МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания

№ МУК 4.1.3604-20Действующий акт

Актуально на 01.11.2026.

Как цитировать: "МУК 4.1.3604-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерения массовой доли натамицина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания". МУК 4.1.3604-20. https://bukva.ai/docs/metodika-muk-4-1-3604-20

(утв. Роспотребнадзором 29.07.2020)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июля 2020 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ НАТАМИЦИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3604-20

Методические указания разработаны ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (В.Ю. Ананьев, А.А. Константинов, И.П. Семенова, В.В. Бояркина, А.А. Гарбузова, М.В. Зароченцев, О.В. Андросова).

I. Общие положения и область применения

1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок определения массовой доли натамицина в пищевой продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (далее — ВЭЖХ-МС/МС) в диапазоне измерений от 0,001 до 1 мг/кг.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. Натамицин — полиеновый амфотерный макролидный антибиотик с противогрибковыми свойствами. Натамицин оказывает противогрибковое действие, связываясь со стеринами в клеточной мембране грибка, тем самым увеличивая проницаемость мембраны.

Общепринятое название: натамицин.

(1R,3S,5R,7R,8E,12R,14E,16E,18E,20E,22R,24S,25R,26S)-22-{[(2R,3S,4S,5S,6R)-4-амино-3,5-дигидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-1,3,26-тригидрокси-12-метил-10-оксо-6,11,28-триоксатрицикло[22.3.1.05,7]октакоза-8,14,16,18,20-пентаен-25-карбоновая кислота.

рис. 1

Рис. 1. Структурная формула натамицина

Эмпирическая формула: C₃₃H₄₇NO₁₃, молекулярная масса: 665,7.

Цвет: белые кристаллы.

Чувствителен к ультрафиолету и быстро деградирует на свету.

Константа диссоциации в 50% водном 2-метоксиэтаноле (pKa1) — 4,6; (pKa2) — 8,35.

Точка плавления — темнеет при +/- 200 °C, разлагается при 280 — 300 °C.

Растворимость в воде: 4100 мг/дм3 (при 21 °C). Коэффициент распределения в системе октанол/вода (при 25 °C): Kow log P = 0,88.

1.4 МУК носят рекомендательный характер.

II. Метод измерений

2.1. Метод основан на определении натамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием масс-спектрометрического детектора типа тройной квадруполь после экстракции натамицина из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Количественное определение остаточного содержания натамицина проводят методом внутреннего стандарта по площадям хроматографических пиков с помощью градуировочной характеристики, полученной при анализе градуировочных растворов в аналогичных условиях.

III. Метрологические характеристики

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций (по ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6)).

Таблица 1

Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости для натамицина

Анализируемый объект	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Показатель точности (границы относительной погрешности), \pm \delta , %, P = 0,95	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости), \sigma_{r} , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, %, (P = 0,95)
Рыбная продукция	0,001 — 1,000	30	4,4	6,2	12	17
Молочная продукция		25	2,2	3,1	6	9
Мясопродукты		30	5,7	8,0	16	2
Икра		27	3,8	5,3	11	15
Кондитерские изделия		25	2,2	3,1	6	9

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20)

Показатель	Метрологические параметры, P = 0,95, _n = 20
Показатель	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения вещества, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего результата, +/-, %
Пищевая продукция
Рыбная продукция	0,001	0,001 — 1,000	99,4	4,4	5,0
Молочная продукция			96,4	2,2	2,5
Мясопродукты			99,0	5,7	6,4
Икра			99,7	3,8	4,3
Кондитерские изделия			96,4	2,2	2,5

IV. Средства измерений, посуда, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

4.1 Средства измерений

Масс-спектрометр с диапазоном измерений от 5 до 1200 атомных единиц массы (далее — а.е.м.), точностью измерения массы не хуже 0,7 а.е.м., с режимом получения и анализа фрагментных ионов (режим МС/МС)
Жидкостной хроматограф
Весы лабораторные аналитические	ГОСТ Р 53228
Колбы мерные К 1-10-2, К 1-100-2, К 1-1000-2	ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности объемом 1 и 5 см3	ГОСТ 29227
Пипетка градуированная 1-го класса точности объемом 0,5 см3	ГОСТ 29227
Цилиндры мерные 2-го класса точности, вместимостью 500 и 1000 см3	ГОСТ 1770

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.2 Реактивы

Натамицин, CAS 7681-93-8, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 90,00%
Метронидазол-d4, CAS 1261392-47-5, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества не менее 90,00%
Муравьиная кислота чистая для анализа	ГОСТ 5848
Метиловый спирт (метанол), хч	ГОСТ 6995
н-Гексан, хч	ТУ 6-09-06-657
Ацетонитрил, хч	ТУ 6-09-4326
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная)	ГОСТ Р 52501

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

4.3 Вспомогательные устройства, материалы

Виалы объемом не менее 1,5 см3, закрываемые завинчивающейся или запрессовывающейся крышкой с тефлонированной резиновой прокладкой
	Гомогенизатор со скоростью вращения от 2000 мин-1 до 5000 мин-1
Центрифуга лабораторная рефрижераторная со скоростью вращения не менее 4000 об/мин, с адаптерами для пробирок вместимостью 15 см3 и микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 см3
Баня ультразвуковая
Пробирки полипропиленовые микроцентрифужные вместимостью не менее 1,5 см3
Пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками
Встряхиватель (шейкер) для перемешивания
Колонка хроматографическая стальная, длиной не менее 100 мм, с внутренним диаметром не более 3 мм, зернением не более 3 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18
Предколонка хроматографическая, длиной не более 12,5 мм, внутренним диаметром не более 4,6 мм, зернением не более 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18
Фильтры мембранные
Камера лабораторная морозильная с рабочим диапазоном температур от минус 18 °C до минус 20 °C
Камера холодильная с рабочим диапазоном температур от 2 до 6 °C

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

V. Требования безопасности

5.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.

Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Организация обучения работников безопасности труда осуществляется по ГОСТ 12.0.004.

5.2. К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются специалисты, освоившие данную методику и подтвердившие экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля точности измерений.

VI. Условия измерений

6.1 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80%;
выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

VII. Подготовка к выполнению измерений

7.1. Выполнению измерений предшествуют приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики. На всех этапах пробоподготовки, а также приготовления растворов натамицина предохранять пробу и растворы от попадания прямых солнечных и ультрафиолетовых лучей.

7.2 Приготовление растворов для проведения анализа.

7.2.1 Приготовление подвижных фаз А и Б.

Для приготовления подвижной фазы А в мерную колбу вместимостью 1000 см3 приливают 995 см3 деионизованной воды, добавляют 5,0 см3 муравьиной кислоты, перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности — не более 1 мес.

Для приготовления раствора элюента мобильной фазы Б в мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 1000 см3 метанола. Раствор хранят при комнатной температуре. Срок годности — не более 1 мес.

7.2.2 Приготовление рабочих растворов.

Приготовление 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу объемом 1000 см3 помещают 500 см3 метанола, прибавляют 5 см3 муравьиной кислоты и доводят объем до метки метанолом. Срок хранения при комнатной температуре — не более 1 мес.

7.2.3 Приготовление градуировочных растворов.

7.2.3.1 Приготовление исходного стандарта натамицина C0.

Для приготовления исходного раствора C0 с концентрацией 1 мг/см3 рассчитывают необходимое количество препарата с известным содержанием натамицина, соответствующее 10 мг чистого натамицина.

В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят рассчитанную массу препарата натамицина для градуировки. Доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2), перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на 10 мин.

Исходный раствор следует хранить без доступа солнечных и ультрафиолетовых лучей при температуре от -18 °C до -24 °C не более 1 мес.

Все рабочие растворы натамицина готовятся непосредственно перед применением.

7.2.3.2 Приготовление рабочего раствора C1.

Для приготовления рабочего раствора C1 переносят 1 см3 исходного раствора натамицина C0 в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C1 составляет 10 мкг/см3.

7.2.3.3 Приготовление рабочего раствора C2.

Для приготовления рабочего раствора C2 переносят по 1,0 мл3 рабочего раствора натамицина C1 в мерную колбу вместимостью 10 см3, доводят до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C2 составляет 1 мкг/см3.

7.2.3.4 Приготовление рабочего раствора C3.

Для приготовления рабочего раствора C3 переносят по 1,0 мл3 рабочего раствора натамицина C2 в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C3 составляет 0,1 мкг/см3.

7.2.3.5 Приготовление рабочего раствора C4.

Для приготовления рабочего раствора C4 переносят по 1,0 см3 рабочего раствора натамицина C3 в мерную колбу объемом 10 см3, доводят объем до метки 0,5%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле (п. 7.2.2) и перемешивают. Массовая концентрация натамицина в растворе C4 составляет 0,01 мкг/см3.

7.2.3.6 Приготовление рабочего раствора внутреннего стандарта D0.

Для приготовления рабочего раствора D0 на аналитических весах взвешивают 2 мг чистого вещества стандартного образца метронидазола-d4 и переносят в мерную колбу вместимостью 10 см3. Добавляют 8 см3 метанола, перемешивают и помещают в ультразвуковую баню на одну минуту, доводят полученный раствор до метки 10 см3 метанолом. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе составляет 200 мкг/см3. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C — не более 3 мес.

7.2.3.7. Приготовление рабочего раствора D₁ внутреннего стандарта. Для приготовления рабочего раствора D₁ переносят 0,2 см3 раствора D0 в мерную колбу вместимостью 100 см3, доводят до метки деионизированной водой и перемешивают. Массовая концентрация метронидазола-d4 в растворе D1 составляет 400 нг/см3. Срок хранения раствора при температуре от 0 °C до 8 °C — не более 3 мес.

7.3 Установление градуировочной характеристики.

7.3.1. Для построения градуировочной характеристики берут «чистые» пробы, приготовленные и проанализированные ранее, не содержащие натамицин более 0,001 мг/кг, в зависимости от типа исследуемой матрицы. Взвешивают по 1,0 г, в пробы добавляют 50 мм3 внутреннего стандарта D1, градуировочные растворы C1 — C4, с таким расчетом, чтобы массовые доли натамицина находились в пределах от 0,001 до 1 мг/кг, далее проводят пробоподготовку по главе IX.

7.3.2. Для получения градуировочной характеристики используют не менее четырех уровней концентраций матричных градуировочных растворов.

7.3.3. При построении градуировочной зависимости для количественного определения натамицина анализируют матричные градуировочные растворы различных уровней концентраций в условиях, описанных в главах VIII и XII. Затем строят графики зависимости массовой доли натамицина от отношения площади хроматографического пика натамицина к площади пика внутреннего стандарта для каждого характеристичного иона. Построение графиков может проводиться при помощи программы обработки данных ВЭЖХ-МС/МС или при помощи компьютерной программы (например, Excel).

VIII. Отбор проб

8.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

IX. Выполнение измерений

9.1 Пищевая продукция.

Каждую пробу измельчают на гомогенизаторе и взвешивают по 1 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке на лабораторных весах с наибольшим пределом взвешивания 200 г. В пробирку добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта D1 по (п. 7.2.3.7) и оставляют для уравновешивания на 15 мин. Затем добавляют 4 см3 0,5%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле по (п. 7.2.2) закрывают крышкой и интенсивно перемешивают на встряхивателе в течение 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. После чего обезжиривают путем добавления 3 см3 гексана. Пробирку помещают в шейкер на 15 мин. Далее виалы с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 15 мин. Отбирают 1 см3 нижнего слоя в микроцентрифужную пробирку и оставляют в морозильной камере на 60 мин. Далее пробирки с образцами помещают на предварительно охлажденную до 4 °C центрифугу и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 15 мин. Пипеточным дозатором переносят центрифугат в виалу для автосамплера жидкостного хроматографа. Полученный раствор используют для ВЭЖХ-МС/МС анализа.

9.2 Сыр, сырные продукты, плавленый сыр и др.

Сыр натирают на металлической бытовой терке с мелкой перфорацией, взвешивают 1,0 г гомогенизированной пробы в полипропиленовой пробирке, добавляют 50 мм3 раствора внутреннего стандарта D1 (по п. 7.2.3.7). Далее обработку проб и подготовку к хроматографированию проводят по п. 9.1.

X. Условия хроматографирования

10.1. Хромато-масс-спектрометр включают в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации и устанавливают параметры, рекомендуемые изготовителем капиллярных колонок. Например, для колонки диаметром 3 мм, длиной 100 мм, с обращенно-фазным сорбентом C18 с размером частиц 3 мкм, применяют следующие хроматографические условия:

температура колонки — 30 °C;
скорость потока подвижной фазы — 0,3 см3/мин;
объем вводимой пробы — 3 мм3.

10.2. Разделение проводят в режиме градиентного элюирования (приготовление элюентов в соответствии с п. 9.1.1): в начальный момент элюирование в 10%-й подвижной фазе Б, далее по 11,0 мин переход к 60% фазы Б; с 11,0 до 11,1 переход к 90% фазы Б, с 11,1 по 12,5 мин поддерживается 90% фазы Б; с 12,5 по 12,6 мин переход к 10% фазы Б, и далее по 15,0 мин происходит уравновешивание хроматографической колонки в фазе А/Б по объему (90/10).

Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе:

поток газа-осушителя — 10,0 л/мин;
температура интерфейса 300 °C;
температура линии десольватации 250 °C;
температура нагревательного блока 400 °C;
скорость сканирования 10 скан/с.

Детектирование пиков проводят методом регистрации выбранных реакций. Для каждого соединения измеряют сигнал для двух ионов согласно табл. 3.

Таблица 3

Параметры воздействия на ионы в режиме регистрации выбранных реакций и условиях электроспрея с регистрацией положительных ионов

Наименование	Ион-предшественник, m/z	Дочерние ионы, m/z	Время удерживания, мин
Натамицин	666,40 (+)	503,25/648,10	9,9
Метронидазол-d4 <*>	176,20 (+)	128,10/82,10	5,3

<*> Примечание. Допускается использование другого внутреннего стандарта, близкого по физико-химическим свойствам.

XI. Обработка результатов

11.1. Расчеты содержания натамицина выполняют с помощью градуировочной характеристики следующим образом. Вычисляют отношение площади пика фрагментного иона к площади внутреннего стандарта с помощью программы обработки спектров, поставляемой вместе с хромато-масс-спектрометром. Затем для найденного значения (абсциссы) находят точку на градуировочной характеристике. Ордината этой точки является искомым содержанием.

11.2. Окончательные результаты измерений содержания натамицина округляют до целого значения и выражают в микрограммах на килограмм.

XII. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2|X_{1} - X_{2}| \times 100}{X_{1} + X_{2}} \leq r, (1)

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \times \sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

XIII. Оформление результатов

13.1 Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

XIV. Контроль качества результатов

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратичного (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности по 6.2.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ

1. ГОСТ 12.1.004 «Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования».

2. ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны».

3. ГОСТ 12.1.007 «Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности».

4. ГОСТ 12.1.018-93 «Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования».

5. ГОСТ 12.1.019 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

6. ГОСТ ИСО 5725-1 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения».

7. ГОСТ ИСО 5725-6 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».

8. ГОСТ Р 53228 «Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания».

9. ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) «Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия».

10. ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой».

11. ГОСТ 29227 «Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования».

12. ГОСТ 5848 «Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия».

13. ГОСТ 6995 «Реактивы. Метанол-яд. Технические условия».

14. ГОСТ Р 52501 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».