Методические указания по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

(утв. Россельхознадзором 21.05.2009)

Утверждаю Заместитель Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору Н. А. Власов 21 мая 2009 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ ВИРУСА ГРИППА СВИНЕЙ ТИПА A МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

1. Введение

Вирус гриппа является возбудителем острых респираторных заболеваний у человека и животных. Он принадлежит к семейству Orthomyxoviridae. Существует три типа вируса гриппа: A, B, C. Вирус типов B и C обычно обнаруживают у людей. Грипп типа A поражает широкий круг хозяев: птиц, людей, свиней, лошадей, морских млекопитающих. Вирус гриппа типа A делят на подтипы на основании антигенных свойств его поверхностных гликопротеинов — гемагглютинина (H1-15) и нейраминидазы (N1-9). Грипп свиней распространен в большинстве стран мира с развитым свиноводством. Хотя смертность от него минимальна, заболеваемость может доходить до 100%. В настоящее время среди свиней наиболее распространены три подтипа вируса гриппа A: H1N1, H3N2 и H1N2. Подтип H1N1 считают классическим свиным гриппом, известным с 1918 года. С 1979 г. у свиней выделяют антигенно отличающийся вариант H1N1 птичьего происхождения. Вирус подтипа H1N1 является наиболее распространенным, антитела к нему обнаруживают у 25% свиней по всему миру. Подтип H3N2 был впервые выявлен у свиней в 1970 г., он считается результатом межвидового перехода вируса гриппа от человека к свиньям. Подтип H1N2 выделяют от свиней с 1994 г., этот подтип является результатом реассортации вирусов гриппа свиней, человека и птиц. В связи с тем, что свиньи восприимчивы к вирусам гриппа A птиц и человека, они считаются промежуточным хозяином, в котором происходит реассортация генов между свиными, человеческими и птичьими вирусами. Реассортация может приводить к возникновению новых антигенных вариантов вируса гриппа, потенциально способных вызывать эпидемии среди людей. Это обстоятельство определяет значимость гриппа свиней не только для ветеринарии, но и для здравоохранения людей. В этих условиях разработка методов быстрой и высокоспецифичной диагностики гриппа свиней является крайне актуальной задачей. Предлагаемый метод обнаружения вируса гриппа свиней основан на полимеразной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ). ПЦР-РВ сочетает в себе достоинства классической ПЦР (высокую чувствительность, специфичность, быстроту получения результатов) и одновременно обладает рядом преимуществ. Регистрация результатов реакции в режиме реального времени позволяет отказаться от электрофореза продуктов ПЦР, что сокращает продолжительность анализа и уменьшает вероятность ложноположительных результатов из-за контаминации исследуемых проб продуктами амплификации. Методика основана на амплификации высококонсервативного фрагмента гена, кодирующего матриксный протеин M1 вируса гриппа свиней, и позволяет выявлять вирус гриппа A всех подтипов.

2. Сущность метода

Схема не приводится.

Выявление вируса гриппа свиней проводится методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), в которой используются вирусспецифичные праймеры и TaqMan-зонд. Метод ПЦР-РВ позволяет проводить детекцию продуктов амплификации в процессе реакции и вести мониторинг кинетики накопления ампликонов. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонд, меченый на 5'-конце флюоресцентным красителем, а на 3'-конце — фосфатной группой и гасителем флюоресценции. Зонд комплементарен внутреннему участку амплифицируемой области генома. Гаситель поглощает испускаемое флюоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3'-положении блокирует полимеразу. На этапе отжига зонд связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с зондом, начинает расщеплять последний за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате флюоресцентная метка отделяется от тушителя, и ее свечение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флюоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Поскольку геном вируса гриппа свиней представляет собой РНК, проведению собственно ПЦР-РВ предшествует этап обратной транскрипции.

3. Область применения

Методика предназначена для использования в научно-исследовательских и диагностических учреждениях ветеринарного профиля.

4. Оборудование и реактивы

Оборудование:

1. ДНК-амплификатор для ПЦР в режиме реального времени (модель Bio-Rad iQ5 или аналоги);

2. Вакуумный насос;

3. Устройство для фильтрации Vacuum Manifold;

4. Микроцентрифуга для пробирок;

5. Микроцентрифуга для плашек на 96 лунок;

6. ПЦР-бокс;

7. Набор автоматических пипеток;

8. Холодильник на +4 °С и на -20 °С;

9. Полипропиленовые плашки 96 лунок на 200 мкл;

10. Одноразовые наконечники к автоматическим пипеточным дозаторам;

11. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером;

12. Полипропиленовые пробирки на 0,5 и 1,5 мл. Ферменты и реактивы:

1. AMV обратная транскриптаза (10 ед./мкл);

2. Tag ДНК-полимераза (5 ед./мкл);

3. Смесь дезоксинуклеозидтрифосфатов (дНТФ). Водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов с концентрацией 10 мМ каждого;

4. 5-кратный реакционный буфер для обратной транскрипции;

5. 10-кратный реакционный буфер для ПЦР;

6. Смесь праймеров для обнаружения вируса гриппа свиней (праймеры M1, M2 в концентрации 10 пМ/мкл каждого);

7. TaqMan-зонд (M* в концентрации 5 пМ/мкл);

8. Контрольная РНК: водный раствор РНК вируса гриппа свиней в концентрации 0,01 мкг/мкл;

9. 6 М гуанидинтиоцианат;

10. 96%-ный этиловый спирт.

5. Этапы работы

5.1. Выделение РНК

5.1.1. Из образцов исследуемого биологического материала (носовые смывы, экссудат трахеи, 10%-ная суспензия легочной ткани и бронхов, вируссодержащие культуры клеток) отбирают 0,1 мл в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл, смешивают с 0,2 мл 6 М раствора гуанидин-тиоцианата (ГТЦ) и инкубируют при комнатной температуре 3 — 5 мин. Добавляют 0,3 мл этилового спирта, перемешивают и наносят на миниколонки со стекловолокнистыми фильтрами GF/F. С помощью вакуумного насоса и устройства для фильтрации Vacuum Manifold смесь фильтруют. Далее фильтры промывают 3 мл 80%-ного этанола и центрифугируют в течение 1 мин. при 13000 g для удаления остатков этанола. Переносят миниколонку в новую пробирку, добавляют 50 мкл воды и через 3 — 5 минут центрифугируют 30 сек. при 10000 — 13000 g. Полученный раствор РНК сразу используют в реакции обратной транскрипции или хранят при -70 °С. Кроме описанной выше методики, также могут быть использованы отечественные или импортные коммерческие наборы для выделения РНК фирм Биоком, Qiagen и других производителей.

5.2. Постановка ОТ-ПЦР в режиме реального времени

1. В пробирку вносят следующие компоненты в указанном порядке из расчета на одну пробирку:

    деионизированная вода                               16 мкл
    смесь праймеров                                     1 мкл
    TaqMan-зонд                                         1 мкл
    10х буфер для ПЦР                                   3 мкл
    дНТФ 10 мМ                                          1 мкл
    25 мМ р-р MgCl                                      3 мкл

              2

    Taq ДНК-полимераза                                  1 Ед. (0,2 мкл)
    AMV обратная транскриптаза                          2,5 Ед. (0,25 мкл).

2. Смесь раскапывают в лунки планшета, следя за тем, чтобы не допустить образования пузырьков воздуха в смеси.

3. В заданные лунки вносят аликвоты РНК (по 5 мкл) и заклеивают планшет оптической пленкой.

4. Центрифугируют планшет (стрип) чтобы собрать со стенок все капли.

5. Устанавливают планшет (стрип) в амплификаторе, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий (R6G) краситель.

6. Проводят ОТ-ПЦР при следующих параметрах: 42 °С — 15 мин. 95 °С — 3 мин.

    95 °С - 15 сек.│
                   │40 - 50 циклов.
    60 °С - 50 сек.│

В каждой серии анализов ставят два контрольных образца: положительный контроль (с РНК вируса гриппа свиней) и отрицательный контроль (с деионизованной водой). Смеси для контрольных образцов готовят по той же прописи, что и для исследуемых образцов.

5.3. Учет результатов амплификации

    Учет   результатов   в  реакции  происходит  на  каждом  цикле.  Прибор
определяет   уровень   флуоресценции   и   строит   кинетическую  кривую  в
координатах:   уровень   флуоресценции   -   цикл  амплификации.  В  случае
присутствия  в исследуемой пробе специфической матрицы, кинетическая кривая
имеет  экспоненциальную  зависимость.  Программа  определяет пороговый цикл
реакции    (C -threshold   cycle),   на   котором   достигается   пороговая

         t

флуоресценция.

    При  стандартных  условиях проведения исследований и при условии равной
эффективности   реакции    значение   C   прямо  пропорционально  логарифму

                                   t

количества субстрата, что позволяет проводить сравнение количества субстрата.

6. Аннотация экспериментальных данных

Описанная методика разработана и используется в лаборатории диагностики особо опасных инфекций ФГУ «ВНИИЗЖ». Методические рекомендации разработаны ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» на основании утвержденных Ученым советом и директором ФГУ «ВНИИЗЖ» «Методических указаний по обнаружению вируса гриппа свиней типа A методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».

Настоящие Методические указания вступают в действие с момента подписания.

---