследовании новорожденных детей на наследственные заболевания».

7. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».

8. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».

9. ГОСТ Р 50444-2020 «Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические требования».

10. ГОСТ 28311-2021 «Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний».

11. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры».

12. ГОСТ Р 53079.4-2008 «Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа».

13. ГОСТ Р 55992.2-2014 «Изделия медицинские для диагностики in vitro для флюоресцентного и иммунофлюоресцентного анализа „сухого пятна“ крови новорожденного. Часть 2».

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. Bousfiha A., Moundir A., Tangye S.G., Picard C., Jeddane L., Al-Herz W., Rundles C.C., Franco J.L., Holland S.M., Klein C., Morio T., Oksenhendler E., Puel A., Puck J., Seppänen M.R.J., Somech R., Su H.C., Sullivan K.E., Torgerson T.R., Meyts I. The 2022 Update of IUIS Phenotypical Classification for Human Inborn Errors of Immunity//J. Clin. Immunol. — 2022; — 42(7): p. 1508 — 1520.

2. Jeddane L., Picard C., Al-Herz W., Ailal F., Chatila T., Cunningham-Rundles C., Etzioni A., Franco J.L., Holland S.M., Klein C., Morio T., Ochs H.D., Oksenhendler E., Puck J., Torgerson T.R., Casanova J.L., Sullivan K.E., Tangye S.G. Human Inborn Errors of Immunity: 2019 Update of the IUIS Phenotypical Classification//J. Clin. Immunol. — 2020 — 40(1). — p. 66 — 81.

3. Тузанкина И.А., Каракина М.Л., Власова Е.В. Анализ клинических проявлений дебюта первичных иммунодефицитов у взрослых//Медицинская иммунология. — 2014. — Т. 4, № 16. — С. 367 — 374.

4. Kwan A., Abraham R.S., Currier R., Brower A., Andruszewski K., Abbott J.K., Baker M., Ballow M., Bartoshesky L.E., Bonilla F.A., Brokopp C., Brooks E., Caggana M., Celestin J., Church J.A., Comeau A.M., Connelly J.A., Cowan M.J., Cunningham-Rundles C., Dasu T., Dave N., De La Morena M.T., Duffner U., Fong C.T., Forbes L., Freedenberg D., Gelfand E.W., Hale J.E., Hanson I.C., Hay B.N., Hu D., Infante A., Johnson D., Kapoor N., Kay D.M., Kohn D.B., Lee R., Lehman H., Lin Z., Lorey F., Abdel-Mageed A., Manning A., McGhee S., Moore T.B., Naides S.J., Notarangelo L.D., Orange J.S., Pai S.Y., Porteus M., Rodriguez R., Romberg N., Routes J., Ruehle M., Rubenstein A., Saavedra-Matiz C.A., Scott G., Scott P.M., Secord E., Seroogy C., Shearer W.T., Siegel S., Silvers S.K., Stiehm E.R., Sugerman R.W., Sullivan J.L., Tanksley S., Tierce M.L. 4th, Verbsky J., Vogel B., Walker R., Walkovich K., Walter J.E., Wasserman R.L., Watson M.S., Weinberg G.A., Weiner L.B., Wood H., Yates A.B., Puck J.M., Bonagura V.R. Newborn screening for severe combined immunodeficiency in 11 screening programs in the United States.//JAMA. — 2014. — V. 312, № 7. — P. 729 — 38.

5. Wilson J, Jungner G. The principles and practice of screening for disease.//Geneva: World Health Organization. — 1968.

---