---
title: "\"Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах\""
issuer: "Государственный агропромышленный комитет СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodika-opredeleniya-nitritov-i-nitratov-v"
---

## "Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах"

# "Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах"

(утв. Госагропромом СССР 18.06.1986)


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждена<br>
Главным управлением<br>
ветеринарии Госагропрома СССР

</div>

18 июня 1986 года

<a id="p100002"></a>**МЕТОДИКА**
**ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ, ОВОЩАХ,**

<div align="center">

**БАХЧЕВЫХ КУЛЬТУРАХ, КРОВИ, ПАТОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ,**<br>
**МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ**

</div>


1. <a id="p100003"></a>Принцип метода

<a id="p100004"></a>Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.
<a id="p100005"></a>Реакция специфична для нитритов.
<a id="p100006"></a>Метод определения нитратов основан на водном извлечении их из исследуемых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем определении нитритов с реактивом Грисса.

2. <a id="p100007"></a>Метрологическая характеристика метода

<a id="p100008"></a>Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень определения нитритов 90 +/- 10%.
<a id="p100009"></a>*Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень определения нитратов 83 +/- 17%.*

<a id="p100010"></a>*3. Реактивы и растворы*

<a id="p100011"></a>*Сульфаниловая кислота, ч.д.а., ГОСТ 5821-69.*
<a id="p100012"></a>*Альфа-нафтиламин, ч.д.а., ГОСТ 8827-57.*
<a id="p100013"></a>*Барий сернокислый, ч.д.а., [ГОСТ 3158-75](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-3158-75).*
<a id="p100014"></a>*Цинковая пыль, порошок цинка.*
<a id="p100015"></a>*Лимонная кислота, х.ч. или ч.д.а., ГОСТ 3652-69.*
<a id="p100016"></a>*Марганец сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 435-67.*
<a id="p100017"></a>*Натрий азотистокислый (NaNO2), х.ч., ГОСТ 4197-66.*
<a id="p100018"></a>*Калий азотнокислый (KNO3), х.ч., ГОСТ 4217-65.*
<a id="p100019"></a>*Сульфаминовая кислота, т.ч., ТУ 6-09-2437-79 или ТУ 6-09-2437-79.*
<a id="p100020"></a>*Уксусная кислота концентрированная (ледяная), ГОСТ 61-69.*
<a id="p100021"></a>*12-процентный водный раствор уксусной кислоты.*
<a id="p100022"></a>*1-процентный водный раствор сульфаминовой кислоты.*
<a id="p100023"></a>*Уголь активированный марки Б или уголь активированный в таблетках (аптечный).*
<a id="p100024"></a>*Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77.*
<a id="p100025"></a>*Цинк сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 4374-77.*
<a id="p100026"></a>*Приготовление реактива Грисса:*
<a id="p100027"></a>*а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты;*
<a id="p100028"></a>*б) 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты.*
<a id="p100029"></a>*Перед употреблением одну часть раствора ["а"](#p100027) смешивают с равной по объему частью раствора ["б"](#p100028). Растворы "а" и "б" хранят отдельно в холодильнике, при необходимости - в течение 6 мес.*
<a id="p100030"></a>    *Приготовление  стандартного раствора нитрита натрия: 0,15 г высушенного*
*до  постоянной  массы  при  температуре  80  °С  NaNO    растворяют  в  1 л*
                                                     *2*
*дистиллированной  воды, свободной от нитритов. 1 мл этого раствора содержит*
*0,1  мг (100 мкг) NO . Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение*
                    *2*
*месяца.*
<a id="p100031"></a>    *Приготовление  рабочего  раствора  нитрита  натрия:  25  мл полученного*
*стандартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до*
*метки дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл*
*его  содержит  0,005 мг (5 мкг) NO . Этот раствор используют для построения*
                                  *2*
*калибровочной кривой.*
<a id="p100032"></a>    *Приготовление  стандартного  раствора  нитрата калия: растворяют 1,63 г*
*нитрата   калия,   высушенного   до   постоянной   массы   при  105  °С,  в*
*дистиллированной  воде  в  мерной  колбе на 1 л и доводят объем раствора до*
*метки   дистиллированной   водой.   1  мл  этого  раствора  содержит  1  мг*
*нитрат-ионов (NO ). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес.*
                *3*
<a id="p100033"></a>    *Приготовление рабочего раствора нитрата калия: в мерную колбу на 100 мл*
*переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем*
*раствора  в  колбе  до метки 12-процентным раствором уксусной кислоты. 1 мл*
*этого  раствора  содержит  0,01  мг  (10  мкг)  NO .  Раствор  должен  быть*
                                                  3
свежеприготовленным.  Этот  раствор используют для построения калибровочной
кривой.
<a id="p100034"></a>Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты:
<a id="p100035"></a>а) барий сернокислый, высушенный при 100 °С до постоянной массы, - 100 г;
<a id="p100036"></a>б) марганец сернокислый, прокаленный при 200 °С в течение часа, - 10 г;
<a id="p100037"></a>в) цинковая пыль - 2 г;
<a id="p100038"></a>г) лимонная кислота - 75 г;
<a id="p100039"></a>д) сульфаниловая кислота - 4 г;
<a id="p100040"></a>е) альфа-нафтиламин - 2 г.
<a id="p100041"></a>Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву ["а"](#p100035) в ступке последовательно добавляют реактивы ["б"](#p100036), ["в"](#p100037), ["д"](#p100039), ["е"](#p100040), ["г"](#p100038) и тщательно перемешивают до получения однообразной массы. Полученный реактив хранят в склянке из темного стекла, он пригоден для использования в течение 2 лет.
<a id="p100042"></a>Приготовление 12-процентного раствора уксусной кислоты: 120 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.
<a id="p100043"></a>Приготовление 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты: 1 г сульфаминовой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.
<a id="p100044"></a>Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия: 20 г NaOH растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой.
<a id="p100045"></a>Приготовление 5-процентного раствора сульфата цинка: 5 г сульфата цинка растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

4. <a id="p100046"></a>Приборы и посуда

<a id="p100047"></a>    Химические  пробирки;  пробирки  с  притертыми  пробками;  центрифужные
пробирки;  пипетки  на  1,  5,  10,  20  мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл;
конические колбы на 100, 250 мл; химические стаканы на 100, 200 мл; мешочки
для диализа или пленка для диализа N  (выпускается картонажными фабриками);
                                    3
цилиндры  на  10, 50 и 100 мл; химические воронки; песочные часы на 2 мин.;
фотоэлектроколориметр;   центрифуга   на  5000  -  6000  об./мин.;  фильтры
обеззоленные среднепористые.
<a id="p100048"></a>Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа помещают на 30 - 40 мин. в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.

5. <a id="p100049"></a>Построение калибровочных кривых

<a id="p100050"></a>Калибровочная кривая для определения нитритов: в 11 химических пробирок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.

<a id="p100051"></a>**ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРИТЫ**


<table>
<colgroup><col width="9%"><col width="17%"><col width="12%"><col width="11%"><col width="9%"><col width="18%"><col width="11%"><col width="12%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">N пробирки</td><td rowspan="2">Количество рабочего раствора, мл</td><td colspan="2">Содержание NO 2</td><td rowspan="2">N пробирки</td><td rowspan="2">Количество рабочего раствора, мл</td><td colspan="2">Содержание NO 2</td></tr>
<tr><td>мг</td><td>мкг</td><td>мг</td><td>мкг</td></tr>
<tr><td>1</td><td>0,1</td><td>0,0005</td><td>0,5</td><td>7</td><td>1,2</td><td>0,006</td><td>6,0</td></tr>
<tr><td>2</td><td>0,2</td><td>0,0010</td><td>1,0</td><td>8</td><td>1,4</td><td>0,007</td><td>7,0</td></tr>
<tr><td>3</td><td>0,4</td><td>0,0020</td><td>2,0</td><td>9</td><td>1,6</td><td>0,008</td><td>8,0</td></tr>
<tr><td>4</td><td>0,6</td><td>0,0030</td><td>3,0</td><td>10</td><td>1,8</td><td>0,009</td><td>9,0</td></tr>
<tr><td>5</td><td>0,8</td><td>0,0040</td><td>4,0</td><td>11</td><td>2,0</td><td>0,010</td><td>10,0</td></tr>
<tr><td>6</td><td>1,0</td><td>0,0050</td><td>5,0</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
</table>


<a id="p100059"></a>Для построения калибровочной кривой через 15 мин. после начала окрашивания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм), кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - дистиллированная вода.
<a id="p100060"></a>Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.
<a id="p100061"></a>Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравнения с опытными пробами.
<a id="p100062"></a>Калибровочная кривая для определения нитратов. Для приготовления шкалы стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12-процентную уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).

<div align="center">

<a id="p100063"></a>**ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРАТЫ**

</div>



<table>
<colgroup><col width="17%"><col width="20%"><col width="14%"><col width="12%"><col width="37%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">N пробирки</td><td rowspan="2">Количество рабочего раствора, мл</td><td colspan="2">- Содержание NO 3</td><td rowspan="2">Количество 1-процентной уксусной кислоты, мл</td></tr>
<tr><td>мг</td><td>мкг</td></tr>
<tr><td>1</td><td>0,0</td><td>0,0</td><td>-</td><td>10,0</td></tr>
<tr><td>2</td><td>1,0</td><td>0,010</td><td>10</td><td>9,0</td></tr>
<tr><td>3</td><td>2,0</td><td>0,020</td><td>20</td><td>8,0</td></tr>
<tr><td>4</td><td>4,0</td><td>0,040</td><td>40</td><td>6,0</td></tr>
<tr><td>5</td><td>6,0</td><td>0,060</td><td>60</td><td>4,0</td></tr>
<tr><td>6</td><td>8,0</td><td>0,080</td><td>80</td><td>2,0</td></tr>
<tr><td>7</td><td>10,0</td><td>0,100</td><td>100</td><td>0,0</td></tr>
</table>


<a id="p100072"></a>Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин. пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. Далее проводят колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм, кюветы - 10 мм, раствор для сравнения - 12-процентный раствор уксусной кислоты, обработанный, как пробы, сухим восстановителем и прошедший центрифугирование, - пробирка N 1.
<a id="p100073"></a>Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси ординат - найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.
<a id="p100074"></a>Эта же шкала стандартов может быть использована для визуальных определений.

6. <a id="p100075"></a>Ход определения

<a id="p100076"></a>Корма. Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску 2 - 10 ч. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диализа. Для этого точно отмеривают 50 - 100 мл дистиллированной воды и используют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в мешочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистиллированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде мешочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) наливают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы полностью погрузить пробу в воду, и оставляют ее для проведения диализа в течение 1,5 - 2 ч. Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.
<a id="p100077"></a>Кровь, органы и ткани животных. Для анализа берут 20 - 50 мл крови, 2 - 10 г органов или тканей животных, помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик, в который наливают соответственно 50 - 100 мл прокипяченной горячей дистиллированной воды. Через 1,5 - 2 ч пипеткой отбирают из стакана 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.
<a id="p100078"></a>Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, анализ следует проводить после удаления пигментов или мути. Пигменты, окрашивающие диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 активированным углем. Уголь на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходимости проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски диализата.
<a id="p100079"></a>При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. Для этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик или колбу, добавляют 10 - 20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.
<a id="p100080"></a>В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося в первом стаканчике (20 мл), и объема фильтрата, измеренного после осаждения белков и фильтрования.
<a id="p100081"></a>Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (ЗЦМ). Отбирают 20 - 50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5 - 2 ч отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят анализ, как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20 - 30 мл диализата, добавляют 10 - 20 мл смеси 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.
<a id="p100082"></a>Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального объема диализата, оставшегося в первом стакане и измеренного после фильтрования объема.
<a id="p100083"></a>Сухого молока, ЗЦМ для анализа берут 2 - 5 г, помещают в пленку для диализа, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды, приливают туда 2 - 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 - 100 мл горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5 - 2 ч. При расчете общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачивания пробы.

<div align="center">

<a id="p100084"></a>Анализ проводят, как описано для проб молока.

</div>

<a id="p100085"></a>Обрата для анализа берут 20 - 50 мл, приливают к нему 20 - 50 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают в течение 10 мин. и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть или опалесценция, необходимо проводить осаждение белков, как указано выше.
<a id="p100086"></a>Картофель, сахарная свекла, огурцы, капуста, лук, редька и другие овощи и бахчевые культуры, дающие с водой неокрашенные растворы. После измельчения проб берут навеску 2 - 10 г, помещают в колбу и заливают 50 - 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают в течение 10 - 15 мин. и отбирают аликвотные количества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окраску, проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный уголь, как описано выше.

7. <a id="p100087"></a>Проведение определения

<a id="p100088"></a>После того как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нитриты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор ["а"](#p100027) смешивают с раствором ["б"](#p100028) в равных объемных частях), встряхивают содержимое пробирки и через 15 мин. после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
<a id="p100089"></a>Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, приливают туда же 5 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.
<a id="p100090"></a>В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и наливают 10 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 2 мин. (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.
<a id="p100091"></a>Через 10 мин. переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5 - 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого проводят колориметрирование проб на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм, кюветы с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют "холостой" раствор - раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем, как описано выше.
<a id="p100092"></a>В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов - свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 - 4 мл 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.
<a id="p100093"></a>После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кривым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.
<a id="p100094"></a>Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровочной кривой, необходимо повторить определение, взяв меньшее аликвотное количество диализата для анализа, например 0,1 мл, и довести анализируемый объем до 10 мл 12-процентной уксусной кислотой. Далее провести анализ, как указано выше, учитывая при расчетах разведение этого раствора.
<a id="p100095"></a>Однако если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и увеличивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после проведения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов прибавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой, еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в течение часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном случае в 2 раза, т.е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.

8. <a id="p100096"></a>Расчет результатов анализа

<a id="p100097"></a>Расчет результатов анализа проводят по формуле:

                                    В х У

<div align="center">

                                         1

</div>

<a id="p100098"></a>                                Х = ------,
                                    А х У
                                         2

    где:
<a id="p100099"></a>    Х  -  содержание  нитритов  (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат-ионов),
мг/кг;
<a id="p100100"></a>    В   -   содержание   нитрит-ионов   или   нитрат-ионов,   найденных  по
соответствующим калибровочным кривым, мкг;
<a id="p100101"></a>    А - навеска анализируемого образца, г;
<a id="p100102"></a>    У  - общий  объем  фильтрата,  мл (соответственно 50, 100 мл или другие
     1
объемы с учетом разведений);
<a id="p100103"></a>    У    -   объем   фильтрата,  взятый  для  анализа,  мл  (5  или  10  мл
     2
соответственно).
<a id="p100104"></a>Поскольку при диализе однородная равновесная концентрация минеральных солей устанавливается во всем объеме раствора (в стакане и в растворе в диализном мешочке), при расчете принимается во внимание весь взятый для анализа объем раствора или дистиллированной воды для анализа.

<div align="center">

<a id="p100105"></a>**КОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТГЕМОГЛОБИНА**<br>
**В КРОВИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ**

1. <a id="p100106"></a>Принцип метода

</div>


<a id="p100107"></a>Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.

<a id="p100108"></a>*2. Реактивы и растворы*

<a id="p100109"></a>*Аммиак водный (NH4OH), ГОСТ 3760-64.*
<a id="p100110"></a>*Калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная), ГОСТ 4206-65.*
<a id="p100111"></a>*Гепарин (25000 ед.).*
<a id="p100112"></a>*Трилон Б (комплексон III, хелатон, двунатриевая соль ЭДТА - двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).*
<a id="p100113"></a>*0,25-процентный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды. Раствор трилона Б готовят путем растворения 50 г препарата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80 °С до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр N 3 или 4 или через 4 слоя фильтровальной бумаги.*

<a id="p100114"></a>*3. Приборы и посуда*

<a id="p100115"></a>*Химические пробирки.*
<a id="p100116"></a>*Пипетки на 1, 10 мл.*
<a id="p100117"></a>*Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром N 3 или 4.*
<a id="p100118"></a>*Фотоэлектроколориметр.*

4. <a id="p100119"></a>Подготовка проб к анализу

<a id="p100120"></a>Для анализа у исследуемых животных берут по 1 - 2 мл крови, помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2 - 3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.
<a id="p100121"></a>Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2 - 4 °С.

<div align="center">

<a id="p100122"></a>Перед исследованием кровь тщательно перемешивают.

</div>


5. <a id="p100123"></a>Ход анализа

<a id="p100124"></a>В 2 химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25-процентного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка N 2) добавляют 1 - 2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 мин. обе пробирки, а затем определяют величину светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака.
<a id="p100125"></a>    В  первой  пробирке  (пробирке N 1) определяют величину светопоглощения
раствора  крови  с  исходной концентрацией оксигемоглобина  или, что то же,
гемоглобина,  во  второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора
крови,  в  которой  весь  оксигемоглобин  (HbO )  превращен в метгемоглобин
                                              2

<div align="center">

(МтHb).

</div>

<a id="p100126"></a>Как отмечено выше, содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.
<a id="p100127"></a>Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка N 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

6. <a id="p100128"></a>Колориметрирование проб

<a id="p100129"></a>Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре. У ФЭК различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК-56 при работе с красным светофильтром N 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотоэлектроколориметров ФЭК-56 ПМ и ФЭК-КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 - 670 нм.
<a id="p100130"></a>Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят с использованием ФЭК различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.
<a id="p100131"></a>    Различия,  связанные  с  измерением   экстинций   растворов  крови  при
различающихся  длинах волн при работе на ФЭК различных марок, корригируются
путем  введения  в  расчетную  формулу  коэффициента - величины приведенной
экстинции  раствора  крови  с  исходным  уровнем  оксигемоглобина  (Е  HbO
                                                                          2
привед.), как показано в разделе, - расчет результатов анализа. При расчете
этой  приведенной  величины  используют  измеренные  опытным путем величины
светопоглощения  раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HbO )
                                                                         2
-  пробирка  N  1  и  величины  светопоглощения раствора крови с предельным
содержанием метгемоглобина (Е МтHb) - пробирка N 2.

7. <a id="p100132"></a>Расчет результатов анализа

<a id="p100133"></a>    Предварительно  опытным  путем  на  большой  группе животных двух видов
установлена  средняя  величина  светопоглощения  раствора  крови с исходным
уровнем   оксигемоглобина  (Е  HbO )  и  средняя  величина  светопоглощения

<div align="center">

                                  2

</div>

раствора  крови  с полученным  уровнем  метгемоглобина (Е МтHb) для  овец и
коров.
<a id="p100134"></a>    В  пробах  крови  овец  первая величина (Е HbO ) составила 0,15, вторая
                                                  2
(Е МтHb) - 0,57;  для  крупного  рогатого  скота  эти  величины  составляют
соответственно 0,17 и 0,79.
<a id="p100135"></a>Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57 - 0,15) для овец и 0,62 (0,79 - 0,17) для крупного рогатого скота, соответствует 100% содержания метгемоглобина.
<a id="p100136"></a>Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.
<a id="p100137"></a>По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка N 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка N 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

<a id="p100138"></a>                 Х = (Е  - Е ) х 2,38 х 100 (1) для овец,
                       2    1

<a id="p100139"></a>        Х = (Е  - Е ) х 1,61 х 100 (2) для крупного рогатого скота,
              2    1

    где:
<a id="p100140"></a>    Х - содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %;
<a id="p100141"></a>    Е  - приведенное  значение   светопоглощения  раствора  оксигемоглобина
     2
(Е HbO ), расчет его приводится ниже;
      2
<a id="p100142"></a>    Е   -   среднее    значение    величины    светопоглощения     раствора
     1
оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота;
<a id="p100143"></a>    2,38 и 1,61 - расчетные  коэффициенты,  найденные  из  средних  величин
светопоглощения  растворов  оксигемоглобина  и  метгемоглобина  для  овец и
крупного рогатого скота (расчет их также приводится далее).
<a id="p100144"></a>    Значение   Е    -   приведенное   значение   светопоглощения   раствора
                2
оксигемоглобина  (Е  HbO   =  Е )  -  находят из пропорции с использованием
                        2      2
измеренных  величин  светопоглощения  раствора крови с исходным содержанием
оксигемоглобина (пробирка N 1) и метгемоглобина (пробирка N 2) в опыте.

                       Е    Е               Е  х Е
                        2    4               3    4
<a id="p100145"></a>                       -- = --, откуда Е  = -------,
                       Е    Е           2      Е
                        3    5                  5

    где:
<a id="p100146"></a>    Е   -  искомая  величина  -  приведенное  значение оптической плотности
     2
раствора оксигемоглобина;
<a id="p100147"></a>    Е   -  среднее  значение  оптической плотности раствора метгемоглобина,
     3
соответственно 0,57 для овец для расчета Е в [формулу (1)](#p100138) и 0,79 для
                                                2
крупного рогатого скота в [формулу (2)](#p100139);
<a id="p100148"></a>    Е   - измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина
     4
(пробирка N 1);
<a id="p100149"></a>    Е   -  измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина
     5
(пробирка N 2).
<a id="p100150"></a> Значение Е подставляют в [формулу (1)](#p100138) или [(2)](#p100139) для расчета содержания
               2
метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.
<a id="p100151"></a>    Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина
(Е )  будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора
  2
оксигемоглобина (Е в [формулах N 1](#p100138) и [2](#p100139)), что объясняется индивидуальными
                   1
колебаниями  содержания  гемоглобина  в  крови, содержание метгемоглобина в
крови  в  этом  случае  будет  равно  или  меньше  2,38 для овец и 1,61 для
крупного рогатого скота.
<a id="p100152"></a>Коэффициенты 2,38 и 1,61 были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

    100 х 0,01         100 х 0,01
<a id="p100153"></a>    ---------- = 2,38, ---------- = 1,61,
       0,42               0,62

<a id="p100154"></a>где:
<a id="p100155"></a>0,42 - изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 - 0,15), соответствующее 100-процентному содержанию метгемоглобина в крови овец;
<a id="p100156"></a>0,01 - наименьший показатель оптической плотности, т.е.:

<a id="p100157"></a>0,42 - 100
0,01 - Х.

<a id="p100158"></a>Подобным образом рассчитан коэффициент для крупного рогатого скота.

<div align="center">

<a id="p100159"></a>**ФОТОКОЛОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ГЕМОГЛОБИНЦИАНИДНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ**<br>
**МЕТГЕМОГЛОБИНА КРОВИ ЖИВОТНЫХ, В ТОМ ЧИСЛЕ ПТИЦЫ**

</div>


<a id="p100160"></a>Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.
<a id="p100161"></a>Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержащегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемоглобина) вследствие перевода его в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) и вычисления процентного соотношения этой величины к такому же показателю 100-процентного метгемоглобина того же раствора крови.
<a id="p100162"></a>    Принцип  определения  -  фотоколориметрический  по  прямому определению
                                                            630
(установлению) величины уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора
крови в одной кювете.
<a id="p100163"></a>Погрешность метода - не более 0,075% при нормальном и 0,227% при 71,1-процентном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.
<a id="p100164"></a>Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не более 0,3%.

1. <a id="p100165"></a>Оборудование, реактивы и растворы


#### <a id="p100166"></a>1.1 Оборудование:

<a id="p100167"></a>колориметр-нефелометр фотоэлектрический типа ФЭК-56 М или другие приборы подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625 - 670 нм;
<a id="p100168"></a>центрифуга лабораторная на 4 - 8 тыс. об./мин. типа ЦЛН-2 или ЦУМ-1 и др.;
<a id="p100169"></a>колбы мерные вместимостью 25 куб. см;
<a id="p100170"></a>пипетки на 1, 5 и 10 куб. см;
<a id="p100171"></a>стаканчики стеклянные на 50 куб. см;
<a id="p100172"></a>пипетки глазные;
<a id="p100173"></a>палочки стеклянные или пластмассовые.

#### <a id="p100174"></a>1.2 Реактивы и растворы:

<a id="p100175"></a>ацетонциангидрин по ТУ 6-09-3558-81 или ГОСТ 13198-77, 10-процентный раствор (объем/объем). Годен до 1 года;
<a id="p100176"></a>вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;
<a id="p100177"></a>калий железосинеродистый (соль красная кровяная) по [ГОСТ 4206-75](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-gost-4206-75), х.ч., 10-процентный раствор. Годен 30 дней при хранении в темном месте.

2. <a id="p100178"></a>Подготовка к анализу


#### <a id="p100179"></a>2.1 Приготовление раствора крови.

<a id="p100180"></a>2.1.1. Из сгустка крови. От свежего трупа животного (в том числе птицы) или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток крови массой около 1 г, добавляют 9 куб. см воды и сгусток тщательно разминают чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают 15 куб. см воды.
<a id="p100181"></a>2.1.2. Из цельной крови. В мерную колбу на 25 куб. см наливают около 20 куб. см воды, 1 куб. см (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз содержимым колбы (избегая образования пены), объем гемолизата эритроцитов в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови в 25 раз).
<a id="p100182"></a>2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови переносят в капроновые центрифужные патроны, центрифугируют 15 - 20 мин. при 8 тыс. об./мин. и исследуют не позднее 1 ч после центрифугирования.

3. <a id="p100183"></a>Проведение анализа

<a id="p100184"></a>3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 нм. В левый кюветодержатель помещают 10-миллиметровую кювету с водой, а в правый - такую же кювету с 4 куб. см центрифугата раствора крови и устанавливают правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале). Открывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.
<a id="p100185"></a>    В кювету с раствором крови вносят одну каплю раствора ацетонциангидрина
(АЦГ)  и  перемешивают  содержимое  кюветы  стеклянной  палочкой.  При этом
взаимодействие  метгемоглобина  с  АЦГ  с  образованием  цианметгемоглобина
заканчивается  через 2 - 3 мин. Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора
АЦГ  открывают  световое  окно  прибора  и  правым  измерительным барабаном
устанавливают  стрелку  микроамперметра  на  ноль. По красной шкале правого
                                                                     630
барабана отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности (Д  ДЕЛЬТА)
                                                                  1
раствора крови.
<a id="p100186"></a>3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4 - 5 раз тщательно промывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 куб. см раствора крови, наливают 4 куб. см того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержатель. К раствору крови в кювете добавляют одну каплю 10-процентного раствора красной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в метгемоглобин.
<a id="p100187"></a>Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не открывая светового окна) устанавливают на отметку 0,4 - 0,6 по красной шкале. Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают стрелку микроамперметра на ноль.
<a id="p100188"></a>К раствору крови в кювете прибавляют одну каплю раствора АЦГ, содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый барабан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна).
<a id="p100189"></a>    Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно
и  устанавливают  правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра на
ноль.  По  красной  шкале  правого  барабана  снимают показатель уменьшения
                           630
оптической  плотности (Д  ДЕЛЬТА) раствора крови, в котором весь гемоглобин
                        2

<div align="center">

был переведен в метгемоглобин.

</div>


4. <a id="p100190"></a>Обработка результатов


#### <a id="p100191"></a>4.1 Долю метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту) крови вычисляют по формуле:


                                     630
                                 Д  ДЕЛЬТА х 100
                                  1
<a id="p100192"></a>                         MetHb = ---------------,
                                        630
                                    Д  ДЕЛЬТА
                                     2

    где:
        630
<a id="p100193"></a>    Д  ДЕЛЬТА - показатель  уменьшения  оптической плотности раствора крови
     1
после прибавления АЦГ;
        630
<a id="p100194"></a>    Д  ДЕЛЬТА - показатель  уменьшения оптической плотности 100-процентного
     2

<div align="center">

метгемоглобинового раствора крови после прибавления АЦГ.

</div>


5. <a id="p100195"></a>Оценка результатов

<a id="p100196"></a>5.1. Для постановки диагноза при отравлении животных и птицы метгемоглобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемоглобину является решающим диагностическим показателем.
<a id="p100197"></a>Обнаружение в крови более 30% метгемоглобина указывает на возможность отравления, а более 60% - на возможную причину падежа животного от отравления метгемоглобинобразующими веществами (ядами).
<a id="p100198"></a>5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5%) метгемоглобина исключает потребность проведения химико-токсикологических исследований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, бертолетову соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо патматериал исследовать на нитраты.



<a id="p100199"></a>

---