Методические указания по лабораторной диагностике ринопневмонии лошадей

(утв. Минсельхозом СССР 27.08.1980)

Утверждены 27 августа 1980 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ РИНОПНЕВМОНИИ ЛОШАДЕЙ

1. Общие положения.

1.1. Лабораторная диагностика ринопневмонии лошадей заключается в выделении вируса на культуре клеток и его идентификации в одной из реакций: реакции торможения гемадсорбции (РТГАд), реакции иммунофлуоресценции (ИФ) или реакции нейтрализации (РН); выявлении антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) или РН.

1.2. Диагноз на ринопневмонию лошадей устанавливают на основании результатов лабораторного исследования, анализа эпизоотологических и клинических данных, а также патологоанатомических изменений.

1.3. Для постановки лабораторного диагноза путем выделения вируса и его идентификации требуется от 4 до 18 сут, по выявлению прироста антител в крови животных — от 2 до 4 нед.

2. Взятие и подготовка материала для исследования.

2.1. От больных животных тампонами берут слизь из носовой полости, от павших животных — кусочки легких (на границе здоровой и пораженной ткани).

Патологический материал помещают в пенициллиновые флаконы с 2...5 мл раствора Хенкса и в термосе со льдом направляют в лабораторию.

2.2. В лаборатории флаконы с тампонами подвергают однократному замораживанию и оттаиванию, после чего тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флаконов центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, выдерживают при 4 °C 2...4 ч и используют для заражения культуры клеток.

2.3. Из кусочков органов готовят на растворе Хенкса 10%-ную суспензию, содержащую по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, центрифугируют 20 мин при 3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отсасывают и используют для заражения культуры клеток.

3. Выделение вируса.

3.1. Для выделения вируса ринопневмонии лошадей заражают надосадочной жидкостью (пп. 2.2, 2.3) одну из культур клеток: почки эмбриона коровы (ПЭК), почки эмбриона свиньи (ПЭС), почки кролика (ПК) или почки эмбриона лошади (ПЭЛ), приготовленную в соответствии с «Методическими рекомендациями по получению, культивированию и использованию в научных и производственных целях первичных, перевиваемых и диплоидных культур клеток животного происхождения», утвержденными Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 26 января 1978 г.

3.2. Пробирки с монослоем культуры клеток отмывают раствором Хенкса и заражают по 0,3...0,4 мл испытуемым материалом. Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37,5 °C в течение 1,5...2 ч, затем из них удаляют исследуемую жидкость, промывают раствором Хенкса и добавляют 1...2 мл 0,5%-ного гидролизата лактальбумина. На каждый материал используют 5...6 пробирок культуры клеток. Для контроля оставляют 4 пробирки, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую. Пробирки с культурой клеток помещают в термостат при температуре 37,5 °C и ежедневно просматривают под микроскопом.

3.3. Изменения в культуре клеток, вызванные вирусом ринопневмонии, характеризуются округлением клеток и отслоением их от стекла, образованием многоядерных клеток (симпластов). Указанное цитопатическое действие (ЦПД) появляется на 3...6-й день.

При отсутствии ЦПД в первом пассаже или слабом его проявлении проводят три последовательных пассажа. Каждый пассаж проверяют в реакции гемадсорбции с эритроцитами лошади.

4. Идентификация вируса в реакции гемадсорбции и торможения гемадсорбции.

4.1. Для постановки реакции гемадсорбции (РГАд) отбирают 3...4 пробирки с зараженной культурой клеток с выраженным ЦПД, сливают питательную среду, вносят в них по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов и оставляют на контакт на 30...40 мин при температуре 37 °C. Затем эритроциты удаляют, пробирки с культурой промывают физиологическим раствором путем легкого покачивания и просматривают под микроскопом при малом увеличении.

При наличии вируса в материале отчетливо видны прикрепившиеся к клеткам эритроциты, тогда как в контрольных пробирках они проплывают в поле зрения.

При положительной РГАд идентификацию вируса проводят в РТГАд.

4.2. Для постановки реакции торможения гемадсорбции в 4 пробирки с зараженной культурой клеток вносят по 0,5 мл неразведенной специфической сыворотки, оставляют на контакт на 30...40 мин при температуре 37 °C. Затем во все пробирки вносят по 1 мл 2%-ной взвеси эритроцитов. Через 30 мин эритроциты удаляют, а пробирки с культурой промывают физиологическим раствором путем легкого покачивания и учитывают реакцию. В пробирках, обработанных специфической сывороткой, при наличии вируса ринопневмонии гемадсорбция отсутствует.

5. Идентификация вируса методом иммунофлуоресценции.

5.1. Для идентификации вируса в реакции ИФ культуру клеток выращивают в пробирках на покровных стеклах. С появлением монослоя его заражают выделенным вирусом по общепринятой методике. На 2...3-е сутки стеклышки извлекают из пробирок, фиксируют в охлажденном ацетоне 15...20 мин, отмывают в забуференном физрастворе и окрашивают флуоресцирующей сывороткой на одно разведение ниже ее титра. Препараты выдерживают в течение 30...40 мин во влажной камере при 37 °C, затем трехкратно отмывают физиологическим раствором, высушивают при комнатной температуре и просматривают под микроскопом.

5.2. Учет реакции. Реакцию считают положительной при наличии специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген при этом выявляется в виде яркого желто-зеленого свечения в перинуклеарной зоне не менее 50% клеток при отсутствии флуоресценции в контрольных незараженных препаратах.

6. Идентификация вируса в реакции нейтрализации.

6.1. Предварительно определяют титр вируса. Для этого культуральную вируссодержащую жидкость центрифугируют (при 3 тыс. об/мин в течение 20 мин), надосадочную жидкость титруют в разведении от 10-1 до 10-8 на растворе Хенкса. Каждым разведением вируса заражают 4 пробирки с культурой клеток. Результаты учитывают на 6-е сутки.

6.2. За титр вируса принимают его наибольшее разведение, при котором отмечают ЦПД в 50% пробирок с зараженной культурой клеток. Титр выделенного вируса должен быть не менее 10-2 ЦПД50/мл. Реакцию ставят со 100 ТЦД50/мл вируса.

6.3. Специфическую и контрольную (отрицательную) сыворотки инактивируют при температуре 56 °C в течение 30 мин, готовят два ряда двукратных разведений. Количество разведений должно на одно превышать известный (указанный на ампуле) титр специфической сыворотки.

6.4. В каждую пробирку, содержащую по 2 мл сыворотки, вносят равный объем вируса. Смесь сыворотки и вируса оставляют для контакта на 1...1,5 ч при температуре 18...22 °C. Каждым разведением сыворотки с вирусом заражают по 4 пробирки с культурой клеток в дозе 1,0 мл. Культуру инкубируют при 37,5 °C, ежедневно просматривают под микроскопом.

6.5. Учет реакции нейтрализации проводят на 6-й день. Подавление ЦПД в пробирках со специфической сывороткой и исследуемым вирусом при наличии выраженного ЦПД в контроле с нормальной сывороткой указывает на видовую принадлежность вируса. Вирус считают идентифицированным при наличии нейтрализации не менее чем до одной трети титра положительной сыворотки с гомологичным, заведомо известным вирусом.

7. Ретроспективная диагностика.

7.1. Для обнаружения специфических антител в крови переболевших ринопневмонией лошадей ставят РТГА и РН. Исследуют парные пробы сывороток, взятых в начале заболевания (или в день аборта) и через 2...3 недели после выздоровления. Исследуемые сыворотки инактивируют при 56 °C 30 мин.

7.2. Постановка РТГА. Реакцию проводят микрометодом с применением аппарата Такачи. В качестве антигена используют вакцинный штамм вируса, который готовят путем заражения вирусом культуры клеток.

РТГА ставят с 4 гемагглютинирующими единицами (ГАЕ) вируса, которые находят путем деления на 4 показателя гемагглютинирующего титра. Например, если гемагглютинирующий титр равен 1:8, то 4 ГАЕ будет соответствовать 1:2 (8 : 4 = 2). Если титр исходного вируса 1:2, то используют неразведенную вируссодержащую жидкость.

7.2.1. Для постановки основного опыта в лунки панели разливают по 0,025 мл физиологического раствора. В первые лунки с помощью микропипетки вносят по 0,025 мл исследуемых сывороток и титруют их в разведении 1:2 до 1:1024. Затем в каждую лунку вносят по 0,025 вируса (4 ГАЕ). Панели осторожно встряхивают и после 60-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 0,2%-ной взвеси эритроцитов лошади.

7.2.2. Контроли: эритроцитов на спонтанную агглютинацию; рабочей дозы антигена по общепринятой методике.

7.2.3. Реакцию учитывают через 2 ч. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.

7.3 Постановка реакции нейтрализации описана в п. 6.

7.4. Ретроспективный диагноз на ринопневмонию ставят при четырехкратном приросте антител в парных пробах сывороток переболевших животных (1).

---