---
title: "\"МУК 4.1.2675-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания\""
number: "МУК 4.1.2675-10"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodika-muk-4-1-2675-10"
---

## "МУК 4.1.2675-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

# "МУК 4.1.2675-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика выполнения измерений остаточного содержания трифлоксистробина и его метаболита в ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299).
> Документ [введен](#p100002) в действие с 1 октября 2010 года.


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждаю<br>
Руководитель Федеральной<br>
службы по надзору в сфере<br>
защиты прав потребителей<br>
и благополучия человека,<br>
Главный государственный<br>
санитарный врач<br>
Российской Федерации<br>
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**

</div>

2 августа 2010 года


#### <a id="p100003"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100004"></a>**МЕТОДИКА ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ**
**ТРИФЛОКСИСТРОБИНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА В ЯГОДАХ И СОКЕ**
**ВИНОГРАДА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ**
**ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**

<a id="p100005"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**

<div align="right">

**МУК 4.1.2675-10**

<a id="p100002"></a>Дата введения

</div>

1 октября 2010 года

1. <a id="p100006"></a>Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).
2. <a id="p100007"></a>Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.
3. <a id="p100008"></a>Введены впервые.


## 1. <a id="p100009"></a>Назначение и область применения


<a id="p100010"></a>    Настоящий  документ  устанавливает  процедуру  измерений  массовой доли
трифлоксистробина  и  его  метаболита в ягодах и соке винограда в диапазоне
                       -1
(0,02   -   0,2)   млн.     (мг/кг)  методом  высокоэффективной  жидкостной
хроматографии.
<a id="p100011"></a>Название вещества по ИСО: Трифлоксистробин.
<a id="p100012"></a>Название вещества по ИЮПАК: метил(E)-метоксиимино-{(E)-альфа-[1-(альфа,альфа,альфа-трифтор-m-толил)этилиденаминоокси]-о-толил}ацетат.
<a id="p100013"></a>Структурная формула (не приводится).
<a id="p100014"></a>    C  H  F N O .
     20 19 3 2 4
<a id="p100015"></a>    Мол. масса: 408,4.
<a id="p100016"></a>    Белый  порошок  без  запаха.  Температура  плавления: 72,9 °C. Давление
                           -6
паров  при  25 °C: 3,4 x 10   Па. Коэффициент распределения н-октанол-вода:
K    log  P  =  4,5  (25  °C). Растворимость (г/куб. дм) при 25 °C: ацетон,
 ow
толуол,  дихлорметан,  этилацетат  - 500, метанол - 76, гексан - 11, вода -
0,0006.
<a id="p100017"></a>    Вещество стабильно на воздухе и на свету, быстро гидролизуется в водном
растворе при pH 9 (DT   = 1,1 дня).
                     50
<a id="p100018"></a>    В биологически активных  почвах  в анаэробных условиях трифлоксистробин
быстро разрушается: DT   = 0,3 - 1 день, DT   = 4 - 8 дней.
                      50                   90
<a id="p100019"></a>Трифлоксистробин при попадании в воду, почву и растительные объекты быстро гидролизуется с образованием довольно устойчивого метаболита - (E,E)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденаминооксиметил]фенил}-уксусной кислоты (ЦГА 321113).
<a id="p100020"></a>Краткая токсикологическая характеристика
<a id="p100021"></a>    Острая  пероральная   токсичность   (LD  )  для  крыс  и  мышей - более
                                           50
         -1
5000 млн.   (мг/кг); острая дермальная токсичность (LD  ) для крыс  - более
                                                      50
         -1
2000 млн.   (мг/кг); острая ингаляционная токсичность  (LC  )  для  крыс  -
                                                          50
более 4646 мг/куб. м воздуха. Трифлоксистробин не  оказывает  раздражающего
действия  на  кожу и слизистую оболочку глаз кролика. Фунгицид токсичен для
дафний, рыб и водорослей в лабораторном эксперименте.
<a id="p100022"></a>    В России установлены следующие гигиенические нормативы:
                      -1
<a id="p100023"></a>    ДСД  -  0,03  млн.    (мг/кг)  массы тела человека; МДУ в ягодах и соке
                     -1
винограда - 0,05 млн.   (мг/кг).
<a id="p100024"></a>Основной метаболит трифлоксистробина: ЦГА 321113.
<a id="p100025"></a>Название вещества по ИЮПАК: (E)-метоксиимино-{(E)-альфа-[1-(альфа,альфа,альфа-трифтор-m-толил)этилиденаминоокси]-о-толил}ацетат.
<a id="p100026"></a>    C  H  F N O .
     19 17 3 2 4
<a id="p100027"></a>    Мол. масса: 394,4.
<a id="p100028"></a>    Белый порошок без запаха. Другие физико-химические и  токсикологические
характеристики основного метаболита трифлоксистробина отсутствуют.
<a id="p100029"></a>    В биологически активных почвах в аэробных условиях метаболит ЦГА 321113
весьма стабилен: DT   = 110 дней, DT   = 279 дней.
                   50               90
<a id="p100030"></a>Область применения
<a id="p100031"></a>Трифлоксистробин - синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и профилактическим действием.
<a id="p100032"></a>Применяется в России в яблоневых и грушевых садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, альтернариоза, пятнистостей и болезней при хранении с нормой расхода до 75 г д.в./га и двукратной обработкой за сезон с 10 - 14-дневным интервалом.


## 2. <a id="p100033"></a>Метрологические характеристики


<a id="p100034"></a>При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

<a id="p100035"></a>Таблица 1


| Вещество/ анализируемый объект | Диапазон измерений массовой доли, -1 млн. (мг/кг) | Показатель точности (границы относительной погрешности), +/- дельта, %, при P = 0,95 | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % r | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), сигма , % R | Предел повторяемости, r, %, P = 0,95, n = 2 | Критическая разность для результатов анализа, полученных в двух лабораториях, CD , % 0,95 (n = n = 2) 1 2 P = 0,95 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| Трифлоксистробин в ягодах | От 0,020 до 0,10 вкл. | 47 | 10 | 15 | 28 | 37 |
| винограда | Св. 0,10 до 0,20 вкл. | 25 | 5 | 8 | 14 | 20 |
| Трифлоксистробин в соке | От 0,020 до 0,10 вкл. | 38 | 8 | 12 | 22 | 29 |
| винограда | Св. 0,10 до 0,20 вкл. | 28 | 5 | 8 | 14 | 20 |
| Метаболит ЦГА 321113 в ягодах | От 0,02 до 0,10 вкл. | 50 | 10 | 15 | 28 | 37 |
| винограда | Св. 0,10 до 0,20 вкл. | 36 | 7 | 11 | 19 | 27 |
| Метаболит ЦГА 321113 в соке | От 0,02 до 0,10 вкл. | 51 | 12 | 18 | 33 | 44 |
| винограда | Св. 0,10 до 0,20 вкл. | 36 | 9 | 14 | 25 | 34,5 |



## 3. <a id="p100045"></a>Метод измерений


<a id="p100046"></a>Метод основан на экстракции трифлоксистробина и его метаболита из ягод винограда раствором водного ацетона, а из сока - водой, очистке экстрактов, содержащих трифлоксистробина и его метаболита, от коэкстрактивных компонентов перераспределением их в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем, с последующим измерением содержания трифлоксистробина и его метаболита в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.
<a id="p100047"></a>В предлагаемых условиях анализа метод специфичен.


## 4. <a id="p100048"></a>Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы



### <a id="p100049"></a>4.1. Средства измерений


<a id="p100050"></a>Жидкостный хроматограф "Breeze" с ультрафиолетовым
детектором с переменной длиной волны (Waters, США)
либо жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым
детектором (фирма "Knauer", Германия)
<a id="p100051"></a>Весы лабораторные общего назначения модели ВЛА-200
с наибольшим пределом взвешивания 200 г ГОСТ 24104-2001
<a id="p100052"></a>Весы лабораторные общего назначения
с наибольшим пределом взвешивания 500 г ГОСТ 24104-2001
<a id="p100053"></a>Набор гирь ГОСТ 7328-2001
<a id="p100054"></a>Колбы мерные вместимостью 2-100-2, 2-1000-2 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74)
<a id="p100055"></a>Пипетки градуированные 1-1-2-1; 1-1-2-2; 1-2-2-5;
1-2-2-10 [ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91)
<a id="p100056"></a>Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой
П-2-5-0,1; П-2-10-0,2 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74)
<a id="p100057"></a>Цилиндры мерные 1-25; 1-50; 1-100; 1-500; 1-1000 [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74)
<a id="p100058"></a>Иономер универсальный ЭВ-74 или аналогичный ГОСТ 22261-91
<a id="p100059"></a>Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа
вместимостью (20 - 100) куб. мм, модель Microliter #1710
("Hamilton", США)


### <a id="p100060"></a>4.2. Реактивы


<div align="center">

<a id="p100061"></a>Аналитический стандарт трифлоксистробина с содержанием

</div>

основного вещества 99,7% (Байер, Германия)
<a id="p100062"></a>Аналитический стандарт метаболита ЦГА 321113 с
содержанием основного вещества 99,0% (Байер, Германия)
<a id="p100063"></a>Ацетон квалификации ч.д.а. ГОСТ 2603-79
<a id="p100064"></a>Ацетонитрил для хроматографии квалификации х.ч.             ТУ 6-09-3534-87
<a id="p100065"></a>Вода дистиллированная или деионизованная ГОСТ 6709-72
н-Гексан                                                    ТУ 6-09-3375
<a id="p100066"></a>Метиловый спирт (метанол) квалификации х.ч. [ГОСТ 6995-77](https://bukva.ai/docs/standart-gost-6995-77)
<a id="p100067"></a>Метилен хлористый (дихлорметан) квалификации х.ч. [ГОСТ 12794-80](https://bukva.ai/docs/standart-gost-12794-80)
<a id="p100068"></a>Натрия сульфат безводный квалификации х.ч. [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76)
<a id="p100069"></a>Натрия гидроксид квалификации х.ч. ГОСТ 4328-77
<a id="p100070"></a>Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат),
квалификации ч. [ГОСТ 22300-76](https://bukva.ai/docs/gost-22300-76)
<a id="p100071"></a>Кислота ортофосфорная квалификации х.ч., 85,6% ГОСТ 6552-80


### <a id="p100072"></a>4.3 Вспомогательные устройства, материалы


<div align="center">

<a id="p100073"></a>Гомогенизатор Omni-mixer ("Sorvall", США)

</div>

или аналогичный
<a id="p100074"></a>Ванна ультразвуковая, модель D-50, фирма
"Branson Instr. Co." (США)
<a id="p100075"></a>Вата медицинская                                       ТУ 9393-001-00302238
<a id="p100076"></a>Воронка Бюхнера ГОСТ 9147-80
<a id="p100077"></a>Воронки делительные вместимостью 100 и 250 куб. см ГОСТ 25336-82
<a id="p100078"></a>Воронки конусные диаметром 30 - 37 мм ГОСТ 25336-82
<a id="p100079"></a>Колба Бунзена ГОСТ 25336-82
<a id="p100080"></a>Колбы круглодонные на шлифе вместимостью
50 и 100 куб. см ГОСТ 25336-82
<a id="p100081"></a>Колбы плоскодонные вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336-82
<a id="p100082"></a>Колонка хроматографическая стеклянная длиной 25 см
и внутренним диаметром 8 - 10 мм
<a id="p100083"></a>Колонка хроматографическая стальная длиной 15 см,
внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая
<a id="p100084"></a>Диасфер 110-C18 (5 мкм)
<a id="p100085"></a>Насос водоструйный вакуумный                           ГОСТ 10696-75
<a id="p100086"></a>Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М                 ТУ 25-11-917-74
или ротационный вакуумный испаритель
B-169 фирмы "Buchi" (Швейцария)
<a id="p100087"></a>Силикагель 60 (0,063 - 0,2 мм) для колоночной
хроматографии ("Мерк", Германия)
<a id="p100088"></a>Стаканы химические вместимостью 100 и 500 куб. см ГОСТ 25336-82
<a id="p100089"></a>Стекловата
<a id="p100090"></a>Установка для перегонки растворителей
с дефлегматором [ГОСТ 9737-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-9737-93)
                                                       (ИСО 641-75)
<a id="p100091"></a>Фильтры бумажные "красная лента" обеззоленные          ТУ 6-09-2678-77
или фильтры из хроматографической бумаги
<a id="p100092"></a>Ватман 3ММ
<a id="p100093"></a>*Примечание.* Допускается применение других средств измерений, вспомогательных устройств, реактивов и материалов с техническими и метрологическими характеристиками не хуже приведенных в разделе 4.


## 5. <a id="p100094"></a>Требования безопасности


<a id="p100095"></a>5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88.
<a id="p100096"></a>5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90.
<a id="p100097"></a>5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.
<a id="p100098"></a>5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.


## 6. <a id="p100099"></a>Требования к квалификации операторов


<a id="p100100"></a>К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя с опытом работы на жидкостном хроматографе.
<a id="p100101"></a>К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.


## 7. <a id="p100102"></a>Условия измерений


<a id="p100103"></a>7.1. При выполнении измерений соблюдают следующие условия. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в следующих условиях:
- <a id="p100104"></a>температура воздуха (20 +/- 5) °C;
- <a id="p100105"></a>атмосферное давление (84 - 106) кПа;
- <a id="p100106"></a>относительная влажность воздуха не более 80%.

#### <a id="p100107"></a>7.2 Условия хроматографического анализа.

<a id="p100108"></a>Температура колонки: комнатная.
<a id="p100109"></a>Скорость потока элюента: 0,7 куб. см/мин.
<a id="p100110"></a>Рабочая длина волны: 251 нм.
<a id="p100111"></a>Чувствительность детектора: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.
<a id="p100112"></a>Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.
<a id="p100113"></a>Линейный диапазон детектирования: (1 - 10) нг.
<a id="p100114"></a>Подвижная фаза для трифлоксистробина: ацетонитрил-вода (75:25, по объему).
<a id="p100115"></a>Время удерживания трифлоксистробина: 7 мин. 20 с +/- 0,2 мин.
<a id="p100116"></a>    Подвижная  фаза   для  метаболита: ацетонитрил-вода-H PO  (60:39,9:0,1,
                                                         3  4
по объему).
<a id="p100117"></a>Время удерживания метаболита ЦГА 321113: 9 мин. 20 с +/- 0,2 мин.


## 8. <a id="p100118"></a>Подготовка к выполнению измерений


<a id="p100119"></a>Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей, приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, градуировка хроматографа, подготовка колонки с силикагелем.


### <a id="p100120"></a>8.1. Очистка органических растворителей и приготовление растворов



##### <a id="p100121"></a>8.1.1 Очистка ацетонитрила

<a id="p100122"></a>Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 часа, после чего перегоняют. Перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом натрия.

##### <a id="p100123"></a>8.1.2 Очистка н-гексана

<a id="p100124"></a>Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания ее в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

##### <a id="p100125"></a>8.1.3 Очистка этилацетата

<a id="p100126"></a>Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%
<a id="p100127"></a>Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в 40 - 60 куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
<a id="p100128"></a>Срок хранения раствора 1 неделя.
<a id="p100129"></a>Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют.

##### <a id="p100130"></a>8.1.4 Очистка силикагеля

<a id="p100131"></a>Силикагель 60 (0,063 - 0,2 мм) для колоночной хроматографии встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °C в течение 5 часов.


### <a id="p100132"></a>8.2. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта


<a id="p100133"></a>Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку, предназначенную для анализа трифлоксистробина, промывают 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (1:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, затем 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), а колонку, используемую при анализе метаболита, последовательно промывают 25 куб. см смеси этилацетат-метанол (1:1, по объему) и 30 куб. см этилацетат-метанол (9:1, по объему).


### <a id="p100134"></a>8.3. Определение объема элюента, необходимого для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки с силикагелем


<a id="p100135"></a>При отработке методики или поступлении новой партии силикагеля проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки с силикагелем.
<a id="p100136"></a>В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора трифлоксистробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле [(8.6.2)](#p100149) и отдувают растворитель током азота.
<a id="p100137"></a>Остаток растворяют в 0,3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,7 куб. см гексана, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по [8.2](#p100132) для анализа трифлоксистробина. Промывают колонку 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), отбирая последовательно по 10 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по [8.4](#p100140) для анализа трифлоксистробина, перемешивают, а затем хроматографируют. Условия хроматографирования - в соответствии с [7.2](#p100107).
<a id="p100138"></a>В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора метаболита ЦГА 321113 с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле [(8.6.2)](#p100149) и отдувают растворитель током азота. Остаток растворяют в 2,7 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 0,3 куб. см метанола, перемешивают и вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по [8.2](#p100132) для анализа метаболита. Промывают колонку 40 куб. см смеси этилацетат-метанол (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Затем колонку промывают 50 куб. см смеси этилацетат-метанол (7:3, по объему), отбирая последовательно по 10 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 1 куб. см подвижной фазы, подготовленной по [8.4](#p100140) для анализа метаболита, перемешивают, а затем хроматографируют. Условия хроматографирования - в соответствии с [7.2](#p100107).
<a id="p100139"></a>По результатам обнаружения трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 в каждой из фракций определяют объем элюентов, необходимых для полного вымывания трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 из колонки.


### <a id="p100140"></a>8.4. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ


<a id="p100141"></a>В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 750 куб. см ацетонитрила, 250 куб. см деионизованной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эту подвижную фазу используют при анализе трифлоксистробина.
<a id="p100142"></a>В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила, 399 куб. см деионизованной воды и 1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр. Эту подвижную фазу используют при анализе метаболита ЦГА 321113.


### <a id="p100143"></a>8.5. Кондиционирование хроматографической колонки


<a id="p100144"></a>Промывают колонку соответствующей подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по [8.4](#p100140), при скорости подачи растворителя 0,5 куб. см/мин. не менее 2-х часов до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 часа не более 5%, а уровень шумов не более 2% диапазона выходного сигнала на шкале измерений).


### <a id="p100145"></a>8.6. Приготовление градуировочных растворов


<a id="p100146"></a>8.6.1. Исходный градуировочный раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см
<a id="p100147"></a>В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,010 +/- 0,0001 г трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.
<a id="p100148"></a>Раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) хранят в морозильной камере при температуре (-18) °C в течение одного месяца (трех месяцев).
<a id="p100149"></a>8.6.2. Градуировочный раствор трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)
<a id="p100150"></a>В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см [(8.6.1)](#p100146), разбавляют ацетонитрилом, доводят объем раствора до метки. Эти растворы используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.
<a id="p100151"></a>Градуировочный раствор N 1 хранят в морозильной камере при температуре не выше (-18) °C в течение недели (месяца).
<a id="p100152"></a>8.6.3. Градуировочные растворы трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 0,05 - 0,5 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5).
<a id="p100153"></a>В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см [(8.6.2)](#p100149), доводят объем раствора до метки соответствующей подвижной фазой, приготовленной по [8.4](#p100140), тщательно перемешивают, получают растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см, соответственно.
<a id="p100154"></a>Растворы готовят непосредственно перед использованием.


### <a id="p100155"></a>8.7. Градуировка хроматографа


<a id="p100156"></a>Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от массовой концентрации трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.
<a id="p100157"></a>В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют при условиях [7.2](#p100107). Каждый раствор хроматографируют дважды. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.
<a id="p100158"></a>По полученным данным строят градуировочную характеристику.


### <a id="p100159"></a>8.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики


<a id="p100160"></a>Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.
<a id="p100161"></a>Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазонов измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.
<a id="p100162"></a>Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

                        |S    - S  |
                          изм    гр
<a id="p100163"></a>                        ------------ x 100 <= K  ,                      (1)
                            S                  гр
                             гр

<a id="p100164"></a>    где:
<a id="p100165"></a>    S   ,  S    -  значение   площади  пика  трифлоксистробина  (метаболита
     изм    гр
ЦГА  321113)   в   образце   для   контроля,   измеренное  и  найденное  по
градуировочной характеристике соответственно, усл. ед.;
<a id="p100166"></a>    K   - норматив контроля, K   = 0,5 x дельта,
     гр                       гр
<a id="p100167"></a> где +/- дельта - границы относительной погрешности, %, [(табл. 1)](#p100035).
<a id="p100168"></a>Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.
<a id="p100169"></a>Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.


## 9. <a id="p100170"></a>Отбор, подготовка и хранение проб


<a id="p100171"></a>Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными [правилами](https://bukva.ai/docs/2051-79) отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными [ГОСТ 25896-83](https://bukva.ai/docs/gost-25896-83) "Виноград свежий столовый" и ГОСТ 25892-83Е "Сок виноградный. ТУ". Пробы ягод хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 1 дня; для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре (-18) °C. Сок получают из ягод непосредственно перед проведением анализа. Перед анализом ягоды измельчают.


### <a id="p100172"></a>9.1. Экстракция трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113)



##### <a id="p100173"></a>9.1.1 Ягоды винограда

<a id="p100174"></a>Приготовление водного раствора ацетона с объемной долей 80%
<a id="p100175"></a>В мерную колбу вместимостью 500 куб. см вносят 100 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки ацетоном.
<a id="p100176"></a>Срок хранения 1 неделя.
<a id="p100177"></a>Навеску измельченного растительного материала массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, приливают 100 куб. см водного раствора ацетона с объемной долей 80% и гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок переносят в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 70 куб. см водного раствора ацетона с объемной долей 80%, перемешивают и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 5 минут. Суспензию фильтруют и остаток на фильтре промывают 50 куб. см водного раствора ацетона с объемной долей 80%. Экстракты и промывную жидкость переносят в химический стакан вместимостью 500 куб. см, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/4 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см и упаривают на роторном вакуумном испарителе при температуре 30 °C до водного остатка (7 - 10 куб. см). К водному остатку добавляют 20 куб. см деионизованной воды и раствор переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см. Далее проводят очистку экстракта по [9.2](#p100180).

##### <a id="p100178"></a>9.1.2 Виноградный сок

<a id="p100179"></a>Навеску (10 г) свежевыжатого сока помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, приливают 80 куб. см деионизованной воды, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в химический стакан вместимостью 100 куб. см. Дальнейшую очистку экстракта проводят по 9.2.


### <a id="p100180"></a>9.2. Очистка экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей


<a id="p100181"></a>Приготовление раствора гидроксида натрия с молярной концентрацией 1 моль/куб. дм.
<a id="p100182"></a>Растворяют (4 +/- 0,1) г гидроксида натрия в 50 - 70 куб. см дистиллированной воды, затем раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
<a id="p100183"></a>Срок хранения раствора 1 неделя.
<a id="p100184"></a>Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 5 моль/куб. дм.
<a id="p100185"></a>Растворяют (16,4 +/- 0,1) г ортофосфорной кислоты в 50 - 70 куб. см дистиллированной воды, затем переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.
<a id="p100186"></a>Срок хранения раствора 1 неделя.
<a id="p100187"></a>9.2.1. Водную фракцию, полученную по [9.1.1](#p100173) и [9.1.2](#p100178) и помещенную в химический стакан, подщелачивают раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 1 моль/куб. дм до pH 6, контролируя кислотность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см гексана и смесь интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Экстракцию водной фазы повторяют еще два раза, используя 30 и 20 куб. см гексана. Объединенную гексановую фракцию, содержащую трифлоксистробин, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C.
<a id="p100188"></a>9.2.2. Оставшуюся после экстракции гексаном водную фазу переносят в химический стакан и подкисляют раствором ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 5 моль/куб. дм до pH 2, контролируя кислотность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см, приливают 30 куб. см дихлорметана и смесь интенсивно встряхивают в течение 1 минуты. После разделения фаз органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Экстракцию водной фазы повторяют еще два раза, используя 30 и 20 куб. см дихлорметана. Объединенную дихлорметановую фракцию, содержащую метаболит ЦГА 321113, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 30 °C. Дальнейшую очистку экстрактов проводят по 9.3.


### <a id="p100189"></a>9.3. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем


<a id="p100190"></a>При анализе трифлоксистробина сухой остаток гексанового экстракта ягод или сока, полученный по [9.2.1](#p100187), растворяют в 0,3 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 2,7 куб. см гексана, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по [8.2](#p100132) для анализа трифлоксистробина. Колбу обмывают 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 35 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Трифлоксистробин элюируют с колонки 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрил-вода (75:25, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание трифлоксистробина по [10](#p100193).
<a id="p100191"></a>При анализе метаболита ЦГА 321113 сухой остаток дихлорметанового экстракта ягод или сока, полученный по [9.2.2](#p100188), растворяют в 2,7 куб. см этилацетата, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., добавляют 0,3 куб. см метанола, перемешивают, вновь помещают в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по [8.2](#p100132) для анализа метаболита ЦГА 321113. Колбу обмывают 5 куб. см смеси этилацетат-метанол (9:1, по объему), которые также наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см смеси этилацетат-метанол (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Метаболит ЦГА 321113 элюируют с колонки 30 куб. см смеси этилацетат-метанол (7:3, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрил-вода-ортофосфорная кислота (60:39,9:0,1, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание метаболита ЦГА 321113 по [10](#p100193).
<a id="p100192"></a>Полнота извлечения компонентов при проведении всех операций подготовки пробы не менее 80%.


## 10. <a id="p100193"></a>Выполнение измерений


<a id="p100194"></a>10.1. В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы ([9.1](#p100172) - 9.3), анализируют при условиях [7.2](#p100107) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.
<a id="p100195"></a>10.2. Для каждого образца ягод и сока повторяют операции по ([9.1](#p100172) - 9.3), [10.1](#p100194).


## 11. <a id="p100196"></a>Обработка результатов измерений


<a id="p100197"></a>11.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "МультиХром для Windows", версия 1.5х.
<a id="p100198"></a>Альтернативная обработка результатов
                                                                      -1
<a id="p100199"></a>    Массовую  долю  трифлоксистробина  (метаболита ЦГА 321113) X, млн.  , в
ягодах и соке винограда рассчитывают по формуле (2):

                                 S  x A x V
                                  1
<a id="p100200"></a>                             X = ------------,                          (2)
                                 0,8 x S  x m
                                        0

<a id="p100201"></a>    где:
<a id="p100202"></a>    S   - площадь пика трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113) в образце,
     1
мВ;
<a id="p100203"></a>    S   - площадь   пика   трифлоксистробина   (метаболита  ЦГА  321113)  в
     0
градуировочном растворе, мВ;
<a id="p100204"></a>    A  -  массовая  концентрация градуировочного раствора трифлоксистробина
(метаболита ЦГА 321113), мкг/куб. см,
<a id="p100205"></a>    V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;
<a id="p100206"></a>    m  - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта,
использованной   для  очистки  на  колонке  с  силикагелем  и  последующего
хроматографического определения, г.
<a id="p100207"></a>При расчете содержания метаболита ЦГА 321113 в эквивалентах трифлоксистробина полученное значение X умножают на 1,04.
<a id="p100208"></a>11.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

                       2 x |X  - X | x 100
                             1    2
<a id="p100209"></a>                       ------------------- <= r,                        (3)
                            (X  + X )
                              1    2

<a id="p100210"></a>    где:
<a id="p100211"></a>    X ,   X    -   результаты   параллельных   определений   массовой  доли
     1     2
                                               -1
трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), млн.   (мг/кг);
<a id="p100212"></a> r - значение предела повторяемости, % [(табл. 1)](#p100035).
<a id="p100213"></a>Если [условие (3)](#p100209) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

#### <a id="p100214"></a>11.3 Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:


                  _                     _
<a id="p100215"></a>                  X +/- 0,01 x дельта x X, при P = 0,95,

<a id="p100216"></a>    где:
    _
<a id="p100217"></a>    X   -   среднее  арифметическое  значение  результатов  n  определений,
                                    -1
признанных приемлемыми по [11.2](#p100208), млн. (мг/кг);
<a id="p100218"></a> +/- дельта - границы относительной погрешности измерений, % [(табл. 1)](#p100035).
<a id="p100219"></a>При необходимости результаты определения трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 суммируют и сравнивают с утвержденными гигиеническими нормативами.
<a id="p100220"></a>В случае, если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале:
<a id="p100221"></a>    "массовая  доля  трифлоксистробина  в  ягодах  (соке)  винограда  менее
         -1                -1
0,02 млн.   (более 0,2 млн.  )";
<a id="p100222"></a>    "массовая  доля  метаболита  ЦГА 321113 в ягодах (соке) винограда менее
         -1                -1
0,02 млн.   (более 0,2 млн.  )".
<a id="p100223"></a>Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал трифлоксистробина (метаболита ЦГА 321113), превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочных растворов с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют соответствующей подвижной фазой, но не более чем в 10 раз, и анализируют в соответствии с данной методикой. При расчете содержаний компонентов учитывают разбавление.


## 12. <a id="p100224"></a>Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости



#### <a id="p100225"></a>12.1 Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

<a id="p100226"></a>а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;
<a id="p100227"></a>б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).
<a id="p100228"></a>12.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.
<a id="p100229"></a>    12.3.   Приемлемость   результатов   измерений,   полученных   в   двух
лабораториях  оценивают  сравнением разности этих результатов с критической
разностью CD     по формуле (4):
            0,95

                  2 x |X    - X   | x 100
                        ср1    ср2
<a id="p100230"></a>                  ----------------------- <= CD    ,                    (4)
                       (X    + X   )           0,95
                         ср1    ср2

<a id="p100231"></a>    где:
<a id="p100232"></a>    X   ,   X      -   средние  значения  массовой  доли  трифлоксистробина
     ср1     ср2
                                                                        -1
(метаболита ЦГА 321113), полученные в первой и второй лабораториях, млн.  ;
<a id="p100233"></a> CD - значение критической разности, % [(табл. 1)](#p100035).
      0,95
<a id="p100234"></a>Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [(5.3.3)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100287).
<a id="p100235"></a>При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 [(5.3.4)](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100294).


## 13. <a id="p100236"></a>Контроль качества результатов измерений при реализации методики в лаборатории


<a id="p100237"></a>Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по [ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по [6.2.2](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100341) ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по [6.2.4](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-6-2002#p100518) ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Проверку стабильности осуществляют с применением контрольных карт Шухарта.
<a id="p100238"></a>Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.
<a id="p100239"></a>Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.
<a id="p100240"></a>При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.


## 14. <a id="p100241"></a>Разработчики


<a id="p100242"></a>**ГНУ ВНИИФ.**



<a id="p100243"></a>

---