Методические указания по лабораторной диагностике эмфизематозного карбункула

(утв. Минсельхозом СССР 10.10.1982)

Утверждены Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 10 октября 1982 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО КАРБУНКУЛА

1. Общие положения.

1.1. Эмфизематозный (шумящий) карбункул — острая неконтагиозная инфекционная болезнь, преимущественно крупного рогатого скота, а иногда и овец, характеризующаяся крепитирующими отеками мышечной ткани.

1.2. Возбудитель заболевания Cl. chauvoei — строгий анаэроб, представляет собой спорообразующую, полиморфную, подвижную палочку с закругленными концами. В мазках-отпечатках и молодых культурах окрашивается грамположительно, в старых культурах — грамотрицательно.

1.3. Диагноз на эмфизематозный карбункул ставят на основании клинических патологоанатомических, эпизоотологических данных и результатов лабораторных исследований.

1.4. Для исследования в лабораторию направляют кусочки пораженных мышц, экссудат из крепитирующего отека. При этом прокипяченными инструментами вскрывают кожу, после чего инструменты меняют. Пораженный участок разрезают в глубину и из средней части мышцы отбирают кусочки пораженной ткани размером 3x3x3 см. В случае вскрытия трупа берут также кусочки печени и селезенки, кровь сердца. Материал для лабораторного исследования отбирают не позднее чем через 4 ч с момента гибели животного. В жаркое время года патологический материал консервируют 30%-ным стерильным водным раствором глицерина.

1.5 Исследование на эмфизематозный карбункул включает микроскопию мазков из патологического материала, посевы на питательные среды и заражение лабораторных животных.

2. Микроскопическое исследование.

2.1. Кусочками мышц и другого патологического материала на обезжиренных предметных стеклах делают мазки-отпечатки и окрашивают по Граму или Муромцеву.

При микроскопии видны отдельные или попарно лежащие полиморфные (веретенообразные, шаровидные, грушевидные) зернистоокрашенные грамположительные палочки со спорами, которые расположены центрально или субтерминально, но могут лежать и свободно. Споры окраску не воспринимают.

3. Бактериологическое исследование.

3.1. Высевы из патологического материала делают в среду Китта — Тароцци, МПБ и на МПА. Для этого кусочки мышц, печени, селезенки обжигают на пламени и помещают в пробирки или флаконы со средой Китта — Тароцци; высевы в МПБ и на МПА, а также посевы крови и экссудата делают пастеровской пипеткой.

Среду Китта — Тароцци предварительно регенерируют — прогревают в кипящей водяной бане в течение 15 — 30 мин, после чего быстро охлаждают до 45 — 50 °C. Одновременно высев можно делать и на глюкозо-кровяной агар Цейсслера в чашках Петри.

При поступлении несвежего патологического материала из него готовят суспензию на физиологическом растворе (1:4), которую прогревают в течение 15 — 20 мин при 80 °C, после чего делают высев.

Засеянные пробирки помещают в термостат на 24 — 48 ч при 37 — 38 °C. Чашки выдерживают в анаэробных условиях 24 — 48 ч.

Для создания анаэробных условий наиболее приемлем физический метод. Чашки, не переворачивая (дном вниз), помещают в микроанаэростат или эксикатор, из которого удаляют воздух при помощи вакуум-насоса.

Из других методов можно применять химический с использованием гидросульфита натрия (Na2S2O4) и бикарбоната натрия (Na2CO3). Чашки Петри с посевами ставят на обычное стекло дном вверх. Кислородпоглощающую смесь насыпают в 2 — 3 чашки Петри с разбитыми крышками и слегка увлажняют. Одну чашку ставят под чашки с посевами, другую — между ними, а третью — сверху. Все чашки закрывают стеклянным цилиндром, предварительно поместив под цилиндр индикаторную марлю. Герметичность создают, обмазывая пластилином края цилиндра в месте соприкосновения со стеклом.

Обесцвечивание индикаторной марли через сутки инкубации посева в термостате указывает на создание условий анаэробиоза. Если марля не обесцветилась, необходимо добавить к поглощающей смеси гидросульфит.

Приготовление индикатора. Марлю или фильтровальную бумагу пропитывают раствором следующего состава: 10%-ного раствора глюкозы 4,2 мл, нормального раствора едкого натра 0,1 мл, 1,5%-ного раствора метиленовой сини в дистиллированной воде 0,1 мл. После высыхания марлю или бумагу режут на кусочки и хранят в банках из темного стекла.

3.2. При росте Cl. chauvoei на среде Китта — Тароцци сначала наблюдается помутнение бульона, равномерно распределяющееся по всему столбику. Через 20 — 24 ч питательная среда начинает просветляться, и к 36 — 48 ч столбик ее становится прозрачным, а на дне пробирки или флакона образуется осадок микробных клеток. Газообразование незначительное. При микроскопии культур обнаруживают отдельные или попарно лежащие грамположительные палочки и палочки со спорами.

3.3. Для выделения чистой культуры возбудителя из жидких питательных сред делают дробный рассев на 3 — 4 чашки с глюкозо-кровяным агаром Цейсслера, предварительно подсушенным в термостате в течение 5 — 6 ч. Засеянные чашки выдерживают в анаэробных условиях 24 — 48 ч в термостате при 37 — 38 °C.

3.4. На агаре Цейсслера наблюдается характерный рост колоний в виде перламутровой пуговицы или с изрезанными краями (виноградный лист), вокруг колоний — неширокая зона гемолиза. Если в первичных посевах была получена смешанная культура — характерные колонии отсевают в пробирки со средой Китта — Тароцци и выращивают 24 — 36 ч, отмечая характер роста, морфологию и тинкториальные свойства.

3.5. В случае, когда к моменту выделения чистой культуры возбудителя морские свинки, зараженные исходным материалом, живы, полученную культуру проверяют на патогенность путем заражения морских свинок в дозе 0,5 мл.

3.6. При наличии типичного роста на жидкой и плотной питательных средах, характерных морфологических и тинкториальных свойств выделенную культуру относят к Cl. chauvoei.

4. Биологическое исследование.

4.1. Одновременно с посевами заражают лабораторных животных. Для этого кусочки мышц, селезенки или печени измельчают и тщательно растирают в стерильной ступке с небольшим количеством МПБ в равномерную взвесь. Полученную взвесь (1:10) в дозе 0,5 — 1,0 мл вводят подкожно в области брюшных мышц двум морским свинкам массой 350 — 400 г. Кровь и мышечный экссудат вводят таким же способом в дозе 0,5 — 1,0 мл. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 8 сут.

4.2. При наличии Cl. chauvoei животные погибают в течение 24 — 96 ч. У павших морских свинок на коже отмечается серозно-некротический выпот, разлитые или точечные кровоизлияния. Кожа от пораженных мышц отделяется с трудом. Мышцы груди, брюшного пресса, иногда и задних конечностей темно-красного цвета. В паховых и реже в подмышечных областях обнаруживаются незначительные скопления пузырьков газа. Кишечник не вздут, а как бы уложен, органы брюшной полости без видимых изменений. Желчный пузырь переполнен желчью.

4.3. Из трупа или убитой в агональном состоянии морской свинки делают посевы из места введения материала, крови сердца и печени в среду Китта — Тароцци, МПБ и на МПА. Готовят мазки-отпечатки из тех же органов, а также с диафрагмальной поверхности печени.

4.4. В мазках-отпечатках с диафрагмальной поверхности печени, окрашенных по Граму или Муромцеву, обнаруживают отдельно лежащие палочки, редко встречаются цепочки из 2 — 3 члеников, что является одним из дифференцирующих признаков от Cl. septicum, при заражении которым в мазках с поверхности печени обнаруживают нити или длинные цепочки.

4.5. При необходимости дифференциации эмфизематозного карбункула от злокачественного отека суспензией из органов (1:10) или культурой заражают кролика массой 2,0 — 2,5 кг подкожно в область спины в дозе 1,0 — 1,5 мл. При наличии возбудителя эмфизематозного карбункула кролик не погибает.

5. Диагноз на эмфизематозный карбункул считают установленным в случае:

выделения из патологического материала культуры со свойствами, характерными для возбудителя этого заболевания, и гибели хотя бы одной морской свинки с типичной патологоанатомической картиной и выделением из ее органов культуры возбудителя;

гибели хотя бы одной морской свинки из двух, зараженных исходным материалом, при наличии у нее типичной для данного заболевания патологоанатомической картины и выделении из ее органов культуры возбудителя, если даже в посевах из исходного материала культура возбудителя не выделена.

6. Срок исследования — до 8 дн.

---