--- title: "\"Методические указания по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени\"" number: "..." issuer: "Федеральная служба по ветеринарному и фитосанитарному надзору" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/metodicheskie-ukazaniya-po-obnaruzheniyu-virusa" --- ## "Методические указания по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени" # "Методические указания по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени" (утв. Россельхознадзором 21.05.2009) Утверждаю Заместитель Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору **Н.А.ВЛАСОВ** 21 мая 2009 года **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ ТИПА A МЕТОДОМ** **ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ** ## 1. Введение Вирус гриппа является возбудителем острых респираторных заболеваний у человека и животных. Он принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вируса гриппа: A, B, C. Вирус типов B и C обычно обнаруживают у людей. Грипп типа A поражает широкий круг хозяев: птиц, людей, свиней, лошадей, морских млекопитающих. Вирус гриппа типа A делят на подтипы на основании антигенных свойств его поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина (H1-15) и нейраминидазы (N1-9). Грипп свиней распространен в большинстве стран мира с развитым свиноводством. Хотя смертность от него минимальна, заболеваемость может доходить до 100%. В настоящее время среди свиней наиболее распространены три подтипа вируса гриппа A: H1N1, H3N2 и H1N2. Подтип H1N1 считают классическим свиным гриппом, известным с 1918 года. С 1979 г. у свиней выделяют антигенно отличающийся вариант H1N1 птичьего происхождения. Вирус подтипа H1N1 является наиболее распространенным, антитела к нему обнаруживают у 25% свиней по всему миру. Подтип H3N2 был впервые выявлен у свиней в 1970 г., он считается результатом межвидового перехода вируса гриппа от человека к свиньям. Подтип H1N2 выделяют от свиней с 1994 г., этот подтип является результатом реассортации вирусов гриппа свиней, человека и птиц. В связи с тем, что свиньи восприимчивы к вирусам гриппа A птиц и человека, они считаются промежуточным хозяином, в котором происходит реассортация генов между свиными, человеческими и птичьими вирусами. Реассортация может приводить к возникновению новых антигенных вариантов вируса гриппа, потенциально способных вызывать эпидемии среди людей. Это обстоятельство определяет значимость гриппа свиней не только для ветеринарии, но и для здравоохранения людей. В этих условиях разработка методов быстрой и высокоспецифичной диагностики гриппа свиней является крайне актуальной задачей. Предлагаемый метод обнаружения вируса гриппа свиней основан на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). ПЦР-РВ сочетает в себе достоинства классической ПЦР (высокую чувствительность, специфичность, быстроту получения результатов) и одновременно обладает рядом преимуществ. Регистрация результатов реакции в режиме реального времени позволяет отказаться от электрофореза продуктов ПЦР, что сокращает продолжительность анализа и уменьшает вероятность ложноположительных результатов из-за контаминации исследуемых проб продуктами амплификации. Методика основана на амплификации высококонсервативного фрагмента гена, кодирующего матриксный протеин M1 вируса гриппа свиней, и позволяет выявлять вирус гриппа A всех подтипов. ## 2. Сущность метода Схема не приводится. Выявление вируса гриппа свиней проводится методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), в которой используются вирусспецифичные праймеры и TaqMan-зонд. Метод ПЦР-РВ позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонд, меченый на 5'-конце флюоресцентным красителем, а на 3'-конце - фосфатной группой и гасителем флюоресценции. Зонд комплементарен внутреннему участку амплифицируемой области генома. Гаситель поглощает испускаемое флюоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. На этапе отжига зонд связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять последний за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флюоресцентная метка отделяется от тушителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флюоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Поскольку геном вируса гриппа свиней представляет собой РНК, проведению собственно ПЦР-РВ предшествует этап обратной транскрипции. ## 3. Область применения Методика предназначена для использования в научно-исследовательских и диагностических учреждениях ветеринарного профиля. ## 4. Оборудование и реактивы Оборудование: 1. ДНК-амплификатор для ПЦР в режиме реального времени (модель Bio-Rad iQ5 или аналоги); 2. Вакуумный насос; 3. Устройство для фильтрации Vacuum Manifold; 4. Микроцентрифуга для пробирок; 5. Микроцентрифуга для плашек на 96 лунок; 6. ПЦР-бокс; 7. Набор автоматических пипеток; 8. Холодильник на +4 °С и на -20 °С; 9. Полипропиленовые плашки 96 лунок на 200 мкл; 10. Одноразовые наконечники к автоматическим пипеточным дозаторам; 11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером; 12. Полипропиленовые пробирки на 0,5 и 1,5 мл. Ферменты и реактивы: 1. AMV обратная транскриптаза (10 ед./мкл); 2. Tag ДНК-полимераза (5 ед./мкл); 3. Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов с концентрацией 10 мМ каждого; 4. 5-кратный реакционный буфер для обратной транскрипции; 5. 10-кратный реакционный буфер для ПЦР; 6. Смесь праймеров для обнаружения вируса гриппа свиней (праймеры M1, M2 в концентрации 10 пМ/мкл каждого); 7. TaqMan-зонд (M* в концентрации 5 пМ/мкл); 8. Контрольная РНК: водный раствор РНК вируса гриппа свиней в концентрации 0,01 мкг/мкл; 9. 6 М гуанидинтиоцианат; 10. 96%-ный этиловый спирт. ## 5. Этапы работы ### 5.1. Выделение РНК 5.1.1. Из образцов исследуемого биологического материала (носовые смывы, экссудат трахеи, 10%-ная суспензия легочной ткани и бронхов, вируссодержащие культуры клеток) отбирают 0,1 мл в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл, смешивают с 0,2 мл 6 М раствора гуанидин-тиоцианата (ГТЦ) и инкубируют при комнатной температуре 3 - 5 мин. Добавляют 0,3 мл этилового спирта, перемешивают и наносят на миниколонки со стекловолокнистыми фильтрами GF/F. С помощью вакуумного насоса и устройства для фильтрации Vacuum Manifold смесь фильтруют. Далее фильтры промывают 3 мл 80%-ного этанола и центрифугируют в течение 1 мин. при 13000 g для удаления остатков этанола. Переносят миниколонку в новую пробирку, добавляют 50 мкл воды и через 3 - 5 минут центрифугируют 30 сек. при 10000 - 13000 g. Полученный раствор РНК сразу используют в реакции обратной транскрипции или хранят при -70 °С. Кроме описанной выше методики, также могут быть использованы отечественные или импортные коммерческие наборы для выделения РНК фирм Биоком, Qiagen и других производителей. ### 5.2. Постановка ОТ-ПЦР в режиме реального времени 1. В пробирку вносят следующие компоненты в указанном порядке из расчета на одну пробирку: деионизированная вода 16 мкл смесь праймеров 1 мкл TaqMan-зонд 1 мкл 10х буфер для ПЦР 3 мкл дНТФ 10 мМ 1 мкл 25 мМ р-р MgCl 3 мкл 2 Taq ДНК-полимераза 1 Ед. (0,2 мкл) AMV обратная транскриптаза 2,5 Ед. (0,25 мкл). 2. Смесь раскапывают в лунки планшета, следя за тем, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха в смеси. 3. В заданные лунки вносят аликвоты РНК (по 5 мкл) и заклеивают планшет оптической пленкой. 4. Центрифугируют планшет (стрип) чтобы собрать со стенок все капли. 5. Устанавливают планшет (стрип) в амплификаторе, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий (R6G) краситель. 6. Проводят ОТ-ПЦР при следующих параметрах: 42 °С - 15 мин. 95 °С - 3 мин. ```text 95 °С - 15 сек.│ │40 - 50 циклов. 60 °С - 50 сек.│ ``` В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: положительный контроль (с РНК вируса гриппа свиней) и отрицательный контроль (с деионизованной водой). Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемых образцов. ### 5.3. Учет результатов амплификации Учет результатов в реакции происходит на каждом цикле. Прибор определяет уровень флуоресценции и строит кинетическую кривую в координатах: уровень флуоресценции - цикл амплификации. В случае присутствия в исследуемой пробе специфической матрицы, кинетическая кривая имеет экспоненциальную зависимость. Программа определяет пороговый цикл реакции (C -threshold cycle), на котором достигается пороговая t флуоресценция. При стандартных условиях проведения исследований и при условии равной эффективности реакции значение C прямо пропорционально логарифму t количества субстрата, что позволяет проводить сравнение количества субстрата. ## 6. Аннотация экспериментальных данных Описанная методика разработана и используется в лаборатории диагностики особо опасных инфекций ФГУ "ВНИИЗЖ". Методические рекомендации разработаны ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" на основании утвержденных Ученым советом и директором ФГУ "ВНИИЗЖ" "Методических указаний по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени". Настоящие Методические указания вступают в действие с момента подписания. ---