---
title: "\"МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания\""
number: "МУК 4.1.3604-20"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodika-muk-4-1-3604-20"
---

## "МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"

# "МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 29.07.2020)


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
29 июля 2020 года


#### <a id="p100002"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100003"></a>**МЕТОДИКА**
**ИЗМЕРЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ НАТАМИЦИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ**
**МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**
**С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3604-20**

<a id="p100005"></a>Методические указания разработаны ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, А.А. Константинов, И.П. Семенова, В.В. Бояркина, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова).

<a id="p100006"></a>I. Общие положения и область применения

<a id="p100007"></a>1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок определения массовой доли натамицина в пищевой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее - ВЭЖХ-МС/МС) в диапазоне измерений от 0,001 до 1 мг/кг.
<a id="p100008"></a>1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.
<a id="p100009"></a>1.3. Натамицин - полиеновый амфотерный макролидный антибиотик с противогрибковыми свойствами. Натамицин оказывает противогрибковое действие, связываясь со стеринами в клеточной мембране грибка, тем самым увеличивая проницаемость мембраны.
<a id="p100010"></a>Общепринятое название: натамицин.
<a id="p100011"></a>(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-{[(2R,3S,4S,5S,6R)-4-амино-3,5-дигидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-1,3,26-тригидрокси-12-метил-10-оксо-6,11,28-триоксатрицикло[22.3.1.05,7]октакоза-8,14,16,18,20-пентаен-25-карбоновая кислота.

<a id="p100012"></a> ![рис. 1](https://i.bukva.ai/nXGW62V7/img_0.png) 

<a id="p100013"></a>Рис. 1. Структурная формула натамицина

<a id="p100014"></a>Эмпирическая формула: C<sub>33</sub>H<sub>47</sub>NO<sub>13</sub>, молекулярная масса: 665,7.
<a id="p100015"></a>Цвет: белые кристаллы.
<a id="p100016"></a>Чувствителен к ультрафиолету и быстро деградирует на свету.
<a id="p100017"></a>Константа диссоциации в 50% водном 2-метоксиэтаноле (pKa1) - 4,6; (pKa2) - 8,35.
<a id="p100018"></a>Точка плавления - темнеет при +/- 200 °C, разлагается при 280 - 300 °C.
<a id="p100019"></a>Растворимость в воде: 4100 мг/дм3 (при 21 °C). Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при 25 °C): Kow log P = 0,88.

#### <a id="p100020"></a>1.4 МУК носят рекомендательный характер.


<a id="p100021"></a>II. Метод измерений

<a id="p100022"></a>2.1. Метод основан на определении натамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора типа тройной квадруполь после экстракции натамицина из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.
<a id="p100023"></a>Количественное определение остаточного содержания натамицина проводят методом внутреннего стандарта по площадям хроматографических пиков с помощью градуировочной характеристики, полученной при анализе градуировочных растворов в аналогичных условиях.

<a id="p100024"></a>III. Метрологические характеристики

<a id="p100025"></a>3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (по [ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-4-2002)).

<a id="p100026"></a>Таблица 1

<a id="p100027"></a>Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного
контроля точности, повторяемости, воспроизводимости
для натамицина


<table>
<colgroup><col width="16%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="14%"><col width="16%"><col width="14%"><col width="16%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100028"></a>Анализируемый объект</td><td><a id="p100029"></a>Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг</td><td><a id="p100030"></a>Показатель точности (границы относительной погрешности), $\pm \delta$ , %, P = 0,95</td><td><a id="p100031"></a>Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), $\sigma_{r}$ , %</td><td><a id="p100032"></a>Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), $\sigma_{R}$ , %</td><td><a id="p100033"></a>Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %</td><td><a id="p100034"></a>Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, %,<br>(P = 0,95)</td></tr>
<tr><td><a id="p100035"></a>Рыбная продукция</td><td rowspan="5"><a id="p100036"></a>0,001 - 1,000</td><td><a id="p100037"></a>30</td><td><a id="p100038"></a>4,4</td><td><a id="p100039"></a>6,2</td><td><a id="p100040"></a>12</td><td><a id="p100041"></a>17</td></tr>
<tr><td><a id="p100042"></a>Молочная продукция</td><td><a id="p100043"></a>25</td><td><a id="p100044"></a>2,2</td><td><a id="p100045"></a>3,1</td><td><a id="p100046"></a>6</td><td><a id="p100047"></a>9</td></tr>
<tr><td><a id="p100048"></a>Мясопродукты</td><td><a id="p100049"></a>30</td><td><a id="p100050"></a>5,7</td><td><a id="p100051"></a>8,0</td><td><a id="p100052"></a>16</td><td><a id="p100053"></a>2</td></tr>
<tr><td><a id="p100054"></a>Икра</td><td><a id="p100055"></a>27</td><td><a id="p100056"></a>3,8</td><td><a id="p100057"></a>5,3</td><td><a id="p100058"></a>11</td><td><a id="p100059"></a>15</td></tr>
<tr><td><a id="p100060"></a>Кондитерские изделия</td><td><a id="p100061"></a>25</td><td><a id="p100062"></a>2,2</td><td><a id="p100063"></a>3,1</td><td><a id="p100064"></a>6</td><td><a id="p100065"></a>9</td></tr>
</table>


<a id="p100066"></a>Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

<a id="p100067"></a>Таблица 2

<a id="p100068"></a>Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение,
доверительный интервал среднего результата для всего
диапазона измерений (n = 20)


<table>
<colgroup><col width="23%"><col width="13%"><col width="19%"><col width="13%"><col width="13%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100069"></a>Показатель</td><td colspan="5"><a id="p100070"></a>Метрологические параметры, P = 0,95, <sub>n</sub> = 20</td></tr>
<tr><td><a id="p100071"></a>Предел обнаружения, мг/кг</td><td><a id="p100072"></a>Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг</td><td><a id="p100073"></a>Полнота извлечения вещества, %</td><td><a id="p100074"></a>Стандартное отклонение, %</td><td><a id="p100075"></a>Доверительный интервал среднего результата, +/-, %</td></tr>
<tr><td colspan="6"><a id="p100076"></a>Пищевая продукция</td></tr>
<tr><td><a id="p100077"></a>Рыбная продукция</td><td rowspan="5"><a id="p100078"></a>0,001</td><td rowspan="5"><a id="p100079"></a>0,001 - 1,000</td><td><a id="p100080"></a>99,4</td><td><a id="p100081"></a>4,4</td><td><a id="p100082"></a>5,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100083"></a>Молочная продукция</td><td><a id="p100084"></a>96,4</td><td><a id="p100085"></a>2,2</td><td><a id="p100086"></a>2,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100087"></a>Мясопродукты</td><td><a id="p100088"></a>99,0</td><td><a id="p100089"></a>5,7</td><td><a id="p100090"></a>6,4</td></tr>
<tr><td><a id="p100091"></a>Икра</td><td><a id="p100092"></a>99,7</td><td><a id="p100093"></a>3,8</td><td><a id="p100094"></a>4,3</td></tr>
<tr><td><a id="p100095"></a>Кондитерские изделия</td><td><a id="p100096"></a>96,4</td><td><a id="p100097"></a>2,2</td><td><a id="p100098"></a>2,5</td></tr>
</table>


<a id="p100099"></a>IV. Средства измерений, посуда, реактивы, вспомогательные
устройства и материалы


#### <a id="p100100"></a>4.1 Средства измерений



| <a id="p100101"></a>Масс-спектрометр с диапазоном измерений от 5 до 1200 атомных единиц массы (далее - а.е.м.), точностью измерения массы не хуже 0,7 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС) |  |
| --- | --- |
| <a id="p100102"></a>Жидкостной хроматограф |  |
| <a id="p100103"></a>Весы лабораторные аналитические | <a id="p100104"></a>ГОСТ Р 53228 |
| <a id="p100105"></a>Колбы мерные К 1-10-2, К 1-100-2, К 1-1000-2 | <a id="p100106"></a>[ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |
| <a id="p100107"></a>Пипетки градуированные 2-го класса точности объемом 1 и 5 см3 | <a id="p100108"></a>[ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) |
| <a id="p100109"></a>Пипетка градуированная 1-го класса точности объемом 0,5 см3 | <a id="p100110"></a>[ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) |
| <a id="p100111"></a>Цилиндры мерные 2-го класса точности, вместимостью 500 и 1000 см3 | <a id="p100112"></a>[ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) |

<a id="p100113"></a>*Примечание.* Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.


#### <a id="p100114"></a>4.2 Реактивы



| <a id="p100115"></a>Натамицин, CAS 7681-93-8, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 90,00% |  |
| --- | --- |
| <a id="p100116"></a>Метронидазол-d4, CAS 1261392-47-5, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 90,00% |  |
| <a id="p100117"></a>Муравьиная кислота чистая для анализа | <a id="p100118"></a>[ГОСТ 5848](https://bukva.ai/docs/gost-5848-73) |
| <a id="p100119"></a>Метиловый спирт (метанол), хч | <a id="p100120"></a>[ГОСТ 6995](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77) |
| <a id="p100121"></a>н-Гексан, хч | <a id="p100122"></a>ТУ 6-09-06-657 |
| <a id="p100123"></a>Ацетонитрил, хч | <a id="p100124"></a>ТУ 6-09-4326 |
| <a id="p100125"></a>Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная) | <a id="p100126"></a>[ГОСТ Р 52501](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) |

<a id="p100127"></a>*Примечание.* Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.


#### <a id="p100128"></a>4.3 Вспомогательные устройства, материалы



| <a id="p100129"></a>Виалы объемом не менее 1,5 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой |  |
| --- | --- |
| <a id="p100130"></a>Гомогенизатор со скоростью вращения от 2000 мин-1 до 5000 мин-1 |  |
| <a id="p100131"></a>Центрифуга лабораторная рефрижераторная со скоростью вращения не менее 4000 об/мин, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см3 |  |
| <a id="p100132"></a>Баня ультразвуковая |  |
| <a id="p100133"></a>Пробирки полипропиленовые микроцентрифужные вместимостью не менее 1,5 см3 |  |
| <a id="p100134"></a>Пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками |  |
| <a id="p100135"></a>Встряхиватель (шейкер) для перемешивания |  |
| <a id="p100136"></a>Колонка хроматографическая стальная, длиной не менее 100 мм, с внутренним диаметром не более 3 мм, зернением не более 3 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 |  |
| <a id="p100137"></a>Предколонка хроматографическая, длиной не более 12,5 мм, внутренним диаметром не более 4,6 мм, зернением не более 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18 |  |
| <a id="p100138"></a>Фильтры мембранные |  |
| <a id="p100139"></a>Камера лабораторная морозильная с рабочим диапазоном температур от минус 18 °C до минус 20 °C |  |
| <a id="p100140"></a>Камера холодильная с рабочим диапазоном температур от 2 до 6 °C |  |

<a id="p100141"></a>*Примечание.* Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

<a id="p100142"></a>V. Требования безопасности

<a id="p100143"></a>5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
<a id="p100144"></a>Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда осуществляется по ГОСТ 12.0.004.
<a id="p100145"></a>5.2. К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются специалисты, освоившие данную методику и подтвердившие экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.

<a id="p100146"></a>VI. Условия измерений


#### <a id="p100147"></a>6.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- <a id="p100148"></a>процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;
- <a id="p100149"></a>выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

<a id="p100150"></a>VII. Подготовка к выполнению измерений

<a id="p100151"></a>7.1. Выполнению измерений предшествуют приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики. На всех этапах пробоподготовки, а также приготовления растворов натамицина предохранять пробу и растворы от попадания прямых солнечных и ультрафиолетовых лучей.

#### <a id="p100152"></a>7.2 Приготовление растворов для проведения анализа.


##### <a id="p100153"></a>7.2.1 Приготовление подвижных фаз А и Б.

<a id="p100154"></a>Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см3 приливают 995 см3 деионизованной воды, добавляют 5,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности - не более 1 мес.
<a id="p100155"></a>Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 1000 см3 метанола. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности - не более 1 мес.

##### <a id="p100156"></a>7.2.2 Приготовление рабочих растворов.

<a id="p100157"></a>Приготовление 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 метанола, прибавляют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метанолом. Срок хранения при комнатной температуре - не более 1 мес.

##### <a id="p100158"></a>7.2.3 Приготовление градуировочных растворов.


###### <a id="p100159"></a>7.2.3.1 Приготовление исходного стандарта натамицина C0.

<a id="p100160"></a>Для приготовления исходного раствора C0 с концентрацией 1 мг/см3 рассчитывают необходимое количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 10 мг чистого натамицина.
<a id="p100161"></a>В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят рассчитанную массу препарата натамицина для градуировки. Доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле [(п. 7.2.2)](#p100156), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 10 мин.
<a id="p100162"></a>Исходный раствор следует хранить без доступа солнечных и ультрафиолетовых лучей при температуре от -18 °C до -24 °C не более 1 мес.
<a id="p100163"></a>Все рабочие растворы натамицина готовятся непосредственно перед применением.

###### <a id="p100164"></a>7.2.3.2 Приготовление рабочего раствора C1.

<a id="p100165"></a>Для приготовления рабочего раствора C1 переносят 1 см3 исходного раствора натамицина C0 в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле [(п. 7.2.2)](#p100156) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C1 составляет 10 мкг/см3.

###### <a id="p100166"></a>7.2.3.3 Приготовление рабочего раствора C2.

<a id="p100167"></a>Для приготовления рабочего раствора C2 переносят по 1,0 мл3 рабочего раствора натамицина C1 в мерную колбу вместимостью 10 см3, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле [(п. 7.2.2)](#p100156) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C2 составляет 1 мкг/см3.

###### <a id="p100168"></a>7.2.3.4 Приготовление рабочего раствора C3.

<a id="p100169"></a>Для приготовления рабочего раствора C3 переносят по 1,0 мл3 рабочего раствора натамицина C2 в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле [(п. 7.2.2)](#p100156) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C3 составляет 0,1 мкг/см3.

###### <a id="p100170"></a>7.2.3.5 Приготовление рабочего раствора C4.

<a id="p100171"></a>Для приготовления рабочего раствора C4 переносят по 1,0 см3 рабочего раствора натамицина C3 в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле [(п. 7.2.2)](#p100156) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C4 составляет 0,01 мкг/см3.

###### <a id="p100172"></a>7.2.3.6 Приготовление рабочего раствора внутреннего стандарта D0.

<a id="p100173"></a>Для приготовления рабочего раствора D0 на аналитических весах взвешивают 2 мг чистого вещества стандартного образца метронидазола-d4 и переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3. Добавляют 8 см3 метанола, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на одну минуту, доводят полученный раствор до метки 10 см3 метанолом. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе составляет 200 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C - не более 3 мес.
<a id="p100174"></a>7.2.3.7. Приготовление рабочего раствора D<sub>1</sub> внутреннего стандарта. Для приготовления рабочего раствора D<sub>1</sub> переносят 0,2 см3 раствора D0 в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе D1 составляет 400 нг/см3. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C - не более 3 мес.

#### <a id="p100175"></a>7.3 Установление градуировочной характеристики.

<a id="p100176"></a>7.3.1. Для построения градуировочной характеристики берут "чистые" пробы, приготовленные и проанализированные ранее, не содержащие натамицин более 0,001 мг/кг, в зависимости от типа исследуемой матрицы. Взвешивают по 1,0 г, в пробы добавляют 50 мм3 внутреннего стандарта D1, градуировочные растворы C1 - C4, с таким расчетом, чтобы массовые доли натамицина находились в пределах от 0,001 до 1 мг/кг, далее проводят пробоподготовку по [главе IX](#p100181).
<a id="p100177"></a>7.3.2. Для получения градуировочной характеристики используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.
<a id="p100178"></a>7.3.3. При построении градуировочной зависимости для количественного определения натамицина анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в [главах VIII](#p100179) и [XII](#p100218). Затем строят графики зависимости массовой доли натамицина от отношения площади хроматографического пика натамицина к площади пика внутреннего стандарта для каждого характеристичного иона. Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи компьютерной программы (например, Excel).

<a id="p100179"></a>VIII. Отбор проб

<a id="p100180"></a>8.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

<a id="p100181"></a>IX. Выполнение измерений


#### <a id="p100182"></a>9.1 Пищевая продукция.

<a id="p100183"></a>Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В пробирку добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта D1 по [(п. 7.2.3.7)](#p100174) и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 4 см3 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле по [(п. 7.2.2)](#p100156) закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. После чего обезжиривают путем добавления 3 см3 гексана. Пробирку помещают в шейкер на 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирают 1 см3 нижнего слоя в микроцентрифужную пробирку и оставляют в морозильной камере на 60 мин. Далее пробирки с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 мин. Пипеточным дозатором переносят центрифугат в виалу для автосамплера жидкостного хроматографа. Полученный раствор используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

#### <a id="p100184"></a>9.2 Сыр, сырные продукты, плавленый сыр и др.

<a id="p100185"></a>Сыр натирают на металлической бытовой терке с мелкой перфорацией, взвешивают 1,0 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке, добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта D1 (по [п. 7.2.3.7](#p100174)). Далее обработку проб и подготовку к хроматографированию проводят по [п. 9.1](#p100182).

<a id="p100186"></a>X. Условия хроматографирования

<a id="p100187"></a>10.1. Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем капиллярных колонок. Например, для колонки диаметром 3 мм, длиной 100 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц 3 мкм, применяют следующие хроматографические условия:
- <a id="p100188"></a>температура колонки - 30 °C;
- <a id="p100189"></a>скорость потока подвижной фазы - 0,3 см3/мин;
- <a id="p100190"></a>объем вводимой пробы - 3 мм3.
<a id="p100191"></a>10.2. Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление элюентов в соответствии с п. 9.1.1): в начальный момент элюирование в 10%-й подвижной фазе Б, далее по 11,0 мин переход к 60% фазы Б; с 11,0 до 11,1 переход к 90% фазы Б, с 11,1 по 12,5 мин поддерживается 90% фазы Б; с 12,5 по 12,6 мин переход к 10% фазы Б, и далее по 15,0 мин происходит уравновешивание хроматографической колонки в фазе А/Б по объему (90/10).
<a id="p100192"></a>Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе:
- <a id="p100193"></a>поток газа-осушителя - 10,0 л/мин;
- <a id="p100194"></a>температура интерфейса 300 °C;
- <a id="p100195"></a>температура линии десольватации 250 °C;
- <a id="p100196"></a>температура нагревательного блока 400 °C;
- <a id="p100197"></a>скорость сканирования 10 скан/с.
<a id="p100198"></a>Детектирование пиков проводят методом регистрации выбранных реакций. Для каждого соединения измеряют сигнал для двух ионов согласно табл. 3.

<a id="p100199"></a>Таблица 3

<a id="p100200"></a>Параметры воздействия на ионы в режиме регистрации выбранных
реакций и условиях электроспрея с регистрацией положительных
ионов


| <a id="p100201"></a>Наименование | <a id="p100202"></a>Ион-предшественник, m/z | <a id="p100203"></a>Дочерние ионы, m/z | <a id="p100204"></a>Время удерживания, мин |
| --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100205"></a>Натамицин | <a id="p100206"></a>666,40 (+) | <a id="p100207"></a>503,25/648,10 | <a id="p100208"></a>9,9 |
| <a id="p100209"></a>Метронидазол-d4 <*> | <a id="p100210"></a>176,20 (+) | <a id="p100211"></a>128,10/82,10 | <a id="p100212"></a>5,3 |



<a id="p100213"></a>

---

<a id="p100214"></a><*> Примечание. Допускается использование другого внутреннего стандарта, близкого по физико-химическим свойствам.

<a id="p100215"></a>XI. Обработка результатов

<a id="p100216"></a>11.1. Расчеты содержания натамицина выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров, поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием.
<a id="p100217"></a>11.2. Окончательные результаты измерений содержания натамицина округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

<a id="p100218"></a>XII. Проверка приемлемости результатов
параллельных определений

<a id="p100219"></a>12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

<a id="p100220"></a> $\frac{2|X_{1} - X_{2}| \times 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r,$ (1)

<a id="p100221"></a>где X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты параллельных определений, мг/кг;
<a id="p100222"></a>r - значение предела повторяемости [(табл. 1)](#p100027), при этом $r = 2,8 \times \sigma_{r}$ .
<a id="p100223"></a>При невыполнении [условия (1)](#p100220) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

<a id="p100224"></a>XIII. Оформление результатов


#### <a id="p100225"></a>13.1 Результат анализа представляют в виде:


<a id="p100226"></a> $(\overline{X} \pm \Delta)$ , мг/кг при вероятности P = 0,95,

<a id="p100227"></a>где $\overline{X}$ - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
<a id="p100228"></a> $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

<a id="p100229"></a> $\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} ,$ 

<a id="p100230"></a>где $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, [табл. 1](#p100027)), %.

<a id="p100231"></a>XIV. Контроль качества результатов

<a id="p100232"></a>14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по [ГОСТ Р ИСО 5725-6](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002), используя контроль стабильности среднеквадратичного (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по [6.2.3](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100437) ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показателя правильности по [п. 6.2.4](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100518) ГОСТ Р ИСО 5725-6.





<a id="p100233"></a>**БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ**

1. <a id="p100234"></a>ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".
2. <a id="p100235"></a>ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".
3. <a id="p100236"></a>ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".
4. <a id="p100237"></a>ГОСТ 12.1.018-93 "Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования".
5. <a id="p100238"></a>ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".
6. <a id="p100239"></a>[ГОСТ ИСО 5725-1](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-1-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения".
7. <a id="p100240"></a>[ГОСТ ИСО 5725-6](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике".
8. <a id="p100241"></a>ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".
9. <a id="p100242"></a>[ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".
10. <a id="p100243"></a>[ГОСТ 29169-91](https://bukva.ai/docs/gost-29169-91) (ИСО 648-77) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".
11. <a id="p100244"></a>[ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".
12. <a id="p100245"></a>[ГОСТ 5848](https://bukva.ai/docs/gost-5848-73) "Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия".
13. <a id="p100246"></a>[ГОСТ 6995](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77) "Реактивы. Метанол-яд. Технические условия".
14. <a id="p100247"></a>[ГОСТ Р 52501](https://bukva.ai/docs/gost-r-52501-2005) "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".



<a id="p100248"></a>

---