Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ауески животных

(рекомендованы Минсельхозом СССР 18.05.1978)

Рекомендованы 18 мая 1978 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ ЖИВОТНЫХ

1. Общие положения.

1.1 Лабораторная диагностика болезни Ауески животных заключается в следующем:

• обнаружении и идентификации вируса этой болезни в патологическом материале методами непрямой гемагглютинации (РНГА) или иммуноосмофореза;
• выявлении специфических антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РНГА или в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток (ретроспективная диагностика);
• постановке биологической пробы.

1.2. РНГА, реакцию иммуноосмофореза и РН применяют для исследования патологического материала и сывороток крови только от невакцинированных против болезни Ауески животных.

1.3. Лабораторный диагноз на болезнь Ауески ставят при получении положительного результата хотя бы по одному из методов исследования, указанных в п. 1.1.

Окончательный диагноз на болезнь Ауески устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

2. Индикация и идентификация вирусного антигена болезни Ауески.

2.1. В качестве исследуемого материала отбирают пробы патологического материала из разных участков головного мозга (полушарий, мозжечка, продолговатого мозга), заглоточных и бронхиальных лимфоузлов, легких, печени, селезенки, почек свиней, павших или вынужденно убитых в агональном состоянии.

Патологический материал измельчают, растирают в ступке и готовят суспензию (1:5) на физиологическом растворе для РНГА и суспензию (1:5) на веронал-мединаловом буферном растворе (pH 8,6) для метода иммуноосмофореза.

2.2 Реакция непрямой гемагглютинации.

2.2.1 Компоненты реакции:

• эритроцитарный диагностикум (эритроциты барана, сенсибилизированные антителами к вирусу болезни Ауески);
• испытуемый антиген;
• контрольный положительный антиген (вакцинный штамм вируса болезни Ауески) в рабочем разведении;
• контрольный отрицательный антиген в рабочем разведении;
• нормальная лошадиная сыворотка.

2.2.2. Подготовка исследуемого материала. Суспензию из органов (1:5) выдерживают одни сутки при температуре -20 °C в холодильнике, затем центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость очищают хлороформом, добавляя его в количестве 1/4 части объема жидкости, затем вновь центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин.

Надосадочную жидкость используют в РНГА в качестве испытуемого антигена.

2.2.3. Постановка реакции. РНГА ставят на микропанелях с помощью аппарата «микротитратор» системы Такачи.

Испытуемые и контрольные антигены разводят 1:2 и выше в объеме 0,05 мл 1%-ным раствором нормальной лошадиной сыворотки. Затем добавляют по 0,025 мл эритроцитарного диагностикума. Смесь встряхивают и выдерживают при комнатной температуре в течение 2...3 ч.

Контроли:

• контрольный положительный антиген + эритроцитарный диагностикум;
• контрольный отрицательный антиген + эритроцитарный диагностикум;
• эритроцитарный диагностикум + 1%-ный раствор нормальной лошадиной сыворотки.

2.2.4. Учет реакции. Учет РНГА проводят при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательным антигеном. Положительными считают те пробы антигенов, которые в разведении 1:8 и выше вызывают агглютинацию эритроцитов при положительном результате в контроле со специфическим антигеном и отрицательном результате с контрольным отрицательным антигеном.

2.3 Реакция иммуноосмофореза.

2.3.1 Компоненты реакции:

• специфическая к вирусу болезни Ауески иммуноасцитическая жидкость белых крыс (ИАЖ);
• контрольный положительный антиген;
• контрольный отрицательный антиген;
• испытуемый антиген.

Для постановки реакции необходимо иметь камеру из плексигласа для электрофореза, универсальный источник питания УИП-1, агар «Дифко», веронал-мединаловый буфер с pH 8,6, стекла обезжиренные (9x12 см), металлический штамп, пробирки, центрифугу.

2.3.2. Подготовка исследуемого материала. Суспензию из органов (1:5) подвергают однократному замораживанию (при -15...-20 °C) с последующим оттаиванием. Затем суспензию центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого антигена.

2.3.3. Приготовление агаровой среды. Для постановки реакции готовят 1,5%-ный гель из агара «Дифко» на веронал-мединаловом буфере с pH 8,6. Пропись буфера: веронал — 1,66 г, мединал — 10,51, молочнокислый кальций — 1,536 г, дистиллированная (слегка подогретая) вода — 1 л. В качестве антибактериального средства в агаровую среду вносят мертиолят из расчета 1:10 000 и хранят в холодильнике.

Для постановки реакции агар, расплавленный и остуженный до 56 °C, наносят пастеровской пипеткой на стекла размером 9x12 см. Толщина агаровой пластинки 4...5 мм. Расход агара около 15 мл. В затвердевшем агаре выштамповывают лунки диаметром 5 мм, с расстоянием между лунками 5 мм.

2.3.4. Постановка реакции. В лунки, которые расположены ближе к катоду, вносят исследуемые антигены; в лунки, расположенные ближе к аноду, вносят специфическую асцитическую жидкость в рабочем разведении. Иммуноосмофорез проводят в камере для электрофореза на бумаге при напряжении тока 200...220 В в течение 1...2 ч. В качестве контроля используют положительный антиген со специфической асцитической жидкостью.

2.3.5. Учет реакции. Результаты иммуноосмофореза учитывают через 1,5...2 ч с момента включения камеры в сеть.

Реакция считается положительной при образовании линии преципитации между лунками с исследуемыми антигенами и специфической асцитической жидкостью при положительном результате в положительном контроле (контрольный положительный антиген + ИАЖ) и отрицательном результате в отрицательном контроле (контрольный отрицательный антиген + ИАЖ).

3. Ретроспективная диагностика.

3.1. Ретроспективная диагностика основана на обнаружении специфических к вирусу болезни Ауески антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в реакции непрямой гемагглютинации, а также в реакции нейтрализации на культуре клеток.

3.2 Реакция непрямой гемагглютинации.

3.2.1 Компоненты реакции:

• эритроцитарный диагностикум (эритроциты барана, сенсибилизированные вакцинным штаммом вируса болезни Ауески);
• испытуемые сыворотки;
• контрольная положительная иммуноасцитическая жидкость;
• эритроциты барана.

3.2.2. Подготовка исследуемых и контрольных сывороток. Перед постановкой РНГА исследуемые и контрольные сыворотки разводят 1:2 забуференным раствором, инактивируют в водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин и истощают эритроцитами барана.

В 1 мл сыворотки вносят 0,1 мл 5%-ной взвеси отмытых эритроцитов барана, выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 30...40 мин и удаляют эритроциты центрифугированием. При массовых исследованиях сыворотки после истощения можно выдерживать в течение 12...24 ч при 4 °C, затем их исследуют в РНГА в разведении 1:2 и выше.

3.2.3 РНГА проводят по методике, описанной в п. 2.2.

3.2.4. Учет реакции. Результаты реакции учитывают при полном оседании эритроцитов в контроле с отрицательной асцитической жидкостью.

Положительными к вирусу болезни Ауески считают те пробы сывороток, в которых при разведении 1:8 и выше наблюдают агглютинацию эритроцитов.

3.3 Реакции нейтрализации.

3.3.1. Реакцию нейтрализации проводят на культуре клеток ПП, СПЭВ и первично-трипсинизированной культуре куриных фибробластов.

3.3.2 Компоненты реакции:

• вирус болезни Ауески (вакцинный штамм);
• исследуемые сыворотки крови (инактивированные);
• контрольная положительная сыворотка.

3.3.3. Для постановки реакции необходимо предварительно провести пассаж вакцинного штамма вируса болезни Ауески на культуре клеток и определить его титр.

3.3.4. Чтобы провести пассаж вакцинного штамма вируса, содержимое ампулы разводят до нативного состояния (1:1), затем готовят разведение вируса 1:10 на питательной среде. Разведенный вирус в дозе 1 мл вносят в культуру клеток, выращенную в пенициллиновых флаконах, и инкубируют при температуре 37 °C. Через 24 ч клетки сморщиваются, округляются, монослой нарушается и образуются островки клеток. Через 72 ч монослой полностью нарушается и на стекле остаются единичные клетки.

Культуральный (вакцинный) штамм вируса хранят в холодильнике при температуре 4 °C и освежают один раз в 3 мес.

3.3.5. Для титрования вируса готовят десятикратные разведения вируса (от 10-1 до 10-8) на питательной среде без сыворотки. Каждым разведением в объеме 1 мл заражают отмытую раствором Хенкса культуру клеток (по 4 пенициллиновых флакона). Культуру клеток инкубируют при 37 °C, ежедневно просматривая ее под микроскопом. Окончательный учет результатов проводят через 72 ч.

Титром вируса считают наибольшее его разведение, вызывающее цитопатическое действие (ЦПД) в 50% культур клеток. Титр вычисляют по методу Рида и Менча и выражают количество ЦПД в 1 мл.

3.3.6. Постановка реакции нейтрализации. РН ставят с дозой вируса, равной 100 ТЦД50 в 0,1 мл. Исследуемые сыворотки разводят 1:2 и выше в объеме 0,5 мл. К каждому разведению сыворотки добавляют равный объем (0,5 мл) вируссодержащей культуральной жидкости. Пробирки со смесью встряхивают и оставляют при температуре 37 °C в течение 60 мин. После инкубации смесь вируса с сывороткой вводят во флаконы с культурой клеток и результаты учитывают через 72 ч.

Для контроля заражают культуру клеток смесью вируса с контрольной положительной сывороткой, вирусом без сыворотки и одновременно в одном флаконе с культурой клеток сменяют питательную среду (контроль культуры клеток).

3.3.7. Учет реакции нейтрализации. Подавление цитопатического действия вируса специфической (контрольной) сывороткой и исследуемыми сыворотками при наличии ЦПД в контроле (культура клеток, зараженная вирусом без сыворотки) указывает на наличие специфических антител к вирусу болезни Ауески в сыворотке крови свиней.

4. Биологическая проба.

4.1. Для постановки биопробы патологический материал (селезенку, печень, головной мозг, легкие) растирают в ступке с физиологическим раствором в соотношении 1:10. Полученную суспензию вводят внутримышечно кролику или кошке в дозе 1 мл. Через 2...3 сут после заражения при наличии вируса в патологическом материале животное заболевает.

Болезнь характеризуется беспокойством, зудом, расчесами на месте инъекции. Если зараженные животные погибают на 3...6-й день, но у них не наблюдалось зуда и расчесов, то патологический материал от павшего кролика (или кошки) пассируют еще раз на таких же животных (1).

---