Методические указания по микробиологическому способу выявления комплекса микотоксинов в зерне, отрубях и муке

(утв. Минсельхозом СССР 10.12.1986)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ СПОСОБУ ВЫЯВЛЕНИЯ КОМПЛЕКСА МИКОТОКСИНОВ В ЗЕРНЕ, ОТРУБЯХ И МУКЕ

1. Общие положения

1.1. Зерно и продукты его переработки могут поражаться токсигенными микроскопическими грибами, токсические метаболиты которых (микотоксины) вызывают острые и хронические отравления животных.

1.2. Метод основан на использовании селекционированных, чувствительных к токсическим метаболитам грибов дрожжевых и бактериальных тест-культур, что позволяет быстро, в течение 24 — 48 ч, выявлять комплексы микотоксинов, образуемых Fusarium sporotrichiella (Т-2-, НТ-2-токсины; диацетоксисцирпенол, ниваленол), Aspergillus fumigatus (койевая кислота, аспергилловая и гельволевая кислоты, глиотоксин, фумигатин), Dendrodochium toxicum, Myrothecium verrucaria, M. roridum (веррукарин А, роридин А, роридин Н) и Penicillium urticae (патулин <*>).

---

<*> Патулин образуют также некоторые другие виды грибов рода Penicillium, Aspergillus, в частности P. patulinum, P. claviforme, Asp. clavatus и др.

В качестве тест-организмов для определения комплекса микотоксинов, образуемых F. sporotrichiella, используют культуру Saccharomyces fragilis, штамм D-25; D. toxicum и грибами рода Myrothecium — Saccharomyces vini, шт. «Феодосия»; Asp. fumigatus — Staphilococcus aureus, шт. 209; Penicillium urticae, шт. 1749.

Индикаторные тест-культуры высылает Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН УССР (252143, Киев, ул. Заболотного, 26).

Указанные тест-культуры дают зоны задержки роста при наличии микотоксинов в исследуемых образцах кормов. Размер зоны пропорционален содержанию микотоксинов в исследуемых кормах.

1.3. Чувствительность метода для комплекса токсинов, образуемых грибами родов Dendrodochium и Myrothecium, 10 — 25 мкг/кг, Asp. fumigatus — 10 — 20 мкг/кг, Fusarium 50 — 100 мкг/кг, Penicillium и патулинообразующих видов рода Aspergillus — 25 мкг/кг. Микробиологический метод позволяет обнаруживать наличие указанных токсических метаболитов в зерне, отрубях и муке в течение 24 — 48 ч.

2. Реактивы и оборудование

Хлороформ (для наркоза), спирт этиловый (ректификат), мясо-пептонный агар (МПА), сусло-агар (СА), колбы с притертой пробкой на 500 мл, воронки стеклянные разные, выпарительные чашки разные, пипетки градуированные разные, микропипетки на 0,1 мл, петля микробиологическая, пробирки разные, чашки Петри, мельница лабораторная электрическая, шуттель-аппарат, фильтровальная бумага, диски из фильтровальной бумаги диаметром 5 мм, водяная баня, холодильник шариковый, колбы круглодонные со шлифом, пробки стеклянные со шлифом, термостат, автоклав лабораторный, лампа бактерицидная.

3. Подготовка материалов для исследования

3.1. Средние образцы кормов отбирают в соответствии с действующими государственными стандартами: зерно фуражное, ГОСТ 13586.3-83; муку и отруби, ГОСТ 9404-88.

3.2. Для анализа из средней пробы отбирают 50 г корма, измельчают на мельнице, помещают в колбу с притертой пробкой и заливают 200 мл хлороформа. Экстрагирование осуществляют на шуттель-аппарате в течение 2 ч.

3.3. Экстракт фильтруют через 2 слоя марли и бумажный фильтр в выпарительную чашку, которую выдерживают под тягой до исчезновения запаха растворителя, после чего в чашку добавляют 2 мл этилового спирта и, перемешивая легкими круговыми движениями, растворяют осадок. Спиртовым раствором, содержащим растворимые метаболиты, пропитывают диски фильтровальной бумаги (по две на каждую индикаторную культуру) и подсушивают их на воздухе.

3.4. Диски готовят из фильтровальной бумаги с помощью канцелярского дырокола и стерилизуют их в сушильном шкафу в течение 2 ч при температуре 100 — 120 °C.

3.5. Индикаторные культуры выращивают в бактериологических пробирках в течение 24 ч на следующих средах Sacch. fragilis и Sacch. vini — на скошенном сусло-агаре или среде Ридера при 26 °C; Staph. aureus и E. coli — на скошенном мясо-пептонном агаре при 37 °C.

3.6. Выращенные таким образом суточные культуры смывают физиологическим раствором хлорида натрия (3 — 5 мл) до получения однородной суспензии бактериальных культур с концентрацией 10 ед. по оптическому стандарту мутности, дрожжевых культур — 5 ед.

3.7. Суспензии индикаторных культур вносят по 0,1 мл в пробирки с 10 мл расплавленной и охлажденной до 45 °C среды, тщательно перемешивают и выливают в чашки Петри, подогретые до 40 — 50 °C.

4. Выявление микотоксинов в кормах

5. Учет и оценка результатов исследования

5.1. Отсутствие зон задержки роста индикаторных культур свидетельствует о том, что исследуемые образцы кормов не содержат токсических метаболитов грибов Fus. sporotrichiella, D. toxicum, M. verrucaria, M. roridum, Asp. fumigatus, Penicillium urticae и др. патулинообразующих грибов. Такой корм может быть использован для кормления животных.

5.2. Появление зон задержки роста хотя бы одной из индикаторных культур указывает на наличие в исследуемых кормах токсических метаболитов грибов.

5.3. Пробы корма, давшие положительные результаты по микробиологическому методу, исследуют методами, предусмотренными Методическими указаниями по санитарно-микологической оценке и улучшению качества кормов от 25.02.85 и в зависимости от полученных результатов решают вопрос об использовании корма.

Приложение

ПРИГОТОВЛЕНИЕ СРЕДЫ РИДЕРА

Среду Ридера можно применять вместо суслового агара. Для ее приготовления готовят основной и два дополнительных раствора.

    Приготовление   основного  раствора  N 1.   Берут  800 мл  кипяченой  и
профильтрованной  водопроводной  воды  и  растворяют  в  ней  компоненты  в
следующей    последовательности:   сульфат   аммония   (NH ) SO ,   ч.д.а.,
                                                          4 2  4
ГОСТ 3769-60 - 5 г; сульфат магния, MgSO  x 7H O,  ч.д.а.,   ГОСТ 4523-67 -
                                        4     2
0,7 г; хлорид натрия, NaCl,  ч.д.а., ГОСТ 4233-66 - 0,5 г; сахароза ч.д.а.,
ГОСТ 5733-54 - 8 г; дрожжевой  автолизат, ТУ 10П-308-69 - 10 г; агар-агар -

20 г.

Основной раствор № 1 стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин.

    Приготовление  раствора N 2.  В 200 мл дистиллированной воды растворяют
1 г  дигидрофосфата   калия   (KH PO ,   ч.д.а.,  ГОСТ 4198-65)   и   0,2 г
                                 2  4
гидрофосфата калия (KH PO ,  ч.д.а., ГОСТ 2413-65). Раствор стерилизуют при
                      2  4

0,5 атм. в течение 30 мин.

Раствор № 2 добавляют стерильно к основному раствору № 1.

Приготовление раствора № 3. Смесь микроэлементов. Раствор готовят по следующей прописи: борная кислота, H BO , ч.д.а., ГОСТ 9656-61 — 50 мг;

                                        3  3
сульфат  меди,  CuSO  x 5H O,  ч.д.а.,  ГОСТ 4165-68 - 4;  йодит калия, KI,
                    4     2
ч.д.а.,  ГОСТ  4232-65 - 10;  сульфат марганца, MnSO  x 7H O, ч.д.а.,  ГОСТ
                                                    4     2

435-67 — 40; натрий молибденовокислый, Na MoO , ч.д.а., ГОСТ 10931-64 — 20;

                                         2   4
сульфат    цинка,   ZnSO  x 7H O,   ч.д.а.,   ГОСТ  4174-69 - 40 мг;   вода
                        4     2

дистиллированная — до 100 мл.

Смесь микроэлементов перед употреблением кипятят на слабом огне в течение 15 — 20 мин., взбалтывают и 1 мл раствора стерильно вносят в стерильный основной раствор № 1.

Используемые дрожжевые тест-культуры на среде Ридера проявляют ростовые характеристики, аналогичные росту на сусло-агаре.

---