МР 3.1.0288-22. 3.1. Профилактика инфекционных болезней. Идентификация и типирование штаммов бруцелл с использованием молекулярно-биологических методов. Методические рекомендации
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 30.05.2022)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 30 мая 2022 г.
3.1 ПРОФИЛАКТИКА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ МР 3.1.0288-22
I. Область применения
1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее — МР) изложены методы молекулярного типирования Brucella spp. от уровня вида бруцелл до штаммовых различий, позволяющих систематизировать изоляты возбудителей бруцеллеза в соответствии с существующим таксономическим положением:
- определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов;
- определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл на основании рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов;
- определение в геноме штаммов Brucella melitensis генетической мутации по типу вставки или делеции нуклеотидов (англ. INDEL);
- определение видовой принадлежности и молекулярного профиля бруцелл с использованием мультилокусного анализа вариабельного числа тандемных повторов (англ. MLVA);
- определение видовой принадлежности бруцелл методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (англ. MALDI-ToF MS);
- определение молекулярного профиля бруцелл с использованием полногеномного секвенирования.
1.2. МР разработаны с целью совершенствования системы мониторинга за возбудителем бруцеллеза путем внедрения современных молекулярных методов типирования патогенов, филогенетики на основе биоинформационных платформ <1>.
<1> Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения»; Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации»; Указ Президента Российской Федерации от 11.03.2019 № 97 «Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу»; постановление Правительства Российской Федерации от 15.07.1999 № 825 «Об утверждении перечня работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными болезнями и требует обязательного проведения профилактических прививок»; СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500); приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
1.3. МР предназначены для специалистов учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы сотрудниками организаций, осуществляющих работы по углубленной дифференциации и молекулярно-биологическому анализу бруцелл.
II. Общие положения
2.1. Согласно современной классификации микроорганизмов, бруцеллы относятся к домену Бактерии (Bacteria), типу — Протеобактерии (Proteobacteria), классу — Альфа-протеобактерии (Alphaproteobacteria), порядку — Ризобиевые (Rhizobiales), семейству — Brucellaceae, роду — Brucella.
Род Brucella (B.) состоит из 12 самостоятельных видов, различающихся по генетическим, биохимическим, антигенным и вирулентным характеристикам:
- B. melitensis представлен 3 биоварами, основной хозяин — мелкий рогатый скот (козы и овцы);
- B. abortus представлен 7 биоварами, основной хозяин — крупный рогатый скот;
- B. suis представлен 5 биоварами, основные хозяева: свиньи (1, 2, 3 биовары), зайцы (2 биовар), северные олени (4 биовар), мышевидные грызуны (5 биовар);
- B. neotomae, основной хозяин — пустынная кустарниковая крыса;
- B. ovis, основной хозяин — баран;
- B. canis, основной хозяин — собака;
- B. ceti, основной хозяин — китообразные;
- B. pinnipedialis, основной хозяин — ластоногие;
- B. microti, основной хозяин — серая полевка;
- B. inopinata, основной хозяин не установлен;
- B. papionis, основной хозяин — бабуины Papio spp.
- B. vulpis, основной хозяин — обыкновенная рыжая лисица Vulpes vulpes.
2.2. Основные эпидемиологические риски связаны с эпизоотическим неблагополучием по бруцеллезу сельскохозяйственных животных — носителей трех видов возбудителя: B. melitensis, B. abortus, B. suis. Заболевания людей бруцеллезом преимущественно вызывают B. melitensis, B. abortus и B. suis биовары 1 — 4, реже B. canis, B. suis биовар 5, B. neotomae, B. ceti и B. pinnipedialis.
2.3. Идентификация и молекулярное типирование штаммов возбудителя бруцеллеза осуществляется с целью проведения окончательной идентификации, дифференциации видов и биоваров, паспортизации, установления происхождения штаммов для решения задач молекулярной эпидемиологии бруцеллеза, пополнения национального коллекционного фонда штаммов возбудителя бруцеллеза, а также анализа генетического разнообразия (профилирование патогенных биологических объектов территории) и эволюции Brucella spp.
2.4. Выделенные из клинического материала, биоматериала от животных и проб объектов окружающей среды культуры возбудителя бруцеллеза передаются в референс-центр по мониторингу за возбудителем бруцеллеза и центр верификации диагностической деятельности, осуществляющий функцию государственной коллекции Роспотребнадзора для окончательной идентификации и молекулярно-генетического типирования <2>.
<2> МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории». утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации 23.12.2005; МУК 4.2.3010-12 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации 29.03.2012; МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации 10.11.2016.
2.5. Работы по молекулярно-биологическому типированию бруцелл проводятся в соответствии с методическими указаниями, регламентирующими работу с возбудителями особо опасных инфекционных болезней II группы патогенности <3>.
<3> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации 22.12.2009.
2.6. При проведении работ по молекулярно-биологическому типированию бруцелл используется материально-техническое обеспечение, указанное в приложении 1 к настоящим МР.
2.7. Схема идентификации и типирования штаммов бруцелл с использованием молекулярно-биологических методов представлена в приложении 2 к настоящим МР.
III. Подготовка штаммов и выделение ДНК BRUCELLA spp.
3.1. Идентифицируют и типируют только выделенные культуры бруцелл или подозрительные на бруцеллы изоляты.
3.2. Штаммы бруцелл выращивают на бруцеллагаре или аналоге в течение 48 ч при температуре 37 +/- 1 °C.
3.3. Из культур бруцелл или подозрительных изолятов готовят суспензии в 2 мл 0,9%-го раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц, что соответствует 1,7 x 109 м.к./мл для Brucella spp.
3.4. К суспензии добавляют мертиолят натрия до конечной концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием при температуре 56 °C в течение 30 мин. Затем 100 мкл образца переносят в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую лизирующий раствор на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата, в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее — ДНК), и инкубируют в течение 15 минут при температуре 65 °C. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным.
3.5. Выделение ДНК для генетических методов выполняют в соответствии с инструкцией к используемому набору реагентов.
IV. Определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции
Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу Bruce-Ladder
4.1. Для идентификации бруцелл предложен протокол Bruce-Ladder, позволяющий определять виды B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae, B. ceti, B. pinnipedialis и вакцинные штаммы B. abortus S19, B. abortus RB51, B. melitensis Rev1 методом ПЦР-ЭФ [11].
В качестве ДНК-мишеней использованы участки генома: wboA (отсутствует у B. ovis и имеет вставку IS711 у штамма B. abortus RB51), bp26 (вставка IS711 у B. ceti/B. pinnipedialis), отр31 (делеция у B. abortus), BMEI1436-1435 (делеция у B. canis), eryC (делеция у B. abortus S19), rpsL (точечные мутации у B. melitensis Rev1), crp (делеция у B. neotomae), BR0953 (делеция у B. abortus и B. melitensis).
4.2. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 1.
Последовательности праймеров, используемых для протокола Bruce-Ladder
ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.
Для проведения № реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x DreamTaq-буфера (или специфичного буфера для эквивалентной полимеразы), 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл каждого праймера в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,2 x (N + 1) мкл Dream Taq-полимеразы.
В 10 x DreamTaq-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, поэтому, чтобы конечная концентрация ионов магния в реакционной смеси составила 3 мМоль, дополнительно вносят 1 x (N + 1) мкл MgCl2 в концентрации 25 мМоль. Если в составе специфичного буфера для эквивалентной полимеразы ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 3 x (N + 1) мкл MgCl2 в концентрации 25 мМоль.
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 2.
Режим амплификации по протоколу Bruce-Ladder
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 5 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 30 с | 25 |
| Отжиг | 64 | 45 с | |
| Элонгация | 72 | 3 мин | |
| Завершающая элонгация | 72 | 10 мин | 1 |
4.3. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 — 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 — 40 мин.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.
Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 3 и рис. 1.
Определение видовой принадлежности бруцелл по протоколу Bruce-Ladder
Рис. 1. Результаты определения видовой принадлежности бруцелл с помощью системы Bruce-Ladder: M — маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), 1 — B. abortus, 2 — B. melitensis, 3 — B. ovis, 4 — B. suis, 5 — B. canis, 6 — B. neotomae
Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу Suis-Ladder с дополнениями
4.4. Для идентификации всех биоваров B. suis, а также видов B. canis и B. microti предложен протокол Suis-Ladder, основанный на амплификации локусов BMEI1426 (делегирован у B. canis), BMEI1688 (амплифицируется только у B. suis биовары 2 и 4), BR1080 (делегирован у B. suis биовара 2), BMEI0205 (Bruce 11 — содержит тандемные повторы, количество которых отличается у разных биоваров B. suis) [12]. При амплификации локуса BMEI0205 регистрируется образование ампликонов различных размеров: 425 п.н. (6 повторов) у 1 биовара B. suis, 551 п.н. (8 повторов) у 2 биовара, 299 п.н. (4 повтора) у 3 биовара и 614 п.н. (9 повторов) у 4, 5 биоваров. У B. suis 5 биовара возможна амплификация фрагмента локуса BMEI0205 размером 488 п.н. (7 повторов) [13].
4.5. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 4.
Последовательность праймеров, используемых для протокола Suis-Ladder
ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.
Для проведения № реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфера, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл каждого праймера в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,2 — 0,4 x (N + 1) мкл SynTaq-ДНК полимеразы. Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl2. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 2 x (N + 1) мкл MgCl2 в концентрации 25 мМоль.
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 5.
Режим амплификации по протоколу Suis-Ladder
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 7 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 35 с | 30 |
| Отжиг | 63 | 45 с | |
| Элонгация | 72 | 60 с | |
| Завершающая элонгация | 72 | 6 мин | 1 |
4.6. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 — 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 — 40 мин.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.
Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 6 и рис. 2.
Определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл по протоколу Suis-Ladder с дополнениями
Рис. 2. Результаты определения видовой и биоварной принадлежности бруцелл с помощью протокола Suis-Ladder: M — маркер молекулярных масс (100, 200, 300, 500, 700, 1000 п.н.), 1, 2 — B. suis 5 биовар (777/488/278/197 п.н.), 3 — B. suis 1 биовар (777/425/197 п.н.), 4 — B. suis 2 биовар (774/551/278 п.н.), 5 — B. suis 3 биовар (774/299/197 п.н.), 6 — B. suis 4 биовар (774/614/197 п.н.), 7 — B. suis 5 биовар (774/614/278/197 п.н.)
Определение видов и биоваров бруцелл по протоколу AMOS-DEL
4.7. Для идентификации B. abortus (1, 2, 4 и 3, 5, 6, 9 биовары), B. melitensis, B. suis (1 биовар), B. ovis используется протокол AMOS-ERY [14], основанный на определении расположения инсерционной последовательности IS711 в геноме патогена и амплификации фрагмента гена ery, специфичного для всех бруцелл. Для выполнения такой апмлификации используется один универсальный праймер, гомологичный последовательности IS-элемента (PIS 711), а в пару с ним подобраны олигонуклеотиды, комплементарные локусам B. abortus, B. melitensis, B. ovis, B. suis 1 биовара (PBa, PBm, PBo, PBs, DEL 569 соответственно). Предложено исключить из данной системы амплификацию родоспецифичного гена ery и обозначить модификацию AMOS-DEL [13].
4.8. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 7.
Последовательность праймеров, используемых для протокола AMOS-DEL
ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.
Для проведения № реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфер, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,06 x (N + 1) мкл праймеров PBa, PBm, PBo, PBs, DEL569 в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 6 пМоль), 0,25 x (N + 1) мкл праймера PIS711 в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 25 пМоль), 0,4 x (N + 1) мкл Syn-Taq-ДНК полимеразы.
Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl2. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 1,5 x (N + 1) мкл MgCl2 в концентрации 25 мМоль.
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 8.
Режим амплификации по протоколу AMOS-DEL
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 10 мин | 1 |
| Денатурация | 94 | 30 с | 30 |
| Отжиг | 60 | 30 с | |
| Элонгация | 72 | 2 мин | |
| Завершающая элонгация | 72 | 5 мин | 1 |
4.9. Регистрацию результатов ПЦР осуществляют методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 — 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 — 40 мин.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.
Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 9 и рис. 3.
Определение видовой и биоварной принадлежности бруцелл по протоколу AMOS-DEL
Рис. 3. Результаты определения видовой и биоварной принадлежности бруцелл с помощью протокола AMOS-DEL: M — маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), 1 — B. abortus биовары 1, 2, 4 — 498 п.н., 2 — B. abortus биовары 3, 5, 6, 9 — 1700 п.н., 3 — B. melitensis — 731 п.н., 4 — B. suis 1 биовара — 268 п.н., 5 — B. ovis — 976 п.н.
Определение видов бруцелл по протоколу БРУ-ДИФ
4.10. Протокол БРУ-ДИФ позволяет идентифицировать шесть видов бруцелл: B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. ovis, B. neotomae на основании выявления наличия или отсутствия амплификации фрагментов bcsp31, BRA0541, BRA0420, BMEI1426, BMEII0711, BMEI0994 генов [15].
4.11. Для проведения реакции используют праймеры и зонды, представленные в табл. 10.
Последовательность праймеров и зондов, используемых для постановки протокола БРУ-ДИФ
ПЦР проводят в объеме 25 мкл в двух пробирках. В одной пробирке осуществляют реакцию амплификации с праймерами и зондами bcsp31-F, bcsp31-R, bcsp31p, BRA0420-F, BRA0420-R, BRA0420p, BRA0541-F, BRA0541-R, BRA0541p, в другой — с BMEI1426-F, BMEI1426-R, BMEI1426p, BMEII0711-F, BMEII0711-R, BMEII0711р, BMEI0994-F, BMEI0994-R, BMEI0994p.
Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл и в отдельных пробирках подготавливают общую реакционную смесь-1 и реакционную смесь-2, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию в соответствии с табл. 11.
Подготовка реакционных смесей по протоколу БРУ-ДИФ
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени и проводят реакцию в соответствии с режимом, приведенным в табл. 12.
Режим амплификации по протоколу БРУ-ДИФ
| N | Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Для амплификаторов роторного типа | ||||
| 1 | Предварительная денатурация | 95 | 5 мин | 1 |
| 2 | Денатурация | 95 | 30 с | 10 |
| Отжиг | 60 | 30 с | ||
| Элонгация | 72 | 30 с | ||
| 3 | Денатурация | 95 | 20 с | 35 |
| Отжиг | 57 <*> | 20 с | ||
| Элонгация | 72 | 20 с | ||
| Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 57 °C (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange (для красителей FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange указывают в графе Миним. Сигнал значение 5, а в графе Максим. Сигнал значение 10). | ||||
| Для амплификаторов планшетного типа | ||||
| 1 | Предварительная денатурация | 95 | 5 мин | 1 |
| 2 | Денатурация | 95 | 30 с | 45 |
| Отжиг | 57 <*> | 30 с | ||
| Элонгация | 72 | 30 с | ||
| Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 57 °C по каналам FAM, HEX, ROX. | ||||
4.12. Регистрацию и учет результатов ПЦР с РС-1 и РС-2 проводят по отдельности в зависимости от используемого амплификатора.
Для амплификаторов роторного типа устанавливают следующие показатели для каждого канала флуоресценции: «Логарифмическая шкала», «Динамический фон», «Корректировка уклона», «Устранение выбросов» — 10%, порог по каналу FAM — 0,05, JOE — 0,1, ROX — 0,1.
Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов). Учет и интерпретацию результатов проводят для приборов роторного типа в соответствии с табл. 13, для приборов планшетного типа - табл. 14.
Пороговое значение Ct для положительных проб с РС-1 и РС-2 по каналам FAM, JOE/HEX, ROX составляет не более 26 для амплификаторов роторного типа, 38 — для планшетного типа.
Определение видовой принадлежности бруцелл по протоколу БРУ-ДИФ для амплификаторов роторного типа
Определение видовой принадлежности бруцелл по протоколу БРУ-ДИФ для амплификаторов планшетного типа
Определение биоваров B. suis по протоколу Suis-ДИФ
4.13. Протокол Suis-ДИФ позволяет дифференцировать 1/3, 2, 4 и 5 биовары B. suis на основании выявления наличия или отсутствия амплификации фрагментов BR0262, BRA0367, BRA0378, BMEI1683 генов. С помощью протокола Suis-ДИФ исследуют только выделенные культуры бруцелл, идентифицированные как B. suis.
4.14. Для проведения реакции используют праймеры и зонды, представленные в табл. 15.
Последовательность праймеров и зондов, используемых для постановки протокола Suis-ДИФ
ПЦР проводят в объеме 25 мкл в двух пробирках. В одной пробирке осуществляют реакцию амплификации с праймерами и зондами BR0262f, BR0262r, BR0262p, BRA0367del-f, BRA0367del-r, BRA0367del-p, в другой — c BRA0378-f, BRA0378-r, BRA0378-p, BMEI1683-f, BMEI1683-r, BMEI1683-p.
Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл и в отдельных пробирках подготавливают общую реакционную смесь-1 и реакционную смесь-2, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию в соответствии с табл. 16.
Подготовка реакционных смесей по протоколу Suis-ДИФ
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор роторного типа и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 17.
Режим амплификации по протоколу Suis-ДИФ
| N | Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| 1 | Предварительная денатурация | 95 | 5 мин | 1 |
| 2 | Денатурация | 95 | 30 с | 10 |
| Отжиг | 56 | 30 с | ||
| Элонгация | 72 | 10 с | ||
| 3 | Денатурация | 95 | 30 с | 35 |
| Отжиг | 56 <*> | 30 с | ||
| Элонгация | 72 | 10 с | ||
| Примечание: <*> флуоресценцию измеряют при температуре 56 °C (во втором блоке циклирования) по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red (для красителей FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red указывают в графе Миним. Сигнал значение 5, а в графе Максим. Сигнал значение 10). | ||||
4.15. Для реакционной смеси-1 регистрацию флуоресценции осуществляют по каналам FAM и ROX для реакционной смеси-2 — по каналам JOE и Су5.
Устанавливают следующие показатели для каждого канала флуоресценции: «Логарифмическая шкала», «Динамический фон», «Устранение выбросов» — 10%, «Порог» по каналу FAM — 0,05, JOE — 0,1, ROX — 0,1, Су5 — 0,05.
Результаты учитывают на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов). Учет и интерпретацию результатов проводят в соответствии с табл. 18.
Пороговое значение Ct для положительных проб с РС-1 и РС-2 по каналам FAM, JOE, ROX, Су5 составляет не более 26.
Определение биоваров B. suis по протоколу Suis-ДИФ
Определение видов и биоваров бруцелл на основании рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов
4.16. Наибольшей дискриминирующей способностью в отношении видов бруцелл рестрикционный анализ обладал в случае использования ферментов AluI (отр2a, отр2b), EcoRI (отр2a), EcoRV (отр25), HindIII (отр25) [16].
При рестрикции продуктов амплификации локуса отр25 с помощью фермента EcoRV профиль P1 наблюдается у всех видов бруцелл за исключением B. melitensis и B. ovis, профиль P2 у вида B. ovis, а штаммы, относящиеся к виду B. melitensis вовсе не расщепляются рестриктазами. При использовании фермента HindIII с этим же генетическим локусом штаммы B. ovis имеют отличный от других видов рестрикционный профиль (P2).
При рестрикции продуктов амплификации локуса отр2a с помощью фермента EcoRI профиль P1 наблюдается у B. abortus 1, 2, 4 биоваров и R-формы, тогда как у остальных видов патогена и B. abortus 3, 5, 6, 9 биоваров — профиль P2.
При использовании фермента AluI с этим же генетическим локусом штаммы B. abortus 1, 2, 4 биоваров и R-формы имеют профиль P1, B. canis — P3, B. neotomae — P4, у остальных видов и B. abortus 3, 5, 6, 9 биоваров — профиль P2.
При рестрикции продуктов амплификации локуса отр2b с помощью фермента AluI профиль P2 наблюдается у B. ovis, тогда как у остальных видов бруцелл — P1.
4.17. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 19.
Последовательность праймеров, используемых для постановки амплификации с локусами отр2a, отр2b, отр25
ПЦР проводят в объеме 25 мкл. Для проведения реакции амплификации отбирают необходимое количество пробирок объемом 0,5 (0,2) мл и в отдельной пробирке подготавливают общую реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию.
Для проведения № реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл 10 x ПЦР-буфер, 0,2 x (N + 1) мкл смеси дНТФ 25 мМоль (конечная концентрация 0,2 мМоль), 0,14 x (N + 1) мкл соответствующих для каждого фрагмента праймеров в концентрации 100 пМоль/мкл (конечная концентрация 14 пМоль), 0,4 x (N + 1) мкл Syn-Taq-ДНК полимеразы.
Если в ПЦР-буфере содержится 20 мМоль ионов магния, то не требуется дополнительного внесения MgCl2. Если в составе ПЦР-буфера ионы магния отсутствуют, то в состав реакционной смеси вносят 2 x (N + 1) мкл MgCl2 в концентрации 25 мМоль (конечная концентрация 2 мМоль).
Подготовленные смеси тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и вносят по 15 мкл в соответствующие микропробирки. Затем добавляют по 10 мкл подготовленных препаратов ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 20.
Режим амплификации локусов отр2a, отр2b, отр25
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 10 мин | 1 |
| Денатурация | 94 | 30 с | 30 |
| Отжиг | 60 | 30 с | |
| Элонгация | 72 | 2 мин | |
| Завершающая элонгация | 72 | 5 мин | 1 |
4.18. Рестрикцию осуществляют с использованием ферментов быстрого гидролиза FastDigest AluI, EcoRI, Eco32I (EcoRV), работу выполняют в соответствии с инструкциями производителя.
4.19. Регистрацию результатов рестрикции фрагментов отр25, отр2a, отр2b генов осуществляют методом электрофореза в 2 — 3%-м агарозном геле с этидия бромидом (желательно использовать 3%-й агарозный гель, подготовленный с применением высокоразрешающей агарозы) при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 — 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 — 40 мин.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.
Учет результатов проводят по наличию или отсутствию специфических полос рестрицированной ДНК на электрофореграмме в соответствии с табл. 21 и рис. 4 - 6.
Рестрикционные профили разных видов бруцелл при проведении рестрикции локусов отр25, отр2a, отр2b
Рис. 4. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента отр25 рестриктазами EcoRV (А) и HindIII (Б): M — маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), NC — нет рестрикции, характерно для B. melitensis; P1EcoRV-25 — характерен для B. abortus, B. suis, B. canis, B. neotomae; P2EcoRV-25 — характерен для B. ovis, P1HindIII-25 — характерен для B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. neotomae; P2HindIII-25 — характерен для B. ovis
Рис. 5. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента omp2a рестриктазами EcoRI (A) и AluI (Б): М — маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), P1EcoRI-2a — характерен для B. abortus (биовар 1, 2, 4 и R-форма); P2EcoRI-2a — характерен для B. abortus (биовар 3, 5, 6, 9), B. melitensis, B. suis, B. canis, B. neotomae B. ovis; P1AluI-2a — характерен для B. abortus (биовар 1, 2, 4 и R-форма); P2AluI-2a — характерен для B. abortus (биовар 3, 5, 6, 9), B. melitensis, B. suis, B. canis; P3AluI-2a — характерен для B. ovis; P4AluI-2a — характерен для B. neotomae
Рис. 6. Профили рестрикции у штаммов бруцелл фрагмента omp2b рестриктазой AluI: М — маркер молекулярных масс (100, 300, 500, 700, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000 п.н.), P1AluI-2b
- характерен для B. abortus, B. melitensis, B. suis, B. canis, B. neotomae; P2AluI-2b — характерен для B. ovis
V. Генотипирование штаммов B. melitensis методом INDEL-типирования
5.1. К одному из простых и информативных способов типирования штаммов B. melitensis можно отнести метод INDEL-типирования [17].
Методика заключается в выявлении вставок-делеций (INsertion-DELetion) в 10 INDEL-локусах путем определения размера ампликона после ПЦР, что позволяет выявлять индивидуальные различия между штаммами.
5.2. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 22.
Праймеры для амплификации INDEL-локусов B. melitensis
ПЦР проводят в объеме 20 мкл. Для проведения реакции амплификации в пробирке отдельно для каждого локуса подготавливают реакционную смесь, для чего берут реагенты с запасом на одну реакцию. Для проведения № реакций необходимо смешать в пробирке 2,5 x (N + 1) мкл смеси дНТФ, 0,2 x (N + 1) мкл каждого праймера (конечная концентрация 10 пмоль), 0,5 x (N + 1) мкл полимеразы (TaqF), 5 x (N + 1) мкл 5х буфер для полимеразы (+MgCl2) и 1,6 x (N + 1) мкл РНК-элюента.
Готовую смесь вносят по 10 мкл на дно пластиковых пробирок и добавляют 10 мкл выделенной ДНК. Пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 23.
Режим амплификации для INDEL-генотипирования
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 15 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 15 с | 30 |
| Отжиг | 56 | 20 с | |
| Элонгация | 72 | 15 с | |
| Завершающая элонгация | 70 | 5 мин | 1 |
5.3. Учет полученных данных проводят методом электрофореза в 2%-м агарозном геле с этидия бромидом в концентрации 0,5 мкг/мл при следующих параметрах: напряженность электрического поля 6 — 10 В/см, продолжительность электрофореза 30 — 40 мин.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией.
Анализ результатов проводят по наличию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме, затем определяют размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма, сравнивая их с маркером молекулярных масс (рис. 7).
Рис. 7. Электрофореграмма продуктов амплификации штамма B. melitensis C-573 по результатам INDEL-типирования: М — маркер молекулярных масс (100, 200, 300, 500, 700, 1000 п.н.), AM1, AM2 — аллельные маркеры, размер ампликонов исследуемого штамма (п.н.): RS05410 — 86, RS06765 — 98, RS11140 — 80, RS12095 — 88, RS12365 — 76, RS14755 — 91, RS16525 — 72, RS05465 — 61, RS14470 — 84, RS16540 — 78
Определение индивидуального генетического профиля исследуемых штаммов B. melitensis проводят согласно табл. 24.
Размеры INDEL-локусов B. melitensis
5.4. Определение степени генетического родства между изолятами проводят с помощью филогенетического анализа, который отображен графически (рис. 8) в виде дендрограммы (филогенетического дерева).
Рис. 8. Фрагмент дендрограммы штаммов B. melitensis по результатам INDEL-типирования
VI. Генотипирование штаммов BRUCELLA spp. методом MLVA
6.1. Для углубленной идентификации, генетической паспортизации и определения клональности происхождения штаммов бруцелл используют метод MLVA, обладающий высокой дискриминирующей способностью, воспроизводимостью и достоверностью результатов.
Методика основана на сравнительном анализе локусных вариабельных тандемных повторов I и II хромосомы бруцелл и заключается в генотипировании штаммов Brucella spp. путем определения размера ампликона и количества тандемных повторов в VNTR-локусах.
С целью видовой идентификации применяется схема MLVA-8, включающая минисателлитные локусы Bruce 06, Bruce 08, Bruce 11, Bruce 12, Bruce 42, Bruce 43, Bruce 45, Bruce 5. Повышение числа исследуемых локусов придает большую достоверность филогенетическому и эпидемиологическому анализу, в связи с чем для определения клональности происхождения штаммов применяется схема MLVA-16, в которой к вышеописанным добавлены 8 микросателлитных локусов Bruce 04, Bruce 07, Bruce 09, Bruce 16, Bruce 18, Bruce 19, Bruce 21, Bruce 30 [18]. Учет результатов MLVA возможно осуществлять методом гель-электрофореза или микрокапиллярного электрофореза.
6.2. Для проведения реакции используют праймеры, представленные в табл. 25.
Праймеры для амплификации 16 VNTR-локусов Brucella spp.
| VNTR-локус | Forward primer (5' — 3') | Reverse primer (5' — 3') |
| Bruce 4 | CTGACGAAGGGAAGGCAATAAG | CGATCTGGAGATTATCGGGAAG |
| Bruce 6 <*> | ATGGGATGTGGTAGGGTAATCG | GCGTGACAATCGACTTTTTGTC |
| Bruce 7 | GCTGACGGGGAAGAACATCTA | ACCCTTTTTCAGTCAAGGCAAA |
| Bruce 8 <*> | ATTATTCGCAGGCTCGTGATTC | ACAGAAGGTTTTCCAGCTCGTC |
| Bruce 9 | GCGGATTCGTTCTTCAGTTATC | GGGAGTATGTTTTGGTTGTACATAG |
| Bruce 11 <*> | CTGTTGATCTGACCTTGCAACC | CCAGACAACAACCTACGTCCTG |
| Bruce 12 <*> | CGGTAAATCAATTGTCCCATGA | GCCCAAGTTCAACAGGAGTTTC |
| Bruce 16 | ACGGGAGTTTTTGTTGCTCAAT | GGCCATGTTTCCGTTGATTTAT |
| Bruce 18 | TATGTTAGGGCAATAGGGCAGT | GATGGTTGAGAGCATTGTGAAG |
| Bruce 19 | GACGACCCGGACCATGTCT | ACTTCACCGTAACGTCGTGGAT |
| Bruce 21 | CTCATGCGCAACCAAAACA | GATCTCGTGGTCGATAATCTCATT |
| Bruce 30 | TGACCGCAAAACCATATCCTTC | TATGTGCAGAGCTTCATGTTCG |
| Bruce 42 <*> | CATCGCCTCAACTATACCGTCA | ACCGCAAAATTTACGCATCG |
| Bruce 43 <*> | TCTCAAGCCCGATATGGAGAAT | TATTTTCCGCCTGCCCATAAAC |
| Bruce 45 <*> | ATCCTTGCCTCTCCCTACCAG | CGGGTAAATATCAATGGCTTGG |
| Bruce 55 <*> | TCAGGCTGTTTCGTCATGTCTT | AATCTGGCGTTCGAGTTGTTCT |
| Примечание: <*> праймеры для схемы MLVA-8. | ||
Готовую смесь для ПЦР вносят по 10 мкл на дно пластиковых пробирок и добавляют 10 мкл выделенной ДНК. Затем пробирки помещают в амплификатор и проводят ПЦР в соответствии с режимом, приведенным в табл. 26.
Режим амплификации для MLVA-генотипирования
| Цикл | Температура, °C | Время | Количество циклов |
| Предварительная денатурация | 95 | 5 мин | 1 |
| Денатурация | 95 | 30 с | 30 |
| Отжиг | 60 | 30 с | |
| Элонгация | 70 | 60 с | |
| Завершающая элонгация | 70 | 5 мин | 1 |
6.3. Учет результатов MLVA методом гель-электрофореза. Приготовление рабочих растворов и агарозного геля осуществляют в соответствии с инструкцией используемого комплекта реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
В лунки стандартного 3%-го агарозного геля вносят по 10 мкл ПЦР продуктов.
Электрофорез проводят при напряженности электрического поля 10 В/см, время устанавливается эмпирически. Для определения размера аллелей в первую и последнюю лунки геля вносят маркер длин ДНК или ампликоны штаммов возбудителя бруцеллеза, размеры которых ранее определены методом прямого секвенирования.
По окончании электрофореза гель помещают на стекло трансиллюминатора, обрабатывают изображение с помощью программного обеспечения для гель-документирования в соответствии с инструкцией и определяют размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма (рис. 9).
Рис. 9. Электрофореграмма продуктов амплификации локуса Brace 30 штаммов B. abortus: М — маркер молекулярных масс (100, 200, 300, 500, 700, 1000 п.н.), Р — аллельный маркер (142 п.н.)
6.4. Учет результатов MLVA методом микрокапиллярного электрофореза. Приготовление рабочих растворов и подготовку чипа осуществляют в соответствии с инструкцией используемого комплекта реагентов. В качестве маркера длин ДНК используют коммерческий стандарт из набора реагентов для электрофореза.
Разделение фрагментов амплификации и определение размеров полученных ампликонов осуществляется программой прибора автоматически (рис. 10).
Рис. 10. Электрофореграмма продуктов амплификации возбудителя бруцеллеза, полученная с помощью станции микрокапиллярного электрофореза по результатам MLVA-16
6.5. Перевод размеров локусов, полученных в парах нуклеотидов, в число тандемных повторов по каждому из локусов проводится по следующим формулам (где N — длина полученного ампликона, п.н., n — число тандемных повторов) (1):
6.6. Полученные данные сравнивают с существующими базами данных по MLVA-генотипам штаммов Brucella spp.
Определение степени генетического родства между изолятами проводят с помощью филогенетического анализа, который отображен графически (рис. 11) в виде дендрограммы (филогенетического дерева).
Рис. 11. Дендрограмма штаммов Brucella spp. по результатам MLVA-16
VII. Определение видовой принадлежности бруцелл методом MALDI-ToF MS
7.1. Применение метода MALDI-ToF MS для идентификации возбудителя бруцеллеза включает получение белковых экстрактов бруцелл, регистрацию масс-спектров, идентификацию патогена с использованием базы данных.
Методика заключается в измерении отношения массы заряженной частицы (иона) к его заряду. Полученный результат представляет собой совокупность спектральных сигналов заряженных частиц — масс-спектр.
7.2. Культивирование бруцелл осуществляют на бруцеллагаре в течение 48 ч при температуре 37 °C. Микробиологической петлей диаметром 1 мм в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл вносят одну изолированную колонию возбудителя бруцеллеза и ресуспендируют в 300 мкл ультрачистой воды.
7.3. К бактериальной суспензии возбудителя бруцеллеза добавляют 900 мкл 96%-го этилового спирта и перемешивают пипетированием. Полученную смесь инкубируют при температуре 30 °C в течение 90 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 12 000 об./мин. Полученный супернатант, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором. Пробирки с осадком повторно центрифугируют в течение 10 мин при 12 000 об./мин, образовавшуюся надосадочную жидкость отбирают одноразовым наконечником, сливая в емкость с дезинфицирующим раствором.
В пробирку с осадком вносят 100 мкл 70%-го водного раствора муравьиной кислоты и тщательно перемешивают пипетированием. К суспензии добавляют 100 мкл ацетонитрила и смесь повторно тщательно перемешивают. Затем центрифугируют в течение 4 мин на 12 000 об./мин при температуре 10 °C. Проводят контроль специфической стерильности.
7.4. Одну петлю (1 мкл) бактериальной массы эмульгируют в 300 мкл ультрачистой воды в стерильной пластиковой пробирке (объем 1,5/2,0 мл) с винтовой горловиной, снабженной крышкой с кольцевой прокладкой, и плотно закрывают.
Дозатором с одноразовым стерильным наконечником с фильтром отбирают 20 мкл полученной взвеси культуры и переносят в микропробирку 1,5 мл с винтовой горловиной, снабженной крышкой с кольцевой прокладкой, содержащей 80 мкл ТФУ, до конечной концентрации ТФУ в полученном растворе 80% и плотно закрывают.
Полученную смесь перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе 1 мин и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. Проводят контроль специфической стерильности.
7.5. Ионизацию белкового экстракта под воздействием лазера проводят в присутствии \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты. В пластиковую пробирку объемом 1,5 мл вносят 475 мкл ультрачистой воды, 25 мкл 100%-й трифторуксусной кислоты и 500 мкл ацетонитрила до конечного объема 1 мл, тщательно перемешивают.
В чистую пластиковую пробирку объемом 0,5 мл отбирают 250 мкл полученной смеси и вносят в нее 0,05 г \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты. Полученный раствор перемешивают при комнатной температуре до полного растворения внесенных кристаллов кислоты. Затем центрифугируют при 12 об./мин в течение 5 мин.
Приготовленный раствор \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты может храниться при комнатной температуре в течение рабочего дня в темном месте (во избежание ультрафиолетового воздействия).
7.6. Анализ белковых экстрактов бруцелл проводят на металлических пластинах из нержавеющей стали. На пластину наносят 1 мкл супернатанта белкового экстракта бруцелл и высушивают при комнатной температуре в течение 5 мин. После высыхания каждую нанесенную каплю сверху покрывают 1 мкл раствора \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты. Высушивают при комнатной температуре в течение 5 мин.
Для проведения калибровки масс-спектрометра в диапазоне масс 2000 — 20000 наносят на мишень 1 мкл раствора тест-стандарта и высушивают на воздухе в течение 5 мин. Затем сверху наносят 1 мкл раствора \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты и сушат при комнатной температуре в течение 5 мин.
Пластину с нанесенными образцами помещают в масс-спектрометр и проводят калибровку прибора. Для получения одиночного масс-спектра каждого образца используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон масса (заряд) составляет 2000 — 20000 Да. Для каждой капли образца регистрируется исходный спектр, представляющий собой сумму шести одиночных спектров (240 импульсов лазера). Сбор масс-спектров осуществляют в автоматическом режиме.
7.7. Профиль белкового экстракта культуры возбудителя бруцеллеза формируется в виде графика (рис. 12) в декартовой системе, по оси абсцисс которого расположено соотношение массы иона к заряду (m/Z), а по оси ординат — интенсивность (Intensity), и пик-листа (рис. 13), в котором содержится информация о каждом сигнале соответствующего масс-спектра, в частности m/Z, Intensity, R (разрешение сигнала), s/n (отношение сигнал/шум) и др.
Рис. 12. Масс-спектр белкового экстракта культуры возбудителя бруцеллеза
Рис. 13. Пик-лист масс-спектра белкового экстракта культуры возбудителя бруцеллеза
Определение видовой принадлежности бруцелл происходит автоматически в режиме реального времени путем сравнения полученных масс-спектров исследуемого образца с референсными спектрами из имеющейся базы данных (рис. 14).
Заключение о видовой принадлежности бруцелл проводят на основании следующих критериев:
- «Score» >= 2,3 соответствует достоверной идентификации до вида (зеленый цвет);
- «Score» 2,000 — 2,299 соответствует достоверной идентификации до рода и вероятной идентификации до вида (зеленый цвет);
- «Score» 1,7 — 1,999 рассматривается как вероятная идентификация до рода (желтый цвет);
- «Score» менее 1,7 — недостоверный результат (красный цвет).
Рис. 14. Идентификация штаммов бруцелл в режиме реального времени
По итогам установления видовой принадлежности культуры возбудителя бруцеллеза автоматически формируется таксономическое дерево (рис. 15).
Рис. 15. MSP-дендрограмма масс-спектрометрических профилей бруцелл
VIII. Определение молекулярного профиля бруцелл с использованием полногеномного секвенирования
8.1. Максимальную разрешающую способность для генетического типирования бруцелл демонстрирует выявление стабильных одиночных нуклеотидных полиморфизмов при анализе полногеномных последовательностей.
Методика заключается в оценке вариабельности полиморфизмов в локусах с высокой степенью полиморфизма, на основании которой определяются филогенетические взаимосвязи изолятов бруцелл.
8.2. Концентрацию образцов ДНК определяют на флуориметре, в работе используют пробы, содержащие не меньше 500 нг ДНК. Оценку чистоты образцов проводят путем определения отношения A260/280 с использованием спектрофотометра. Значение соотношения A260/280 для чистых образцов ДНК должно находиться в диапазоне 1,8 — 2,0.
8.3. Фрагментацию геномной ДНК бруцелл до длины ~ 400 п.н. проводят физическим методом в системе ультразвуковой обработки. Можно проводить фрагментацию ДНК до требуемой длины с использованием набора реагентов, содержащего ферменты рестрикции.
Контроль длины фрагментов библиотек осуществляют с помощью микрокапиллярного электрофореза, концентрацию ДНК-библиотек определяют с помощью флуориметра.
К полученным фрагментам ДНК путем лигирования присоединяют универсальные олигонуклеотидные адаптеры с известной последовательностью нуклеотидов. Эти адаптеры необходимы для последующей амплификации (гибридизации) библиотеки фрагментов. Все этапы подготовки и обогащения библиотек ДНК проводят по стандартным протоколам производителей наборов реагентов.
8.4. Фрагменты ДНК-библиотеки гибридизируют с адаптерами, иммобилизованными на поверхности микросфер, с использованием системы эмульсионной ПЦР. Процедуру обогащения микросфер выполняют с помощью системы очистки и магнитных частиц. Каждый этап проводят по стандартным протоколам производителя наборов реагентов.
8.5. На этапе секвенирования микросферы, содержащие амплифицированные фрагменты ДНК-библиотек, помещают на чип. Секвенирование проводится путем синтеза комплементарной цепи с детекцией изменения значения pH в лунках чипа, возникающего при присоединении нуклеотида. Изменение pH считывается прибором и преобразуется встроенным программным обеспечением в цифровой сигнал, который в свою очередь преобразуется в буквенную последовательность нуклеотидов.
Все манипуляции выполняются в соответствии со стандартными протоколами.
8.6. Для оценки качества данных секвенирования используют показатель качества «Phred» (Q), который логарифмически связан с вероятностью ошибочного определения нуклеотида (P) и рассчитывается по формуле (2):
Значение показателя качества Q10 соответствует вероятности некорректного определения нуклеотида как 1 из 10 (степень достоверности 90,0%), Q20 как 1 из 100 (степень достоверности 99,0%), Q30 как 1 из 1000 (степень достоверности 99,9%) и т.д. Значение показателя качества Q20 является допустимым или пороговым уровнем для определения достоверности результатов. Каждому нуклеотиду в последовательности соответствует определенный показатель качества, т.е. степень достоверности определения нуклеотида (рис. 16).
На графике, представленном на рис. 16, по оси X откладывается позиция нуклеотида в риде, по оси Y — его качество. Область на графике, окрашенная в зеленый цвет, включает нуклеотиды с высоким качеством (показатель Q от 28 до 50), желтая — с допустимым (показатель Q от 20 до 28), красная область — нежелательным (показатель Q от 0 до 20). Горизонтальная синяя линия показывает среднее значение качества, красная линия внутри каждого желтого блока — медиану.
Рис. 16. Гистограмма оценки качества данных секвенирования штамма B. melitensis И-349
8.7. Низкокачественные риды со средним значением баллов качества Q < 20, а также риды длиной менее 35 нуклеотидов удаляют (рис. 17).
Рис. 17. Гистограмма оценки качества данных секвенирования штамма B. melitensis И-349 после фильтрации
8.8. Сборка генома осуществляется методом картирования на референсный геном. Для работы с геномной последовательностью используют контиги длиннее 500 нуклеотидов.
8.9. Коровый геном штаммов бруцелл получают путем множественного выравнивания изучаемых полногеномных последовательностей против референсного генома штамма соответствующего вида рода Brucella.
Множественное выравнивание выполняют с помощью программного обеспечения, которое позволяет получить матрицу множественного выравнивания геномов, содержащую только гомологичные нуклеотидные последовательности, все паралогичные последовательности исключают из анализа. Проводят поиск единичных нуклеотидных полиморфизмов в полученной матрице выравнивания и для всех обнаруженных определяют координаты расположения в геноме в сравнении с референсным.
Результатом исследования будет филогенетическая реконструкция штаммов Brucella spp. на основе данных полногеномного секвенирования (рис. 18).
Рис. 18. Филогенетическое дерево штаммов B. melitensis, построенное по результатам полногеномного анализа
МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ <4>
<4> Примечание. Допускается использование оборудования, средств измерений, расходных материалов, реактивов, растворов, программного обеспечения с аналогичными или лучшими характеристиками.
1. Оборудование и средства измерения:
- персональная электронно-вычислительная машина (ПЭВМ);
- бокс микробиологической безопасности II класса защиты;
- ПЦР-бокс настольный с рециркуляцией воздуха;
- микроцентрифуга для пробирок объемом 1,5 мл;
- микроцентрифуга-встряхиватель для пробирок объемом 1,5 мл, 0,5 мл и 0,2 мл;
- твердотельный термостат для пробирок объемом 1,5 мл и 0,5 мл;
- вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости;
- амплификатор, адаптированный для пробирок для ПЦР объемом 0,5 мл или 0,2 мл;
- амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени роторного или планшетного типа;
- камера для горизонтального электрофореза;
- источник постоянного тока;
- микроволновая печь для плавления агарозы;
- система гель-документации;
- система микрокапиллярного электрофореза;
- станция подготовки чипов для микрокапиллярного электрофореза;
- времяпролетный масс-спектрометр с матричной лазерной десорбцией/ионизацией;
- система для очистки воды;
- система для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля;
- система ультразвуковой обработки;
- система для проведения эмульсионной ПЦР;
- система обогащения сфер;
- система очистки микросфер;
- система геномного секвенирования с сервером для обработки данных;
- флуориметр;
- спектрофотометр;
- весы прецизионные;
- холодильник от плюс 2 до плюс 8 °C с морозильной камерой не выше минус 16 °C;
- набор автоматических дозаторов переменного объема на 0,5 — 10, 10 — 100, 20 — 200, 100 — 1000 мкл;
- отраслевой стандарт мутности бактериальных взвесей 42-28-85 (10 МЕ);
- пипетки одноразовые пластиковые стерильные, градуированные в индивидуальной упаковке на 1, 2, 5, 10 мл;
- колбы мерные в соответствии с ГОСТ 12738 100, 200, 500, 1000 мл.
- набор чипов для микрокапиллярного электрофореза;
- фильтры ультрамикроцентрифужные поливинилиденфторидные с размером пор 0,2 мкм;
- мишени для масс-спектрометра;
- наконечники с фильтром для механического дозатора 0,1 — 10 мкл, 10 — 100 мкл, 20 — 200 мкл, 100 — 1000 мкл;
- наконечники для механического дозатора без фильтра 0,1 — 10 мкл, 10 — 100 мкл, 20 — 200 мкл, 100 — 1000 мкл;
- штатив «рабочее место» для микропробирок на 1,5 мл, 0,5 мл, 0,2 мл;
- пробирки микроцентрифужные на 0,2 мл, на 0,5 мл, на 1,5 мл;
- петля микробиологическая стерильная одноразовая полипропиленовая, 10 мкл;
- чашки Петри стерильные для микробиологии 94 x 16 мм;
- емкость-контейнер полимерный для обеззараживания материала;
- перчатки неопудренные хирургические резиновые в соответствии с ГОСТ 3-88;
- салфетки нетканые (косметические);
- пробирки бактериологические стеклянные в соответствии с ГОСТ 1770;
- пробки целлюлозные газопроницаемые.
- питательная среда бруцеллагар (pH 7,2 — 7,4);
- фосфатно-солевой буфер (pH 7,4);
- натрий хлорид (хч) в соответствии с ГОСТ 4233;
- дистиллированная вода в соответствии с ГОСТ Р 58144;
- спирт этиловый ректификованный в соответствии с ГОСТ 5962;
- дезинфицирующее средство;
- мертиолят натрия;
- набор для выделения ДНК;
- смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) 25 мМоль;
- РНК-элюент;
- полимераза для ПЦР с «горячим стартом» в комплекте со специфичным буфером;
- Taq-ДНК полимераза в комплекте со специфичным буфером;
- раствор магния хлорида 25 мМоль;
- олигонуклеотидные праймеры и зонды (последовательность олигонуклеотидов представлена в соответствующих разделах);
- ферменты быстрого гидролиза;
- маркер длин ДНК;
- набор реагентов для электрофоретической детекции в агарозном геле;
- набор реагентов для микрокапиллярного электрофореза;
- вода ультрачистая, тип I;
- кислота муравьиная ~ 98%-я;
- ацетонитрил степень чистоты «для ВЭЖХ-МС»;
- \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричная} кислота степень чистоты для масс-спектрометрии;
- трифторуксусная кислота (ТФУ) > 99%;
- бактериальный тест-стандарт для внутренней калибровки масс-спектрометра;
- набор реагентов для фрагментации геномной ДНК;
- набор адаптеров для мультиплексирования;
- набор реагентов для очистки ДНК;
- набор реагентов для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля;
- набор реагентов для определения концентрации библиотеки фрагментов ДНК;
- набор реагентов для проведения клональной амплификации;
- магнитные частицы;
- набор реагентов для секвенирования;
- набор чипов для секвенирования.
- операционная система для ПЭВМ;
- программное обеспечение для визуализации фрагментов нуклеиновых кислот в агарозном в геле;
- программное обеспечение для визуализации фрагментов нуклеиновых кислот на чипе;
- программное обеспечение для построения дендрограммы;
- программное обеспечение для выравнивания последовательностей ДНК и извлечения (идентификации) однонуклеотидных полиморфизмов (SNP);
- программное обеспечение для управления масс-спектрометром;
- программное обеспечение для предварительной оценки интенсивности и разрешения пиков в спектре;
- программное обеспечение для идентификации микроорганизмов при проведении масс-спектрометрии;
- программное обеспечение для поиска и выявления аналитически значимых сигналов (биомаркеров);
- программное обеспечение для оценки качества данных секвенирования;
- программное обеспечение для фильтрации ридов;
- программное обеспечение для сборки геномов;
- программное обеспечение для картирования ридов на референсный геном;
- программное обеспечение для анализа качества сборки геномов;
- программное обеспечение для множественных выравниваний последовательностей против референсного генома.
СХЕМА ИДЕНТИФИКАЦИИ И ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации».
3. Указ Президента Российской Федерации от 11.03.2019 № 97 «Об Основах государственной политики Российской Федерации в области обеспечения химической и биологической безопасности на период до 2025 года и дальнейшую перспективу».
4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.07.1999 № 825 «Об утверждении перечня работ, выполнение которых связано с высоким риском заболевания инфекционными болезнями и требует обязательного проведения профилактических прививок».
5. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
6. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
7. МУ 4.2.2039-05 «Техника сбора и транспортирования биоматериалов в микробиологические лаборатории».
8. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
9. МУК 3.1.7.3402-16 «Эпидемиологический надзор и лабораторная диагностика бруцеллеза».
10. МУК 4.2.3010-12 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики бруцеллеза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней».
11. Lopez-Goni, I. Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species, including the vaccine strains/I. Lopez-Goni, D. Garcia-Yoldi, C.M. Marin, M.J. de Miguel, P.M. Munoz, J.M. Blasco, I. Jacques, M. Grayon, A. Cloeckaert, A.C. Ferreira, R. Cardoso, M.I. Correa de Sa, K. Walravens, D. Albert, B. Garin-Bastuji//Journal of Clinical Microbiology. 2008. Vol. 46, № 10. P. 3484 — 3487.
12. Lopez-Goni, I. New Bruce-ladder multiplex PCR assay for the biovar typing of Brucella suis and the discrimination of Brucella suis and Brucella canis/I. Lopez-Goni, D. Garcia-Yoldi, C.M. Marin, M.J. de Miguel, E. Barquero-Calvo, C. Guzmar n-Verri, D. Albert, B. Garin-Bastuji//Veterinary Microbiology. 2011. Vol. 154. P. 152 — 155.
13. Осина Н.А. Определение видовой принадлежности штаммов бруцелл из фонда Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» с помощью амплификационных и рестрикционных технологий/Н.А. Осина, Ж.А. Касьян, О.Ю. Ляшова, А.В. Осин//Проблемы особо опасных инфекций. 2016. Вып. 4. С. 69 — 74.
14. Ica, T. Conventional and molecular biotyping of Brucella strains isolated from cattle, sheep and human Ankara/T. Ica, F. Aydin, K.S. Gumussoy, D. Percin, A.B. Sümerkan , F. Ocak, S. Abay, H.O. Dogan, A. Findik, A. Ciftci//Univ. Vet. Fak. Derg. 2012. Vol. 59. P. 259 — 264.
15. Патент Российской Федерации на изобретение «Способ определения видовой принадлежности возбудителя бруцеллеза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени»/Касьян Ж.А., Осина Н.А., Касьян И.А.; правообладатель ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора. № RU2621864C1 от 06.07.2017.
16. Cloeckaert, A. Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36 kDa outer-membrane proteins of Brucella/A. Cloeckaert, J.M. Verger, M. Grayon, O. Grepinet//Microbiology. 1995. Vol. 141. P. 2111 — 2.
17. Патент Российской Федерации на изобретение «Способ генетического INDEL-типирования штаммов Brucella melitensis»/Ковалев Д.А., Кузнецова И.В., Сирица Ю.В., Ульшина Д.В., Шапаков Н.А., Бобрышева О.В., Писаренко С.В., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О., Пономаренко Д.Г., Русанова Д.В., Бердникова Т.В., Хачатурова А.А., Евченко А.Ю., Жиров А.М., Жилченко Е.Б., Куличенко А.Н.; правообладатель ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. № 2732425 от 16.09.2020.
18. Fleche, P. Le. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay/P. Le Fleche, I. Jacques, M. Grayon, S. Al Dahouk, P. Bouchon, F. Denoeud, Karsten Nöckler , H. Neubauer, L.A. Guilloteau, G. Vergnaud//Bio. Med Central Microbiol. 2006. Vol. 6 (9). P. 1 — 14.
Методические рекомендации разработаны ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора (А.Н. Куличенко, Д.А. Ковалев, Д.Г. Пономаренко, И.В. Кузнецова, С.В. Писаренко, А.А. Хачатурова, О.В. Бобрышева, Д.В. Ульшина, Д.Е. Лукашевич, А.Н. Германова); ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора (В.В. Кутырев, С.А. Щербакова, Н.А. Осина, Д.А. Ситмбетов, Ж.А. Касьян, И.А. Касьян); ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (С.В. Балахонов, Е.С. Куликалова, Н.Л. Баранникова, Т.О. Таликина).