---
title: "\"МУК 4.1.3331-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой доли синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания\""
number: "МУК 4.1.3331-16"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodika-muk-4-1-3331-16"
---

## "МУК 4.1.3331-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой доли синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"

# "МУК 4.1.3331-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой доли синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 15.02.2016)


<a id="p100001"></a>Утверждаю
Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека -
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации
**А.Ю.ПОПОВА**
15 февраля 2016 года


#### <a id="p100002"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100003"></a>**МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ МАССОВОЙ ДОЛИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ИНГИБИТОРОВ**
**ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ-5 (ТАДАЛАФИЛА, ВАРДЕНАФИЛА И СИЛДЕНАФИЛА)**
**В БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ**
**ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ**
**И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3331-16**

1. <a id="p100005"></a>Разработаны: ФГБНУ "НИИ питания" (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, В.В. Бессонов, И.Б. Перова, А.А. Жогова, А.П. Воробьев) и ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" (С.В. Орлова, О.Г. Потанина, С.В. Горяинов, Е.А. Никитина, В.А. Ивлев, Г.А. Калабин).
2. <a id="p100006"></a>Утверждены: руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защите прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "15" февраля 2016 года.
3. <a id="p100007"></a>Введены впервые.


## 1. <a id="p100008"></a>Область применения


<a id="p100009"></a>1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище, аккредитованными в соответствии с требованиями Федерального закона от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации".
<a id="p100010"></a>1.2. Настоящие МУК распространяются на исследования недекларированного добавления синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в некоторых биологически активных добавках к пище и носят рекомендательный характер.


## 2. <a id="p100011"></a>Общие положения


<a id="p100012"></a>Настоящие МУК регулируют порядок определения синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в БАД к пище методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 0,2 до 50 мг/г.


## 3. <a id="p100013"></a>Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила


<a id="p100014"></a>Общепринятые названия:
<a id="p100015"></a>Тадалафил CAS N: 171596-29-5;
<a id="p100016"></a>Силденафила цитрат CAS N: 171599-83-0;
<a id="p100017"></a>Варденафила гидрохлорид CAS N: 330808-88-3.
<a id="p100018"></a>Химические названия и химические формулы веществ:
1. <a id="p100019"></a>Тадалафил - (6R,12aR)-6-(1,3-Бензодиоксол-5-ил)-2-метил-2,3,6,7,12,12a-гексагидро-2-метилпиразино[1',2':1,6]пиридо[3,4-b]индол-1,4-дион.
<a id="p100020"></a>Химическая формула (рисунок 1);

<a id="p100021"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_0.png) 

<a id="p100022"></a>Рисунок 1. Структурная формула тадалафила

2. <a id="p100023"></a>Силденафил - (1-[[3-(6,7-Дигидро-1-метил-7-оксо-3-пропил-1Н-пиразоло[4,3-альфа]пиримидин-5-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]пиперазин (в форме цитрата).
<a id="p100024"></a>Химическая формула (рисунок 2);

<a id="p100025"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_1.png) 

<a id="p100026"></a>Рисунок 2. Структурная формула силденафила

3. <a id="p100027"></a>Варденафил - 1-[[3-(1,4-Дигидро-5-метил-4-оксо-7-пропилимидазо[5,1-f][1,2,4]триазин-2-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]-4-этилпиперазин (в форме моногидрохлорида).
<a id="p100028"></a>Химическая формула (рисунок 3).

<a id="p100029"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_2.png) 

<a id="p100030"></a>Рисунок 3. Структурная формула варденафила

<a id="p100031"></a>Тадалафил, силденафил, варденафил - фармацевтические препараты, предназначенные для лечения эректильной дисфункции и являющиеся селективными ингибиторами специфической фосфодиэстеразы типа 5 (ФДЭ5) циклического гуанозин монофосфата (цГМФ).
<a id="p100032"></a>Данные фармацевтические препараты рекомендуется применять по назначению врача после сбора полного анамнеза и проведения тщательного урологического и общеклинического обследования, особенно у больных с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также для исключения взаимодействия с другими принимаемыми пациентом фармацевтическими препаратами (в частности, органическими нитратами).
<a id="p100033"></a>Существует проблема фальсификации, связанная с возможным недекларированным присутствием тадалафила, силденафила и варденафила в некоторых биологических активных добавках к пище (далее - БАД).
<a id="p100034"></a>Физические свойства: тадалафил, силденафил и варденафил представляют собой белые кристаллические порошки с температурой плавления 276 - 279 °C, 185 - 187 °C и 191 - 193 °C соответственно. Тадалафил, силденафил и варденафил хорошо растворяются в метаноле.
<a id="p100035"></a>УФ-спектр тадалафила в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 284 нм и 291 нм. Спектр метанольного раствора стандарта тадалафила приведен на рис. 4. Молекулярная масса тадалафила 389,4 г/моль, молярная экстинкция при максимуме поглощения $\epsilon = 16500\text{л} \times \text{моль}^{- 1} \times \text{см}^{- 1}$ .

<a id="p100036"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_3.png) 

<a id="p100037"></a>Рисунок 4. УФ-спектр раствора тадалафила в метаноле
с концентрацией 16,0 мкг/мл

<a id="p100038"></a>УФ-спектр силденафила (в форме цитрата) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Спектр метанольного раствора стандарта силденафила приведен на рис. 5. Молекулярная масса силденафила 474,6 г/моль (силденафила цитрата 666,7 г/моль), молярная экстинкция при максимуме поглощения $\epsilon = 13800\text{л} \times \text{моль}^{- 1} \times \text{см}^{- 1}$ .

<a id="p100039"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_4.png) 

<a id="p100040"></a>Рисунок 5. УФ-спектр раствора силденафила в метаноле
с концентрацией 14,7 мкг/мл

<a id="p100041"></a>УФ-спектр варденафила (в форме гидрохлорида) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 242 нм. Спектр метанольного раствора стандарта варденафила приведен на рис. 6. Молекулярная масса варденафила 488,6 г/моль (варденафила гидрохлорида 524,1 г/моль), молярная экстинкция при длине волны $\lambda = 285\text{нм}$ $\epsilon = 8610\text{л} \times \text{моль}^{- 1} \times \text{см}^{- 1}$ .

<a id="p100042"></a> ![3. Краткая характеристика тадалафила, силденафила и варденафила](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_5.png) 

<a id="p100043"></a>Рисунок 6. УФ-спектр раствора варденафила в метаноле
с концентрацией 16,0 мкг/мл


## 4. <a id="p100044"></a>Определение тадалафила, силденафила и варденафила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием



### <a id="p100045"></a>4.1. Основные положения



##### <a id="p100046"></a>4.1.1 Принцип метода.

<a id="p100047"></a>Методика основана на определении тадалафила (далее - ТДЛ), силденафила (далее - СЛД) и варденафила (далее - ВРД) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором с подтверждением структуры с помощью масс-селективного детектора.
<a id="p100048"></a>4.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций тадалафила, силденафила и варденафила в пробе, приведены в таблице 1.

<a id="p100049"></a>Таблица N 1


| <a id="p100050"></a>Определяемое вещество | <a id="p100051"></a>Диапазон измеряемых концентраций, мг/г | <a id="p100052"></a>Характеристика погрешности, P = 0,95), $\pm \delta$ , % | <a id="p100053"></a>Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости), $\sigma r$ , % | <a id="p100054"></a>Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости), $\sigma_{R}$ , % | <a id="p100055"></a>Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, % | <a id="p100056"></a>Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % | <a id="p100057"></a>Средняя полнота извлечения вещества, % |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100058"></a>1 | <a id="p100059"></a>2 | <a id="p100060"></a>3 | <a id="p100061"></a>4 | <a id="p100062"></a>5 | <a id="p100063"></a>6 | <a id="p100064"></a>7 | <a id="p100065"></a>8 |
| <a id="p100066"></a>Тадалафил | <a id="p100067"></a>0,2 - 50 | <a id="p100068"></a>+/- 25% | <a id="p100069"></a>2,4 | <a id="p100070"></a>3,36 | <a id="p100071"></a>6,72 | <a id="p100072"></a>9,41 | <a id="p100073"></a>92,5 |
| <a id="p100074"></a>Силденафил | <a id="p100075"></a>0,2 - 50 | <a id="p100076"></a>+/- 25% | <a id="p100077"></a>2,35 | <a id="p100078"></a>3,29 | <a id="p100079"></a>6,58 | <a id="p100080"></a>9,21 | <a id="p100081"></a>93,0 |
| <a id="p100082"></a>Варденафил | <a id="p100083"></a>0,2 - 50 | <a id="p100084"></a>+/- 25% | <a id="p100085"></a>2,38 | <a id="p100086"></a>3,33 | <a id="p100087"></a>6,76 | <a id="p100088"></a>9,32 | <a id="p100089"></a>94,2 |



### <a id="p100090"></a>4.2. Реактивы


<a id="p100091"></a>Тадалафил (стандарт, не менее 99%);
<a id="p100092"></a>Силденафила цитрат (стандарт, не менее 98%);
<a id="p100093"></a>Варденафила гидрохлорид (стандарт, не менее 90%);
- <a id="p100094"></a>метанол для ВЭЖХ;
- <a id="p100095"></a>ацетонитрил для ВЭЖХ;
- <a id="p100096"></a>вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;
- <a id="p100097"></a>раствор формиата аммония 5М или формиат аммония квалификации ХЧ;


### <a id="p100098"></a>4.3. Средства измерений, испытательное оборудование и лабораторная посуда


- <a id="p100099"></a>система жидкостной хроматографии, оснащенная насосом, УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице и масс-детектором;
- <a id="p100100"></a>хроматографическая колонка для обращенно-фазовой хроматографии с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (линейные размеры 250 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм);
- <a id="p100101"></a>центрифуга для пробирок объемом не менее 1,5 см3 и относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 10000;
- <a id="p100102"></a>ультразвуковая водяная баня;
- <a id="p100103"></a>pH-метр;
- <a id="p100104"></a>весы лабораторные аналитические с наибольшим пределом взвешивания 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228-2008;
- <a id="p100105"></a>колбы мерные наливные объемом 50, 100, 500 и 1000 см3 по ГОСТ 1770-74;
- <a id="p100106"></a>стаканы по ГОСТ 25336-82 вместимостью 500 см3;
- <a id="p100107"></a>цилиндры мерные лабораторные с носиком 2-го класса точности вместимостью 100 и 500 см3 по ГОСТ 1770-74;
- <a id="p100108"></a>пипетки 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 по ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81);
- <a id="p100109"></a>автоматические пипетки с переменным объемом 0,1 - 1,0 см3;
- <a id="p100110"></a>полимерные пробирки объемом 1,5 см3 с герметичной крышкой.


### <a id="p100111"></a>4.4. Отбор проб


<a id="p100112"></a>Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов, следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.


### <a id="p100113"></a>4.5. Подготовка к определению



##### <a id="p100114"></a>4.5.1 Приготовление раствора стандарта тадалафила.

<a id="p100115"></a>Навеску тадалафила около 20 мг (здесь и далее: точная навеска) помещают в мерную колбу на 100 см3, добавляют 70 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 200 мкг/мл.
<a id="p100116"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение 6-ти месяцев.
<a id="p100117"></a>4.5.2. Приготовление рабочего раствора стандарта тадалафила с концентрацией 20 мкг/см3 (срок хранения 14 дней).
<a id="p100118"></a>Мерной пипеткой переносят 5 см3 раствора хранения стандарта тадалафила в мерную колбу на 50 см3, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.
<a id="p100119"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при $\lambda = 284\text{нм}$ :
<a id="p100120"></a> $Cm = \frac{D}{\epsilon} (\text{г}/\text{л})$ ,
<a id="p100121"></a>где D - оптическая плотность раствора,
<a id="p100122"></a> $\epsilon$ - коэффициент молярной экстинкции тадалафила (16500 л x моль-1 x см-1)
<a id="p100123"></a>Пересчет на концентрацию C в мг/л проводится по формуле:
<a id="p100124"></a>C = Cm * 1000 * 389,4 (в упрощенном виде C = 23,6 * D, мг/л)

##### <a id="p100125"></a>4.5.3 Приготовление раствора стандарта силденафила.

<a id="p100126"></a>Навеску силденафила цитрата около 28 мг (соответствует 20 мг силденафила) помещают в мерную колбу на 50 см3, добавляют 30 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.
<a id="p100127"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 6-ти месяцев.
<a id="p100128"></a>4.5.4. Приготовление рабочего раствора стандарта силденафила с концентрацией 40 мкг/см3 (срок хранения 14 дней).
<a id="p100129"></a>Мерной пипеткой переносят 5 см3 раствора хранения стандарта силденафила в мерную колбу на 50 см3, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.
<a id="p100130"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при $\lambda = 292\text{нм}$ .
<a id="p100131"></a>Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично [пункту 4.5.2](#p100117).
<a id="p100132"></a>При величине коэффициента молярной экстинкции для силденафила $\epsilon = 13800\text{л} \times \text{моль}^{- 1} \times \text{см}^{- 1}$ и молекулярной массе 474,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:
<a id="p100133"></a>C = 34,4 * D (мг/л)

##### <a id="p100134"></a>4.5.5 Приготовление стандартного раствора варденафила.

<a id="p100135"></a>Навеску варденафила гидрохлорида около 24 мг (соответствует 20 мг варденафила) помещают в мерную колбу на 50 см3, добавляют 30 см3 метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.
<a id="p100136"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 6-ти месяцев.
<a id="p100137"></a>4.5.6. Приготовление рабочего раствора стандарта варденафила с концентрацией 40 мкг/см3 (срок хранения 14 дней).
<a id="p100138"></a>Мерной пипеткой переносят 5 см3 раствора хранения стандарта варденафила в мерную колбу на 50 см3, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.
<a id="p100139"></a>Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель.
<a id="p100140"></a>Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично [пункту 4.5.2](#p100117).
<a id="p100141"></a>При величине коэффициента молярной экстинкции для варденафила $\epsilon = 8610\text{л} \times \text{моль}^{- 1} \times \text{см}^{- 1}$ и молекулярной массе 488,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:
<a id="p100142"></a>C = 56,7 * D (мг/л)

##### <a id="p100143"></a>4.5.7 Приготовление подвижной фазы.

<a id="p100144"></a>Для приготовления раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см3 отмеривают 400 см3 воды дистиллированной и, тщательно перемешивая, прибавляют 1,0 см3 5М раствора формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см3, доводят водой дистиллированной до метки и перемешивают.
<a id="p100145"></a>При использовании формиата аммония квалификации ХЧ навеску массой 630 мг переносят в мерную колбу объемом 1000 см3, доводят водой дистиллированной до метки и тщательно перемешивают до полного растворения навески.
<a id="p100146"></a>Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу объемом 1000 см3 отмеривают 400 см3 раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль, и, тщательно перемешивая, добавляют 600 см3 ацетонитрила до метки. Подвижную фазу фильтруют под вакуумом с применением мембранного фильтра с диаметром пор $0,45\mu\text{м}$ <*>.

<a id="p100147"></a>

---

<a id="p100148"></a><*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.


##### <a id="p100149"></a>4.5.8 Подготовка образца к анализу.

<a id="p100150"></a>При анализе БАД таблетированные формы (5 таблеток) подвергают измельчению, в случае капсулированных препаратов содержимое 5 капсул извлекают из оболочки (при необходимости оболочки капсул измельчают и добавляют к содержимому капсул). Таким же способом можно подвергнуть анализу сырье для производства БАД или оболочки капсул (5 - 10 капсул) <*>. На анализ берется навеска усредненного образца, соответствующая массе 1,0 г. После взвешивания, навеску пробы помещают в мерную колбу на 100 см3, добавляют 100 см3 смеси метанол:вода (6:4, v:v) (объем V). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 20 мин. Отбирают 1,5 см3 экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 10000. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

<a id="p100151"></a>

---

<a id="p100152"></a><*> В случае высоких концентраций ингибиторов ФДЭ-5 ("зашкаливание" на хроматограмме) из объема V (100 см3) отбирают аликвоту в 10 см3 и разбавляют смесью метанол:вода (6:4, v:v) в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации [(пункт 4.7)](#p100267).


### <a id="p100153"></a>4.6. Обнаружение и количественное определение



##### <a id="p100154"></a>4.6.1 Условия проведения ВЭЖХ.

<a id="p100155"></a>Условия проведения ВЭЖХ приведены в таблице 2.

<a id="p100156"></a>Таблица 2


<table>
<colgroup><col width="48%"><col width="52%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100157"></a>Параметр</td><td><a id="p100158"></a>Значение</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100159"></a>Насос:</td></tr>
<tr><td><a id="p100160"></a>- состав подвижной фазы <a href="#p100181">&lt;*&gt;</a></td><td><a id="p100161"></a>Водный раствор формиата аммония с концентрацией 10 ммоль (40%) - ацетонитрил (60%)</td></tr>
<tr><td><a id="p100162"></a>- режим элюирования</td><td><a id="p100163"></a>Изократическое элюирование</td></tr>
<tr><td><a id="p100164"></a>- скорость потока</td><td><a id="p100165"></a>0,5 см3/мин</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100166"></a>Инжектор</td></tr>
<tr><td><a id="p100167"></a>- объем ввода</td><td><a id="p100168"></a>0,010 см3</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100169"></a>Термостат колонок</td></tr>
<tr><td><a id="p100170"></a>- температура</td><td><a id="p100171"></a>30 °C</td></tr>
<tr><td><a id="p100172"></a>Детектирование</td><td><a id="p100173"></a><a id="p100174"></a>Диодно-матричное спектрофотометрическое<br>При $\lambda = 284\text{нм}$ и $\lambda = 292\text{нм}$</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100175"></a>Хроматографические характеристики методики</td></tr>
<tr><td><a id="p100176"></a>- примерное время удерживания, мин. (tR)</td><td><a id="p100177"></a><a id="p100178"></a><a id="p100179"></a>Около 8 мин (тадалафил),<br>Около 10 мин (варденафил)<br>Около 11 мин (силденафил)</td></tr>
</table>



<a id="p100180"></a>

---

<a id="p100181"></a><*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

<a id="p100182"></a>4.6.2. Условия детектирования на времяпролетном масс-спектрометрическом детекторе.
<a id="p100183"></a>Условия детектирования на времяпролетном масс-спектрометрическом детекторе приведены в таблице 3.

<a id="p100184"></a>Таблица 3


<table>
<colgroup><col width="48%"><col width="52%"></colgroup>
<tr><td><a id="p100185"></a>Параметр</td><td><a id="p100186"></a>Значение</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100187"></a>Рабочие параметры:</td></tr>
<tr><td><a id="p100188"></a>Температура колонки, °C</td><td><a id="p100189"></a>30</td></tr>
<tr><td><a id="p100190"></a>Объем вводимой пробы, см3</td><td><a id="p100191"></a>0,010</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100192"></a>Сканирование масс</td></tr>
<tr><td><a id="p100193"></a>- источник ионизации</td><td><a id="p100194"></a>электростатическое распыление</td></tr>
<tr><td><a id="p100195"></a>- режим работы</td><td><a id="p100196"></a>регистрация положительных ионов</td></tr>
<tr><td><a id="p100197"></a>- диапазон детектируемых масс веществ, Да</td><td><a id="p100198"></a>200 - 1200</td></tr>
<tr><td><a id="p100199"></a>- детектируемые массы, Да</td><td><a id="p100200"></a>390.1, 475.2 и 489.2</td></tr>
<tr><td><a id="p100201"></a>- напряжение на капилляре, кВ</td><td><a id="p100202"></a>3,5</td></tr>
<tr><td><a id="p100203"></a>- поток газа-осушителя (азот), л/мин</td><td><a id="p100204"></a>5,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100205"></a>- температура газа, °C</td><td><a id="p100206"></a>325</td></tr>
<tr><td><a id="p100207"></a>- давление на распылителе, МПа</td><td><a id="p100208"></a>0,207</td></tr>
</table>


<a id="p100209"></a>4.6.3. Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе.
<a id="p100210"></a>Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе приведены в таблице 4.

<a id="p100211"></a>Таблица 4


| <a id="p100212"></a>Параметр | <a id="p100213"></a>Значение |
| --- | --- |
| <a id="p100214"></a>- источник ионизации | <a id="p100215"></a>электростатическое распыление |
| <a id="p100216"></a>- Температура колонки, °C | <a id="p100217"></a>30 |
| <a id="p100218"></a>Объем вводимой пробы, см3 | <a id="p100219"></a>0,010 |
| <a id="p100220"></a>- напряжение на капилляре, кВ | <a id="p100221"></a>3,5 |
| <a id="p100222"></a>- поток газа-осушителя (азот), л/мин | <a id="p100223"></a>9,0 |
| <a id="p100224"></a>- температура газа, °C | <a id="p100225"></a>325 |
| <a id="p100226"></a>- давление на распылителе, МПа | <a id="p100227"></a>0,207 |
| <a id="p100228"></a>- температура квадруполей, °C | <a id="p100229"></a>200 |
| <a id="p100230"></a>- напряжение на фрагменторе | <a id="p100231"></a>135 В |
| <a id="p100232"></a>- дочерние ионы | <a id="p100233"></a>268,0 для тадалафила, 312,1 Да для варденафила и 100,1 Да для силденафила |
| <a id="p100234"></a>- энергия разрушения | <a id="p100235"></a>9 В для тадалафила, 35 В для варденафила и 45 В для силденафила |
| <a id="p100236"></a>- источник ионизации | <a id="p100237"></a>электростатическое распыление |
| <a id="p100238"></a>- Температура колонки, °C | <a id="p100239"></a>30 |
| <a id="p100240"></a>Объем вводимой пробы, см3 | <a id="p100241"></a>0,010 |
| <a id="p100242"></a>- напряжение на капилляре, кВ | <a id="p100243"></a>3,5 |
| <a id="p100244"></a>- поток газа-осушителя (азот), л/мин | <a id="p100245"></a>9,0 |
| <a id="p100246"></a>- скорость сканирования | <a id="p100247"></a>10 скан/с |



##### <a id="p100248"></a>4.6.4 Идентификация ТДЛ, СЛД и ВРД.

<a id="p100249"></a>Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами (характеристичными "переходами") соответствующих стандартов.
<a id="p100250"></a>Типичные хроматограммы и масс-спектры приведены на рисунках 7 - [11](#p100260).

<a id="p100251"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_6.png) 

<a id="p100252"></a>Рисунок 7. УФ-хроматограмма смеси стандартов тадалафила,
варденафила и силденафила, $\lambda = 292,8\text{нм}$ (колонка Protecol
HPH125-C18, 250*4,6 мм, размер частиц 5 мкм)



<a id="p100253"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_7.png) 

<a id="p100254"></a>Рисунок 8. Хроматограмма выделенных ионов тадалафила m/z
390.1423, варденафила m/z 489.2241 и силденафила m/z
475.2085 (колонка Protecol HPH125-C18,
250*4,6 мм, размер частиц 5 мкм)



<a id="p100255"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_8.png) 

<a id="p100256"></a>Рисунок 9. Масс-спектр ионизации
электрораспылением тадалафила



<a id="p100257"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_9.png) 

<a id="p100258"></a>Рисунок 10. Масс-спектр ионизации
электрораспылением варденафила



<a id="p100259"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_10.png) 

<a id="p100260"></a>Рисунок 11. Масс-спектр ионизации
электрораспылением силденафила



<a id="p100261"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_11.png) 

<a id="p100262"></a>Рисунок 12. Спектр МС/МС [M+H]+ тадалафила



<a id="p100263"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_12.png) 

<a id="p100264"></a>Рисунок 13. Спектр МС/МС [M+H]+ варденафила



<a id="p100265"></a> ![4.6. Обнаружение и количественное определение](https://i.bukva.ai/ZgVOHpiJ/img_13.png) 

<a id="p100266"></a>Рисунок 14. Спектр МС/МС [M+H]+ силденафила


### <a id="p100267"></a>4.7. Обработка результатов измерения


<a id="p100268"></a>Расчет содержания в образце ТДЛ, СЛД и ВРД проводят по формуле:

<a id="p100269"></a> $X = \frac{S_{\text{ТДЛ }(\text{ВРД},\text{СЛД })} \times C \times V \times N}{m_{\text{навески}} \times S_{\text{СТД}}}$ 

<a id="p100270"></a>где:
<a id="p100271"></a>X - количество ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, мг/г;
<a id="p100272"></a>SТДЛ(ВРД,СЛД) - площадь ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;
<a id="p100273"></a>SСТД - площадь стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;
<a id="p100274"></a>V - объем раствора пробы, см3;
<a id="p100275"></a>C - концентрация стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, мг/см3;
<a id="p100276"></a>mнавески - навеска образца, взятая на анализ, г.
<a id="p100277"></a>N - коэффициент разбавления пробы
<a id="p100278"></a>Результат анализа представляют в виде:

<a id="p100279"></a> $(X \pm \Delta)$ мг/г при вероятности P = 0,95, где

<a id="p100280"></a>X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;
<a id="p100281"></a> $\Delta$ - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

<a id="p100282"></a> $\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100}$ , где

<a id="p100283"></a> $\delta$ - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с [диапазоном концентраций, табл. 1](#p100051)), %.
<a id="p100284"></a>В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:
<a id="p100285"></a>"содержание вещества в пробе менее 0,2 мг/г". <*>

<a id="p100286"></a>

---

<a id="p100287"></a><*> - 0,2 мг/г - предел обнаружения.


### <a id="p100288"></a>4.8. Контроль результатов измерений



##### <a id="p100289"></a>4.8.1 Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

<a id="p100290"></a>Определение содержания тадалафила, силденафила и варденафила в каждом образце проводится в 2-х параллельных измерениях. Вывод о допустимости расхождения между параллельными измерениями определяют на основании предела повторяемости (r) по формуле:

<a id="p100291"></a> $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r$ 

<a id="p100292"></a>где X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты параллельных определений, мг/г
<a id="p100293"></a>При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

##### <a id="p100294"></a>4.8.2 Проверка лабораторной воспроизводимости

<a id="p100295"></a>Вывод о допустимости расхождения между разными лабораторными измерениями одной и той же пробы определяют на основании предела воспроизводимости (R) по формуле:

<a id="p100296"></a> $\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R$ 

<a id="p100297"></a>где X<sub>1</sub>, X<sub>2</sub> - результаты разных лабораторных определений, мг/г
<a id="p100298"></a>При превышении расчетного значения предела воспроизводимости (R), измерение следует провести заново, используя новую пробу.
<a id="p100299"></a>4.8.3. Оперативный контроль проведения измерения с использованием метода добавок.
<a id="p100300"></a>Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
<a id="p100301"></a>Образцами контроля являются рабочие пробы БАД к пище (содержащие тадалафил (силденафил или варденафил) в концентрации не менее нижнего предела количественного определения. Пробу разделяют ее на две равные части. Одну оставляют без изменений, а к другой добавляют стандартный раствор тадалафила (силденафила или варденафила) в таком количестве, чтобы его массовая доля увеличилась на 50 - 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.
<a id="p100302"></a>Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы и пробы с добавкой.
<a id="p100303"></a>Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (C'рк), пробы без добавки (Cрк) и величиной добавки (Cдобрк) с нормативом оперативного контроля (K). Норматив оперативного контроля (K) рассчитывают по формуле:

<a id="p100304"></a> $K = \sqrt{(C\text{рк} \times \sigma)^{2} + (C'_{\text{рк}} \times \sigma)^{2}}$ 

<a id="p100305"></a>Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия:

<a id="p100306"></a>|C'проба - Cпроба - Cдоб| <= K

<a id="p100307"></a>При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.


## 5. <a id="p100308"></a>Интерпретация результатов анализа


<a id="p100309"></a>Метод ВЭЖХ-УФ-спектрофотометрии предоставляет необходимый предел обнаружения и достаточную селективность анализа. При получении отрицательных результатов ВЭЖХ-УФ анализа образец рассматривается как свободный от наличия остатков тадалафила, силденафила или варденафила.
<a id="p100310"></a>При положительных результатах ВЭЖХ-УФ анализа необходимо обязательное подтверждение наличия тадалафила, силденафила или варденафила с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометрии.


## 6. <a id="p100311"></a>Требования к квалификации персонала


<a id="p100312"></a>К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и навыками в области хроматомасс-спектрометрии.


## 7. <a id="p100313"></a>Требования охраны труда


<a id="p100314"></a>При выполнении анализов необходимо соблюдать требования охраны труда при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.4.103-83.
<a id="p100315"></a>Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021-75.
<a id="p100316"></a>Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.2.007.0-75 и по ГОСТ Р 12.1.019-2009.
<a id="p100317"></a>Организация обучения работающих безопасности труда - по Постановлению Минтруда РФ и Минобразования РФ от 13 января 2003 года N 1/29 "Об утверждении Порядка обучения по охране труда и проверки знаний требований охраны труда работников организаций".
<a id="p100318"></a>Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по постановлению Правительства РФ от 25 апреля 2012 года N 390 "О противопожарном режиме" и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
<a id="p100319"></a>Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005-88.


## 8. <a id="p100320"></a>Условия проведения измерений


<a id="p100321"></a>Условия измерений (температура, влажность, напряжение сети, атмосферное давление и пр.) должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование, материалы и реактивы.


## 9. <a id="p100322"></a>Список использованной литературы


1. <a id="p100323"></a>Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".
2. <a id="p100324"></a>СП 1.1.1058-01 "Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".
3. <a id="p100325"></a>СП 1.1.2193-07 "Изменения и дополнения к СП 1.1.1058-01 "Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".
4. <a id="p100326"></a>СанПиН 2.3.2.1290-03 "Гигиенические требования к организации производства и оборота биологически активных добавок к пище (БАД)".
5. <a id="p100327"></a>[ГОСТ Р 8.563-2009](https://bukva.ai/docs/gost-r-8-563-2009) ГСИ. Методики (методы) измерений.
6. <a id="p100328"></a>ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.
7. <a id="p100329"></a>ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.
8. <a id="p100330"></a>ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений.
9. <a id="p100331"></a>Tadalafil (англ.). Drugs.com.
10. <a id="p100332"></a>Тадалафил. Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. РЛС Патент. - Инструкция, применение и формула.
11. <a id="p100333"></a>Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil - Labels updated with NAION information. FDA Statement. United States Food and Drug Administration, 8 July 2005 (англ.). WHO Pharmaceuticals Newsletter 2005, No. 03.



<a id="p100334"></a>

---