---
title: "\"Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц)\""
issuer: "Министерство сельского хозяйства СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodicheskie-ukazaniya-po-laboratornoy-minselhoz-sssr-ministerstvo-8"
---

## "Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц)"

# "Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц)"

(утв. Минсельхозом СССР 01.02.1972)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждены<br>
1 февраля 1972 года

</div>


<div align="center">

<a id="p100002"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**<br>
**ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ**<br>
**НЬЮКАСЛА И КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ ПТИЦ (ГРИППА ПТИЦ)**

</div>


1. <a id="p100003"></a>Болезнь Ньюкасла (синоним - псевдочума) птиц и классическая чума птиц (синоним - грипп птиц) - высококонтагиозные болезни птиц, сопровождающиеся высокой летальностью. Ввиду большого сходства клинических признаков, патологических изменений и эпизоотических данных обеих инфекций их точно дифференцировать можно только лабораторными методами.
<a id="p100004"></a>Необходимость типирования возбудителей этих болезней связана с особенностью их специфической профилактики.
2. <a id="p100005"></a>Лабораторная диагностика болезни Ньюкасла и классической чумы птиц проводится путем:
- <a id="p100006"></a>выделения возбудителя в развивающихся куриных эмбрионах;
- <a id="p100007"></a>постановки биопробы на птице;
- <a id="p100008"></a>типирования выделенного вируса в реакциях задержки гемагглютинации, нейтрализации и связывания комплемента;
- <a id="p100009"></a>постановки дополнительных тестов [(схема 1)](#p100011).

<a id="p100010"></a>Схема 1

<div align="right">

<a id="p100011"></a>Выделение и типирование возбудителей болезни Ньюкасла

</div>

<div align="center">

и классической чумы птиц (гриппа птиц). Исследуемый<br>
патологический материал - 10%-ная суспензия селезенки<br>
(можно печени и мозга)

</div>



| <a id="p100012"></a><a id="p100013"></a>1. РГА с 1% эритроцитами кур<br>2. РЗГА с эталонными диагностическими сыворотками. Типирование закончено | <a id="p100014"></a><a id="p100015"></a><a id="p100016"></a><a id="p100017"></a><a id="p100018"></a><a id="p100019"></a>3. Если [п. 1](#p100012) отрицателен, выделяют вирус на куриных эмбрионах в разведениях 1:10, 1:1000<br>4. РГА с аллантоисной культурой вируса и 1% эритроцитами кур<br>5. РЗГА с эталонными диагностическими сыворотками. Типирование закончено<br>6. Если [п. 5](#p100016) не внес ясности, поставить РЗГА с аллантоисной культурой, обработанной идентифицирующими растворами А и Б. Типирование закончено<br>7. Если [п. 6](#p100017) не внес ясности, исключить двойную инфекцию постановкой РН с эталонными диагностическими сыворотками<br>8. Постановка РЗГА [(п. 6)](#p100017) с вирусом, полученным после РН. Типирование закончено | <a id="p100020"></a>9. Если вирус не выделен в разведении 1:1000. Постановка биопробы |
| --- | --- | --- |



## <a id="p100021"></a>I. ВЫДЕЛЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ


3. <a id="p100022"></a>Для выделения вирусов болезни Ньюкасла и классической чумы птиц требуется следующее:
- <a id="p100023"></a>исследуемый материал - больная птица или трупы свежепогибших птиц или селезенка (печень, мозг, почки, легкие) от них;
- <a id="p100024"></a>физиологический раствор pH 7,0...7,3;
- <a id="p100025"></a>стерильные ступки с пестиками;
- <a id="p100026"></a>стерильный речной или стеклянный песок;
- <a id="p100027"></a>стерильные пробирки бактериологические или пенициллиновые флаконы;
- <a id="p100028"></a>стерильные пипетки на 1 и 5 мл;
- <a id="p100029"></a>стерильные шприцы на 1 мл;
- <a id="p100030"></a>термостат или инкубатор на 37 °C;
- <a id="p100031"></a>лабораторная центрифуга типа ЦЛ-1 или ЦЛ-3;
- <a id="p100032"></a>лотки для куриных эмбрионов;
- <a id="p100033"></a>овоскоп.
4. <a id="p100034"></a>Из селезенки (печени, легких, мозга, почки) готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе с соблюдением правил асептики. Для этого из исследуемого материала делают навеску в 1 г, помещают ее в стерильную ступку и растирают с небольшим количеством речного или стеклянного песка до получения гомогенной массы и затем добавляют 9 мл физиологического раствора, содержащего 100 ЕД/мл тетрациклин и 1:10 000 тиомерсана (0,1 г на 1000 мл физраствора). Полученную массу еще раз тщательно растирают в ступке и переносят пипеткой в пробирку или пенициллиновый флакон.
<a id="p100035"></a>Для освобождения взвеси от крупных частиц суспензию подвергают центрифугированию при 3000 об/мин 15 мин или отстаиванию при температуре от 0 до 4 °C два часа.
<a id="p100036"></a>В дальнейшем используют только надосадочную жидкость.
5. <a id="p100037"></a>Из полученной надосадочной жидкости делают дополнительно разведение 1:1000 на физиологическом растворе.
<a id="p100038"></a>Исследуемым материалом в разведениях 1:10 и 1:1000 заражают по 6 куриных эмбрионов (всего 12 эмбрионов).
<a id="p100039"></a>Для заражения используют чистые куриные эмбрионы с белой скорлупой в возрасте 10 дней.
<a id="p100040"></a>Перед заражением эмбрионы овоскопируют, отмечают пугу, положение зародыша, бессосудистую зону на боковой поверхности хорионаллантоисной оболочки. Затем эмбрионы обрабатывают спиртом с 0,1%-ным содержанием настойки йода и фламбируют.
<a id="p100041"></a>Инструменты и шприцы перед работой стерилизуют кипячением и помещают в стерильные чашки Петри.
<a id="p100042"></a>Для заражения эмбриона копьем в скорлупе пробивают отверстия в центре пуги и сбоку в бессосудистой зоне. Через боковое отверстие на глубину 0,2...0,3 мм инокулируют разведения в объеме 0,1...0,2 мл. Можно заражать эмбрионы и через пугу. Отверстия заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37 °C и овоскопируют 2 раза в день.
<a id="p100043"></a>Погибшие эмбрионы вскрывают в день гибели, а оставшиеся живыми через 56...72 ч после заражения охлаждают при 4 °C в течение 12 ч и также вскрывают.
<a id="p100044"></a>Перед вскрытием эмбрионов пугу обрабатывают 0,1%-ным спиртовым раствором настойки йода и фламбируют. После этого ножницами с изогнутыми браншами, направленными вверх, отделяют пугу, затем пинцетом снимают подскорлупную оболочку, делают надрыв хорионаллантоисной оболочки и пастеровской пипеткой отсасывают аллантоисную жидкость.
<a id="p100045"></a>При вскрытии учитывают изменения эмбрионов. Характерными признаками поражения эмбрионов вирусом болезни Ньюкасла или классической чумы птиц считается гибель эмбрионов через 20...76 ч в зависимости от вирулентности штамма вируса, с наличием множественных кровоизлияний на темени, теле и лапках зародыша.
<a id="p100046"></a>От зараженных эмбрионов собирают аллантоисную жидкость в стерильные пробирки (из каждого разведения отдельно), которую проверяют на гемагглютинирующую активность и отсутствие бактериального загрязнения высевом на МПБ и МПА.
6. <a id="p100047"></a>Если вирус обнаружен в разведениях 1:10 и 1:1000, следует считать причину гибели птицы установленной после того, как будет типирован возбудитель.
7. <a id="p100048"></a>Типирование вируса болезни Ньюкасла и классической чумы птиц проводят в реакциях задержки гемагглютинации, и как исключение, в реакциях нейтрализации и связывания комплемента.


## <a id="p100049"></a>II. ПОСТАНОВКА БИОПРОБЫ


8. <a id="p100050"></a>Постановку биопробы проводят только в сомнительных случаях (при отсутствии клинических признаков и патологоанатомических изменений у птиц или при выделении вируса из гомогенатов исследуемых органов только в разведении 1:10).
<a id="p100051"></a>Биопробу проводят на неиммунной к болезни Ньюкасла или классической чуме птице того же возраста и породы, на которой установлено заболевание.
<a id="p100052"></a>Перед постановкой биопробы птиц проверяют на отсутствие в крови антигемагглютининов (см. [раздел III](#p100056)).
<a id="p100053"></a>Четырем птицам (у которых не обнаружено в крови антигемагглютининов) внутримышечно вводят 10%-ную суспензию исследуемых органов или аллантоисную вируссодержащую жидкость. За зараженной птицей устанавливают наблюдение в течение 10 дней.
9. <a id="p100054"></a>При наличии в исследуемом материале вирулентного вируса болезни Ньюкасла птица заболевает через 3...7 дней после заражения и погибает через 1...5 дней после начала заболевания, при классической чуме птица заболевает через 1...5 дней после заражения и погибает через 10...72 ч после проявления клинических признаков заболевания.
10. <a id="p100055"></a>При отрицательном результате биопробы зараженные птицы должны оставаться живыми. При гибели хотя бы одной из 4 зараженных птиц биопроба считается положительной при условии выделения вируса, как изложено в [разделе I](#p100021).


## <a id="p100056"></a>III. ТИПИРОВАНИЕ ВЫДЕЛЕННОГО ВОЗБУДИТЕЛЯ В РЕАКЦИЯХ ЗАДЕРЖКИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, НЕЙТРАЛИЗАЦИИ И СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА


11. <a id="p100057"></a>Реакцию задержки гемагглютинации (РЗГА) применяют: для идентификации выделенного вируса, обладающего гемагглютинирующей активностью с заведомо известной эталонной диагностической сывороткой и при исследовании сывороток крови переболевшей или вакцинированной птицы с эталонным диагностическим антигеном.
<a id="p100058"></a>Для постановки РЗГА требуется следующее:
- <a id="p100059"></a>эталонные диагностические антисыворотки к вирусам болезни Ньюкасла и классической чумы птиц;
- <a id="p100060"></a>эталонные диагностические антигены вирусов болезни Ньюкасла и классической чумы птиц;
- <a id="p100061"></a>исследуемый гемагглютинирующий вирус или парные сыворотки от переболевших или вакцинированных птиц;
- <a id="p100062"></a>физиологический раствор pH 7,0...7,3;
- <a id="p100063"></a>1%-ные и 5%-ные суспензии эритроцитов кур;
- <a id="p100064"></a>доски из плексигласа или бактериологические пробирки;
- <a id="p100065"></a>пипетки на 1 и 5 мл.
<a id="p100066"></a>В начале готовят диагностические антигены и сыворотки для работы. С этой целью в ампулы, содержащие антиген и сыворотки, добавляют по 1 мл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора и пипетируют до полного растворения содержимого, после чего готовые (растворенные) антиген и сыворотку переносят в отдельно взятые пробирки, в которые предварительно внесены по 9 мл физиологического раствора.
<a id="p100067"></a>Приготовление 1%-ной и 5%-ной суспензии эритроцитов кур. В качестве доноров для получения эритроцитов используют петухов породы белый леггорн в возрасте от 6 мес. до 1 года. Для отбора доноров проводят пробное взятие эритроцитов и испытание их на агглютинабельность. Петухов, эритроциты которых в контролях с физиологическим раствором показали отрицательные результаты, а с антигеном - положительные, отбирают для дальнейшей работы.
<a id="p100068"></a>Взятие крови у петухов проводят следующим способом: ножницами делают надрез верхушки одного из зубцов гребня и набирают 50...100 капель крови, после чего кровоточащее место прижигают раскаленным металлом (ручкой скальпеля или пинцета).
<a id="p100069"></a>Кровь собирают в баночку с бусами, слегка смоченными физиологическим раствором, или в баночку, увлажненную 2,5%-ным раствором лимоннокислого натрия (1/3 на 2/3 объема крови). При сборе крови баночку с бусами непрерывно встряхивают до полного дефибринирования. Полученную взвесь эритроцитов фильтруют через трехслойный марлевый фильтр и троекратно отмывают физиологическим раствором, осаждая на центрифуге в течение 15 мин при 1000 об/мин.
<a id="p100070"></a>Из осадка отмытых эритроцитов готовят 1%-ную и 5%-ную взвесь в физиологическом растворе. Готовую взвесь хранят при 4 °C не более 5 суток.
12. <a id="p100071"></a>Перед постановкой РЗГА ставят реакцию гемагглютинации, которая основана на способности вирусов болезни Ньюкасла и классической чумы птиц вызывать склеивание (агглютинацию) эритроцитов. Реакция гемагглютинации является подготовительным этапом для постановки реакции задержки гемагглютинации.
<a id="p100072"></a>РГА используется с целью определения наличия вируса в исследуемом материале и его титрования.
<a id="p100073"></a>Гемагглютинины входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в следующих инфицированных вирусом материалах: аллантоисной и амниотической жидкостях, оболочках и органах куриного эмбриона; в легких, печени и селезенке погибшей птицы, в жидкой и клеточной фракциях культур ткани.
<a id="p100074"></a>Гемагглютинирующей активностью, кроме вирусов, обладают также некоторые штаммы различных видов бактерий и микоплазм.
<a id="p100075"></a>В связи с этим с особой осторожностью следует подходить при оценке положительной РГА в бактериологически нестерильных материалах. Неспецифическая гемагглютинация может быть вызвана и изменением pH раствора.
<a id="p100076"></a>Для постановки РГА используют эритроциты кур, лошади и многих других видов млекопитающих и птиц. Спектр гемагглютинации служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Вирулентные штаммы вируса болезни Ньюкасла не вызывают агглютинацию эритроцитов лошади, чем отличаются от вируса классической чумы птиц, который способен агглютинировать их в высоких разведениях.
<a id="p100077"></a>Для постановки РГА готовят двукратные разведения вируссодержащего материала, начиная с 1:2 до 1:2048 (1:2560), а при необходимости и выше, для чего в ряд лунок (или пробирок) наливают физиологический раствор в объеме 0,5 мл, затем с помощью пипетки объемом 1 мл в первую лунку вносят 0,5 мл вируса, трехкратно пипетируют и переносят в третью и т.д. Из последней пробирки 0,5 мл разведенного материала удаляют и во все лунки (пробирки) добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов. Обязательно ставится контроль на возможность спонтанной агглютинации эритроцитов (к 0,5 мл физиологического раствора добавляют 0,5 мл 1% эритроцитов). После этого доски с лунками (или штатив с пробирками) встряхивают и оставляют при температуре 16...22 °C. Учет реакции проводят через 30, 45 и 60 мин, а при использовании эритроцитов млекопитающих - через 60, 90 мин (после оседания эритроцитов в контроле) [(рис. 30)](#p100079).

<a id="p100078"></a> ![III. Типирование выделенного возбудителя в реакциях задержки гемагглютинации, не](https://i.bukva.ai/LS3EZ6Ks/img_0.png) 

<div align="center">

<a id="p100079"></a>Рис. 30

</div>

Постановка реакции гемагглютинации

<a id="p100080"></a>Положительную реакцию гемагглютинации оценивают крестами (от одного до трех) по форме осадка эритроцитов. Трехкрестовая реакция определяется интенсивной и быстрой агглютинацией эритроцитов, которые осаждаются не только на дне, но и на стенках пробирки, образуя "зонтик". Двухкрестовая реакция характеризуется менее интенсивной агглютинацией, при которой на стенках пробирки заметны агглютинированные эритроциты.
<a id="p100081"></a>Однокрестовая реакция определяется наличием незначительной агглютинации эритроцитов на дне пробирки.
<a id="p100082"></a>В случае отрицательной реакции, так же как и в контроле, эритроциты оседают под действием тяжести, образуя на дне пробирки диск с ровными краями.
<a id="p100083"></a>За титр вируса принимают наибольшее его разведение, при котором еще четко наблюдается агглютинация эритроцитов.
<a id="p100084"></a>Для постановки ориентировочной РГА на хорошо вымытые предметные стекла (или чашки Петри) наносят каплю 5%-ных эритроцитов и каплю вируссодержащего материала, тщательно перемешивают (покачиванием или пастеровской пипеткой) и наблюдают за появлением хлопьев агглютинированных эритроцитов.
13. <a id="p100085"></a>После того, как определена гемагглютинирующая активность исследуемого материала, переходят к постановке РЗГА.
<a id="p100086"></a>РЗГА основана на способности специфических антител нейтрализовать гемагглютинирующую активность вирусов. Эта реакция высокоспецифична. Постановке основной реакции предшествует определение рабочей дозы антигена вируса [(рис. 31)](#p100088). Рабочая доза вируса берется в 2...4-кратной концентрации (2...4 ГАЕ) по отношению к титру вируса [(схема 2)](#p100122). Например, если титр гемагглютинации равен разведению 1:256 (1 ГАЕ), то рабочая доза будет 1:128 (2 ГАЕ) или 1:64 (4 ГАЕ). Для ее приготовления необходимо взять 63 мл физиологического раствора и добавить к нему 1 мл исходного вируссодержащего материала. После этого следует поставить контроль рабочей дозы.

<a id="p100087"></a> ![III. Типирование выделенного возбудителя в реакциях задержки гемагглютинации, не](https://i.bukva.ai/LS3EZ6Ks/img_1.png) 

<div align="center">

<a id="p100088"></a>Рис. 31

</div>

Приготовление рабочей дозы антигена

<a id="p100089"></a>Для этого в пять лунок (пробирок) разливают по 0,5 мл физиологического раствора и проводят титрование рабочей дозы антигена. В первую лунку (пробирку) вносят 0,5 мл рабочей дозы, трижды пипетируют и переносят во вторую и т.д.; из пятой (последней) пробирки после пипетирования удаляют 0,5 мл. В каждую из пяти лунок (пробирок) добавляют по 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов кур. При правильном выборе рабочей дозы антигена в первой и во второй лунках (пробирках), содержащих 2 и 1 ГАЕ, будет наблюдаться полная агглютинация эритроцитов (зонтик), в третьей, содержащей 1/2 ГАЕ, иногда может наблюдаться нечеткая агглютинация при отрицательном результате в четвертой и пятой лунках (пробирках). Если результаты контрольного опыта не совпадают с указанными, то рабочую дозу доводят до указанной активности (развести физраствором или добавить антигена), после чего контроль дозы ставят вновь.
<a id="p100090"></a>Для идентификации вновь выделенных штаммов в реакции задержки гемагглютинации используют эталонные диагностические иммунные сыворотки.
14. <a id="p100091"></a>С диагностической (ретроспективной) целью или с целью установления напряженности иммунитета используют парные сыворотки переболевшей или вакцинированной птицы для обнаружения увеличения титра антител. Пробы сывороток крови берут в первые дни болезни или перед вакцинацией и спустя 14 дней после нее (или выздоровления).
<a id="p100092"></a>Для постановки реакции сыворотку, предварительно прогретую при 60 °C 30 мин, разводят с коэффициентом 2, начиная с 1:10 (0,1 мл сыворотки и 0,9 мл физиологического раствора). Необходимое для опыта количество сыворотки рассчитывают исходя из количества используемых в РЗГА антигенов. На каждый антиген необходимо иметь 1 мл разведенной 1:10 сыворотки.
15. <a id="p100093"></a>С целью уменьшения возможности ошибки разведение сыворотки готовят в одном ряду пробирок, из которых ее затем переносят в параллельные ряды лунок (пробирок) в объеме по 0,25 мл. После того, как сыворотка будет разнесена по лункам (пробиркам), в них добавляют по 0,25 мл соответствующего антигена, содержащего 2...4 ГАЕ. Приготовленный комплекс (антиген + антитело) встряхивают и ставят при температуре 18...22 °C на контакт. Через 30 мин во все пробирки добавляют по 0,5 мл 1%-ных эритроцитов кур, снова встряхивают и оставляют при той же температуре. РЗГА читают через 30, 40, 45 мин [(рис. 32)](#p100095).

<a id="p100094"></a> ![III. Типирование выделенного возбудителя в реакциях задержки гемагглютинации, не](https://i.bukva.ai/LS3EZ6Ks/img_2.png) 

<div align="center">

<a id="p100095"></a>Рис. 32

</div>

Постановка реакции задержки гемагглютинации

16. <a id="p100096"></a>Для проверки специфичности РЗГА необходимо поставить контроль на способность сыворотки спонтанно агглютинировать эритроциты. С этой целью к 0,25 мл сыворотки (2...3 лунки), взятой в разведении 1:10, добавляют 0,25 мл физиологического раствора и 0,5 мл 1%-ной взвеси эритроцитов. Если сыворотки не обладают агглютинирующей способностью, то в лунках эритроциты выпадают в осадок, как и в контроле. Если же в лунках наблюдается агглютинация, то сыворотку необходимо обработать эритроцитами. Для этого к разведенной 1:5 сыворотке добавляют равный объем 50%-ной взвеси эритроцитов (для истощения используют тот же вид эритроцитов, с которыми ставится РЗГА). Смесь встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 4 °C, затем центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, отсасывают надосадочную жидкость (теперь сыворотка разведена 1:10) и повторно проверяют на спонтанную агглютинацию.
17. <a id="p100097"></a>Оценку результатов РЗГА проводят по отсутствию или наличию агглютинации эритроцитов. Если в обследуемых разведениях сыворотки содержатся антитела (антигемагглютинины), специфически тормозящие гемагглютинацию, то антиген теряет способность агглютинировать эритроциты. В этом случае в первых 3...8 лунках или выше (в зависимости от активности антисыворотки) гемагглютинация отсутствует. В последних лунках (пробирках), где находятся большие разведения сыворотки (мало антител), будет наблюдаться полная агглютинация эритроцитов.
<a id="p100098"></a>За титр сыворотки считают ее наивысшее разведение, которое полностью еще задерживает гемагглютинацию.
18. <a id="p100099"></a>Титрование возбудителя считается завершенным, а причина болезни или формирование иммунитета доказанными в следующих случаях:
<a id="p100100"></a>а) если эталонная диагностическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность идентифицируемого штамма вируса в пределах целого или 1/2...1/8 ее титра с гомологичным эталонным диагностическим антигеном;
<a id="p100101"></a>б) если частное от деления титра сыворотки, взятой через 14 дней, на титр сыворотки, взятой в начале заболевания или до вакцинации, соответствуют четырем и выше.
<a id="p100102"></a>Постановка реакции нейтрализации (РН).
19. <a id="p100103"></a>В случаях, когда гемагглютинирующая активность идентифицируемого штамма не подавляется ни одной из эталонных сывороток, необходимо исключить двойную инфекцию (содержание в одном исследуемом материале вируса болезни Ньюкасла и классической чумы птиц). Для этого необходимо поставить реакцию нейтрализации.
<a id="p100104"></a>К постановке реакции нейтрализации прибегают также в случаях, когда исследуемый материал обладает слабой гемагглютинирующей активностью (1:2...1:4).
<a id="p100105"></a>РН ставят для определения антигенного соответствия вируса к сыворотке. Это родство устанавливают по способности сыворотки подавлять, (нейтрализовать) инфекционную активность вируса (способность вируса размножаться в чувствительной модели).
<a id="p100106"></a>РН проводится в два этапа:
- <a id="p100107"></a>первый этап - в пробирках, где смесь вируса контактирует с сывороткой при 37 °C 60 мин;
- <a id="p100108"></a>второй этап - путем заражения полученной смесью куриных эмбрионов для учета нейтрализации вируса.
<a id="p100109"></a>РН учитывают по результатам заражения куриных эмбрионов, в которых хорошо размножаются вирус болезни Ньюкасла и классической чумы птиц.
<a id="p100110"></a>При помощи РН можно определить родство:
<a id="p100111"></a>а) вируса к известной эталонной диагностической сыворотке. Для типирования неизвестного вируса используют эталонную диагностическую антисыворотку, полученную на эталонный штамм и обладающую специфической нейтрализующей активностью (индекс не ниже 1000);
<a id="p100112"></a>б) сыворотки к известному эталонному диагностическому антигену.
<a id="p100113"></a>Для установления наличия специфических антител в крови вакцинированной или переболевшей птицы реакцию ставят с парными сыворотками (см. раздел РЗГА) и с известным диагностическим эталонным штаммом.
<a id="p100114"></a>Техника постановки РН (см. [рис. 33](#p100116)) с вычислением индекса заключается в следующем: готовят 10-кратные разведения вируса (4,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл вируса) в пределах его титра. После этого по 0,5 мл каждого разведения переносят в ряд пробирок (или несколько рядов, в зависимости от количества используемых на один вирус сывороток). Затем в каждую пробирку добавляют равный объем (0,5 мл) предварительно разведенной 1:10 диагностической (или же испытуемой) гипериммунной сыворотки. В контрольный ряд добавляют нормальную сыворотку.

<div align="center">

<a id="p100115"></a> ![III. Типирование выделенного возбудителя в реакциях задержки гемагглютинации, не](https://i.bukva.ai/LS3EZ6Ks/img_3.png) 

<a id="p100116"></a>Рис. 33<br>
Постановка реакции нейтрализации

</div>


<a id="p100117"></a>Смесь вируса с сывороткой выдерживают при 37 °C 60 мин и вводят в объеме 0,2 мл в аллантоисную полость 10-суточным куриным эмбрионам (4 куриных эмбриона на каждое разведение).
<a id="p100118"></a>Зараженные куриные эмбрионы инкубируют при 37 °C в течение 72 ч, после чего проводят учет нейтрализации. Для этого все зараженные эмбрионы овоскопируют, учитывают погибшие эмбрионы, а живые помещают при 4 °C на 12...16 ч. После этого все эмбрионы вскрывают (живые и мертвые), берут из них аллантоисную жидкость и испытывают на гемагглютинирующую активность.
21. <a id="p100119"></a>РН считается положительной, если испытуемый вирус не проявил биологической активности (не вызвал гибели эмбрионов и не обладал гемагглютинирующими свойствами) в смеси с эталонной диагностической сывороткой, но сохранил ее с нормальной сывороткой.
<a id="p100120"></a>Для того чтобы вычислить индекс нейтрализации [(схема 2)](#p100122), устанавливают титр вируса с эталонной (или испытуемой) и нормальной сыворотками. После этого определяют разницу в титрах между нормальной и эталонной. Если она составляет два разведения и выше, то РН считается положительной.

<a id="p100121"></a>Схема 2

<a id="p100122"></a>Учет реакции нейтрализации


<table>
<colgroup><col width="11%"><col width="6%"><col width="6%"><col width="6%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="14%"><col width="14%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100123"></a>Сыворотки</td><td colspan="9"><a id="p100124"></a>Разведение вируса</td><td rowspan="2"><a id="p100125"></a>Титр вируса в присутствии сыворотки (в lg)</td><td rowspan="2"><a id="p100126"></a>Индекс нейтрализации (в lg)</td></tr>
<tr><td><a id="p100127"></a>10-1</td><td><a id="p100128"></a>10-2</td><td><a id="p100129"></a>10-3</td><td><a id="p100130"></a>10-4</td><td><a id="p100131"></a>10-5</td><td><a id="p100132"></a>10-6</td><td><a id="p100133"></a>10-7</td><td><a id="p100134"></a>10-8</td><td><a id="p100135"></a>10-9</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100136"></a>Иммунная</td><td><a id="p100137"></a>+</td><td><a id="p100138"></a>+</td><td><a id="p100139"></a>0</td><td><a id="p100140"></a>0</td><td><a id="p100141"></a>0</td><td><a id="p100142"></a>0</td><td><a id="p100143"></a>0</td><td><a id="p100144"></a>0</td><td><a id="p100145"></a>0</td><td rowspan="4"><a id="p100146"></a>2,0</td><td rowspan="8"><a id="p100147"></a>6,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100148"></a>+</td><td><a id="p100149"></a>+</td><td><a id="p100150"></a>0</td><td><a id="p100151"></a>0</td><td><a id="p100152"></a>0</td><td><a id="p100153"></a>0</td><td><a id="p100154"></a>0</td><td><a id="p100155"></a>0</td><td><a id="p100156"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100157"></a>+</td><td><a id="p100158"></a>0</td><td><a id="p100159"></a>0</td><td><a id="p100160"></a>0</td><td><a id="p100161"></a>0</td><td><a id="p100162"></a>0</td><td><a id="p100163"></a>0</td><td><a id="p100164"></a>0</td><td><a id="p100165"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100166"></a>+</td><td><a id="p100167"></a>0</td><td><a id="p100168"></a>0</td><td><a id="p100169"></a>0</td><td><a id="p100170"></a>0</td><td><a id="p100171"></a>0</td><td><a id="p100172"></a>0</td><td><a id="p100173"></a>0</td><td><a id="p100174"></a>0</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100175"></a>Нормальная</td><td><a id="p100176"></a>+</td><td><a id="p100177"></a>+</td><td><a id="p100178"></a>+</td><td><a id="p100179"></a>+</td><td><a id="p100180"></a>+</td><td><a id="p100181"></a>+</td><td><a id="p100182"></a>+</td><td><a id="p100183"></a>+</td><td><a id="p100184"></a>0</td><td rowspan="4"><a id="p100185"></a>8,0</td></tr>
<tr><td><a id="p100186"></a>+</td><td><a id="p100187"></a>+</td><td><a id="p100188"></a>+</td><td><a id="p100189"></a>+</td><td><a id="p100190"></a>+</td><td><a id="p100191"></a>+</td><td><a id="p100192"></a>+</td><td><a id="p100193"></a>+</td><td><a id="p100194"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100195"></a>+</td><td><a id="p100196"></a>+</td><td><a id="p100197"></a>+</td><td><a id="p100198"></a>+</td><td><a id="p100199"></a>+</td><td><a id="p100200"></a>+</td><td><a id="p100201"></a>+</td><td><a id="p100202"></a>0</td><td><a id="p100203"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100204"></a>+</td><td><a id="p100205"></a>+</td><td><a id="p100206"></a>+</td><td><a id="p100207"></a>+</td><td><a id="p100208"></a>+</td><td><a id="p100209"></a>+</td><td><a id="p100210"></a>+</td><td><a id="p100211"></a>0</td><td><a id="p100212"></a>0</td></tr>
</table>


<a id="p100213"></a>*Примечание.* Индекс нейтрализации (в lg) 8,0 - 2,0 = 6,0. + - эмбрионы погибшие; - - эмбрионы живые.

22. <a id="p100214"></a>В тех случаях, когда в предварительных опытах РЗГА дала сомнительные или отрицательные результаты, необходимо повторить реакцию с вирусом, полученным после РН из эмбрионов, зараженных смесью эталонной сыворотки с вирусом в наивысшем разведении, но еще обладающим гемагглютинирующей активностью.
23. <a id="p100215"></a>Если гемагглютинирующая активность вируса, полученного после нейтрализации, не подавляется эталонной диагностической сывороткой к вирусу болезни Ньюкасла, то результаты выделения и идентификации возбудителя болезни Ньюкасла считают отрицательными.
24. <a id="p100216"></a>Если гемагглютинирующая активность исследуемого вируса, полученного после нейтрализации, подавляется эталонной диагностической сывороткой к вирусу классической чумы птиц в титре 1/16 или ниже или не подавляется совсем, необходимо провести идентификацию неизвестного штамма в РСК и по дополнительным тестам.
25. <a id="p100217"></a>Для идентификации штаммов в РСК их необходимо направить в МВА или ВНИИВВиМ, уведомив об этом Главное управление ветеринарии.


## <a id="p100218"></a>IV. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ ЛАБОРАТОРНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ ПТИЦ С ПОМОЩЬЮ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ


26. <a id="p100219"></a>К 0,5 мл гемагглютинирующей экстраэмбриональной жидкости добавляют 0,25 мл диагностического раствора А и 0,25 мл раствора Б (растворы А и Б - химические эталонные препараты, входящие в диагностические наборы, предназначенные для идентификации штаммов вируса гриппа птиц).
<a id="p100220"></a>Смесь вируса с растворами А и Б выдерживают при 37 °C 60 мин, после чего проводят титрование на гемагглютинирующую активность [(раздел III)](#p100056).
27. <a id="p100221"></a>Если после обработки вирус утратил гемагглютинирующую активность (или имеет в пределах 1:4...1:8), то его идентифицируют как возбудитель классической чумы птиц.
28. <a id="p100222"></a>Все результаты исследований по идентификации возбудителя заносят в специальный рабочий журнал.
<a id="p100223"></a>"Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц)" разработаны специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии МСХ СССР.



<a id="p100224"></a>

---