---
title: "\"Методические указания по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота\""
issuer: "Министерство сельского хозяйства СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/metodicheskie-ukazaniya-po-laboratornoy-minselhoz-sssr-ministerstvo-2"
---

## "Методические указания по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота"

# "Методические указания по лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота"

(рекомендованы Минсельхозом СССР 25.07.1978)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации (п. п. 94, 99, 100, 104, 108), разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).


<a id="p100001"></a>Рекомендованы
Министерством сельского
хозяйства СССР
25 июля 1978 года

<a id="p100002"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВИРУСНЫХ РЕСПИРАТОРНО-КИШЕЧНЫХ**
**ИНФЕКЦИЙ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА**


## 1. <a id="p100003"></a>Общие положения.

<a id="p100004"></a>1.1. Настоящие Методические указания распространяются на следующие вирусные респираторно-кишечные инфекции (пневмоэнтериты) крупного рогатого скота: инфекционный ринотрахеит (ИРТ), парагрипп-3 (ПГ-3), вирусную диарею (ВД), аденовирусную инфекцию (адено), респираторно-синцитиальную инфекцию (РС), грипп.

#### <a id="p100005"></a>1.2 Лабораторная диагностика вирусных респираторно-кишечных инфекций заключается в:

- <a id="p100006"></a>обнаружении антигена в патологическом материале методами иммунофлуоресценции (ИФ), реакции связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной преципитации (РДП);
- <a id="p100007"></a>выделении возбудителя из патологического материала в культуре клеток или на куриных эмбрионах и его идентификации в одной из серологических реакций: РСК, РДП, реакции торможения гемагглютинации (РТГА), реакции торможения гемадсорбции, (РТГАд), реакции нейтрализации (РН), реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА), ИФ;
- <a id="p100008"></a>выявлении антител в крови больных и переболевших животных (ретроспективная диагностика) в одной из серологических реакций: реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), РДП, РН, РТГА, РСК, реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ).
<a id="p100009"></a>1.3. Схема исследований при лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота (см. стр. 209, 210).
<a id="p100010"></a>1.4. При лабораторной диагностике вирусных респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота используют соответствующие каждой инфекции диагностические наборы, выпускаемые биологической промышленностью.
<a id="p100011"></a>1.5. Диагностика вирусных пневмоэнтеритов проводится параллельно с исследованием материала на бактериальные и хламидийную инфекции.
<a id="p100012"></a>1.6. Лабораторный диагноз на вирусные респираторно-кишечные инфекции ставится на основании положительных результатов обнаружения антигена в патологическом материале с помощью одной из серологических реакций (ИФ, РДП, РСК) или выделения и идентификации возбудителя в одной из реакций, указанных в схеме [п. 1.3](#p100009), или установления четырехкратного прироста антител в крови переболевших животных.


<table>
<colgroup><col width="16%"><col width="29%"><col width="9%"><col width="17%"><col width="16%"><col width="13%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100013"></a>Болезнь</td><td colspan="2"><a id="p100014"></a>Обнаружение антигена</td><td rowspan="2"><a id="p100015"></a>Выделение вируса</td><td rowspan="2"><a id="p100016"></a>Идентификация вируса (реакция)</td><td rowspan="2"><a id="p100017"></a>Ретроспективная диагностика</td></tr>
<tr><td><a id="p100018"></a>исследуемый патологический материал</td><td><a id="p100019"></a>реакция</td></tr>
<tr><td><a id="p100020"></a>Инфекционный ринотрахеит</td><td><a id="p100021"></a>Слизистая носа, трахеи, легкие, головной мозг, органы абортированного плода</td><td><a id="p100022"></a>ИФ, РДП</td><td><a id="p100023"></a>В культуре клеток: ПЭК, ПТ, ТБ, СЭК</td><td><a id="p100024"></a>ИФ, РН</td><td><a id="p100025"></a>РНГА, РДП, РН</td></tr>
<tr><td><a id="p100026"></a>Парагрипп-3</td><td><a id="p100027"></a>Слизистая носа, трахеи, легкие, селезенка</td><td><a id="p100028"></a>ИФ</td><td><a id="p100029"></a>В культуре клеток: ПЭК, ПТ, ТБ, ЛЭК, СЭК</td><td><a id="p100030"></a>ИФ, РТГА, РГАд, РТГАд</td><td><a id="p100031"></a>РНВГ</td></tr>
<tr><td><a id="p100032"></a>Вирусная диарея</td><td><a id="p100033"></a>Слизистая носа, кишечника, преджелудков, трахеи, легкие, почка</td><td><a id="p100034"></a>ИФ</td><td><a id="p100035"></a>В культуре клеток: СЭК, ПЭК, ТБ</td><td><a id="p100036"></a>ИФ, РСК, РДП, РН</td><td><a id="p100037"></a>РСК, РН</td></tr>
<tr><td><a id="p100038"></a>Аденовирусная инфекция</td><td><a id="p100039"></a>То же</td><td><a id="p100040"></a>ИФ, РСК</td><td><a id="p100041"></a>В культуре клеток: ПЭК, ТБ</td><td><a id="p100042"></a>ИФ, РСК, РДП, РТНГА</td><td><a id="p100043"></a>РНГА, РДП, РСК</td></tr>
<tr><td><a id="p100044"></a>Респираторно-синцитиальная инфекция</td><td><a id="p100045"></a>Слизистая носа, трахеи, легкие</td><td><a id="p100046"></a>ИФ</td><td><a id="p100047"></a>В культуре клеток: ПЭК, ТБ</td><td><a id="p100048"></a>ИФ, РДП, РСК</td><td><a id="p100049"></a>РДП</td></tr>
<tr><td><a id="p100050"></a>Грипп</td><td><a id="p100051"></a>То же</td><td><a id="p100052"></a>ИФ</td><td><a id="p100053"></a>На куриных эмбрионах</td><td><a id="p100054"></a>РТГА</td><td><a id="p100055"></a>РТГА</td></tr>
</table>


<a id="p100056"></a>Обозначения: ПЭК - почка эмбриона коров; ПТ - почка телят; ТБ - тестикулы бычков; СЭК - селезенка эмбриона коров; ЛЭК - легкие эмбриона коров.
<a id="p100057"></a>Диагноз на вирусные пневмоэнтериты считают установленным по результатам лабораторного исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных и патологоанатомических изменений.
<a id="p100058"></a>1.7. Для постановки лабораторного диагноза путем обнаружения антигена в патологическом материале требуется 2 ... 3 дня, с помощью выделения вируса и его идентификации - до 30 дней, а путем выявления прироста антител в крови животных - от 2 до 4 недель.


## 2. <a id="p100059"></a>Взятие и подготовка материала для исследования.

<a id="p100060"></a>2.1. В лабораторию для исследования направляют патологический материал от больных животных, взятый в период максимального проявления у них клинических признаков (температурная реакция, угнетение, воспалительные процессы в верхних дыхательных путях, сопровождающиеся серозными или слизистыми истечениями из носовой полости, поносы, иногда аборты), или от вынужденно убитых или павших животных, взятый не позднее чем через 2 ч после их гибели.
<a id="p100061"></a>2.2. От больных животных берут: 1) тампонами мазки со слизистой носовой полости (при ИРТ - со слизистой глаз, влагалища, препуция) для реакции иммунофлуоресценции и для выделения возбудителя; 2) фекалии - для выделения возбудителя и 3) пробы крови - для выявления в ней титра антител.
<a id="p100062"></a>Тампоны с материалом помещают в пенициллиновые флаконы с 2 ... 5 мл питательной среды для культуры клеток или раствора Хенкса, содержащие 1000 ЕД/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина.
<a id="p100063"></a>Кровь в объеме не менее 5,0 мл берут в пробирки, после свертывания доставляют в лабораторию.
<a id="p100064"></a>2.3. От павших и вынужденно убитых животных берут кусочки носовой перегородки, трахеи, легких, селезенки, почки, средостенные и брыжеечные лимфатические узлы и при поносах - кусочки тонкого отдела кишечника. От абортированных плодов берут кусочки паренхиматозных органов, околоплодную жидкость.
<a id="p100065"></a>2.4. Флаконы с патологическим материалом доставляют в лабораторию в термосе со льдом.
<a id="p100066"></a>2.5. В лаборатории флаконы с тампонами встряхивают 2 ... 3 мин, тампоны отжимают и удаляют, а содержимое флакона центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, куда вносят по 500 ЕД/мл пенициллина и 500 мкг/мл стрептомицина, выдерживают при 4 °C в течение 2 ... 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов. Из осадка центрифугата готовят мазки для исследования методом иммунофлуоресценции.
<a id="p100067"></a>2.6. Флаконы с фекалиями замораживают при температуре -20 °C (в морозилке холодильника) в течение 18 ч, после чего оттаивают при 37 °C и центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку, вносят 1000 ЕД/мл пенициллина, 1000 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, выдерживают при 4 °C в течение 2 ... 4 ч, дополнительно центрифугируют и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.
<a id="p100068"></a>2.7. Со слизистой носовой перегородки, трахеи, влагалища, бронхов и кишечника делают скальпелем соскобы, вносят их в центрифужную пробирку с 5 мл физиологического раствора и центрифугируют при 2 тыс. об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток суспендируют в 0,5 мл того же раствора и готовят мазки на обезжиренных предметных стеклах для исследования методом иммунофлуоресценции.
<a id="p100069"></a>Из кусочков легкого и лимфатических узлов готовят отпечатки на предметных стеклах или срезы толщиной 5 микрон для исследования тем же методом.
<a id="p100070"></a>2.8. Из кусочков органов готовят 10 ... 20%-ную суспензию для выделения возбудителя и приготовления комплементсвязывающего и преципитирующего антигенов.
<a id="p100071"></a>2.9. Для получения суспензии (с целью выделения вируса) ткань измельчают, растирают в ступке со стеклянным песком, разводят раствором Хенкса, содержащим антибиотики, центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, выдерживают при температуре 4 °C в течение 2 ... 4 ч и используют для заражения культуры клеток или куриных эмбрионов.
<a id="p100072"></a>2.10. Для изготовления испытуемого комплементсвязывающего антигена ткань измельчают в ступке или специальном микроизмельчителе, разводят 1:5 содержащим антибиотики физиологическим раствором, pH 7,2 ... 7,4. Полученную 20%-ную суспензию замораживают при температуре -20 °C в течение 16 ... 18 ч, быстро оттаивают при температуре 37 °C, повторно растирают или гомогенизируют, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и далее используют, как указано в [п. 5.1](#p100094).


## 3. <a id="p100073"></a>Обнаружение вирусных антигенов в патологическом материале методом иммунофлуоресценции.

<a id="p100074"></a>3.1. Метод иммунофлуоресценции для обнаружения вируса применяется при диагностике всех респираторно-кишечных инфекций, указанных в [п. 1.1](#p100004).
<a id="p100075"></a>3.2. Полученные мазки, отпечатки и срезы подсушивают на воздухе, фиксируют в ацетоне в течение 5 мин и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, имеющимися в наборах диагностикумов. Каждой сывороткой окрашивают по 4 препарата из каждого органа.
<a id="p100076"></a>3.3. Окрашивание препаратов ведут во влажной камере при температуре 37 °C в течение 45 мин. Затем препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, pH 7,2 ... 7,4, и в дистиллированной воде, подсушивают на воздухе. На препараты наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют их под люминесцентным микроскопом.
<a id="p100077"></a>3.4. Для контроля специфичности свечения ставят реакцию подавления иммунофлуоресценции. Для этого на два препарата из органа, при исследовании которого получена положительная реакция иммунофлуоресценции, наносят соответствующую выявленному вирусу сыворотку в разведении 1:10 и выдерживают их в термостате во влажной камере в течение 30 мин.
<a id="p100078"></a>Препараты споласкивают в трех сменах физиологического раствора, pH 7,2 ... 7,4, и окрашивают флуоресцирующей сывороткой.
<a id="p100079"></a>3.5. Учет реакции. Положительным результатом исследования методом ИФ считается наличие специфической флуоресценции, которая характеризуется тем, что в препаратах, окрашенных флуоресцирующей сывороткой, ткань флуоресцирует тусклым зеленовато-серым цветом, а вирусный антиген при этом выявляется в виде ярких зеленовато-желтых различных по величине гранул или в виде диффузного свечения в цитоплазме или (при ИРТ, адено) в ядре.
<a id="p100080"></a>В контрольных препаратах, обработанных последовательно специфической и флуоресцирующей сыворотками, специфическая флуоресценция должна отсутствовать.
<a id="p100081"></a>Диагноз на вирусную респираторно-кишечную инфекцию ставят при обнаружении специфической флуоресценции не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3 ... 5 и более флуоресцирующих клеток или при наличии 15 ... 20% флуоресцирующих клеток при подсчете не менее 100 клеток в препарате. При выявлении меньшего числа флуоресцирующих клеток диагноз подтверждают исследованием антител в парных пробах сывороток крови больных животных или выделением возбудителя.
<a id="p100082"></a>3.6. При исследовании материала от животных, привитых живыми вакцинами против инфекций, на которые проводятся диагностические исследования, положительные результаты ИФ во всех случаях следует подтверждать исследованием парных проб сывороток крови.


## 4. <a id="p100083"></a>Обнаружение антигена вируса ИРТ в РДП.


#### <a id="p100084"></a>4.1 РДП ставят в агаровом геле.

<a id="p100085"></a>4.2. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; исследуемый материал от больных животных; специфический антиген.
<a id="p100086"></a>4.3. Агаровую среду готовят по прописи: агар - 1,0, физиологический раствор pH 7,4 - 100,0 мл. Агар расплавляют на водяной бане и разливают в чашки Петри по 25 мл или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки - одну центральную и 6 вокруг нее на расстоянии 0,5 ... 0,7 см.
<a id="p100087"></a>4.4. Постановка реакции. В центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в лунки по окружности - испытуемый материал. Параллельно испытуемый материал исследуют с отрицательной сывороткой.
<a id="p100088"></a>Контроли:
1) <a id="p100089"></a>контрольный положительный антиген + специфическая сыворотка;
2) <a id="p100090"></a>контрольный положительный антиген + отрицательная сыворотка.
<a id="p100091"></a>Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру, выдерживают при температуре 37 °C в течение 18 ... 24 ч и затем при комнатной температуре в течение такого же времени.
<a id="p100092"></a>4.5. Учет реакции. Реакцию считают положительной при условии образования ясно выраженной линии преципитации между лунками с исследуемым антигеном и специфической сывороткой, а также между контрольным положительным антигеном и специфической сывороткой при отрицательном результате с отрицательной сывороткой.


## 5. <a id="p100093"></a>Обнаружение антигена адено в патологическом материале в РСК.

<a id="p100094"></a>5.1. Комплементсвязывающий антиген готовят из 20%-ной суспензии патологического материала, обработанной, как указано в [п. 2.10](#p100072). Для этого к ней добавляют 1%-ный раствор гексаметафосфата натрия до конечной концентрации 0,05% и раствор 1 н. HCl для снижения pH до 4,1.
<a id="p100095"></a>Смесь оставляют на 30 мин, а затем центрифугируют при 5 тыс. об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок растворяют в 1/20 первоначального объема суспензии 0,1 М (моль/л) фосфатно-буферного раствора, pH 7,9, содержащего 0,85% хлористого натрия. Полученный раствор осветляют центрифугированием при том же режиме и исследуют в РСК с иммунными сыворотками к аденовирусу крупного рогатого скота.
<a id="p100096"></a>5.2. Компоненты реакции: испытуемый антиген; два стандартных специфических антигена, относящиеся к двум антигенным подгруппам; отрицательный антиген; две специфических сыворотки, соответствующие антигенным подгруппам; нормальная сыворотка.
<a id="p100097"></a>5.3. Испытуемый антиген исследуют в двукратных разведениях, остальные антигены и сыворотки - в удвоенном титре.
<a id="p100098"></a>5.4. Постановка реакции. Реакцию ставят в пробирках в объеме 0,5 мл или используют микротитратор Такачи. РСК проводят в три этапа: титрование комплемента в чистом виде, титрование комплемента в присутствии антигенов и сывороток, главный опыт.

#### <a id="p100099"></a>5.5 Для титрования комплемента во вспомогательном ряду пробирок готовят различные дозы по следующей схеме:



<table>
<colgroup><col width="31%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100100"></a>Компоненты, мл</td><td colspan="6"><a id="p100101"></a>Искомые дозы комплемента</td></tr>
<tr><td><a id="p100102"></a>0,16</td><td><a id="p100103"></a>0,19</td><td><a id="p100104"></a>0,22</td><td><a id="p100105"></a>0,25</td><td><a id="p100106"></a>0,28</td><td><a id="p100107"></a>0,31</td></tr>
<tr><td><a id="p100108"></a>Комплемент 1:20</td><td><a id="p100109"></a>0,16</td><td><a id="p100110"></a>0,19</td><td><a id="p100111"></a>0,22</td><td><a id="p100112"></a>0,25</td><td><a id="p100113"></a>0,28</td><td><a id="p100114"></a>0,31</td></tr>
<tr><td><a id="p100115"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100116"></a>0,34</td><td><a id="p100117"></a>0,31</td><td><a id="p100118"></a>0,28</td><td><a id="p100119"></a>0,25</td><td><a id="p100120"></a>0,22</td><td><a id="p100121"></a>0,19</td></tr>
</table>


<a id="p100122"></a>Комплемент титруют по следующей схеме:


<table>
<colgroup><col width="31%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="11%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100123"></a>Компоненты, мл</td><td colspan="6"><a id="p100124"></a>Искомые дозы комплемента</td></tr>
<tr><td><a id="p100125"></a>0,16</td><td><a id="p100126"></a>0,19</td><td><a id="p100127"></a>0,22</td><td><a id="p100128"></a>0,25</td><td><a id="p100129"></a>0,28</td><td><a id="p100130"></a>0,31</td></tr>
<tr><td><a id="p100131"></a>Комплемент в разных дозах</td><td><a id="p100132"></a>0,1</td><td><a id="p100133"></a>0,1</td><td><a id="p100134"></a>0,1</td><td><a id="p100135"></a>0,1</td><td><a id="p100136"></a>0,1</td><td><a id="p100137"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100138"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100139"></a>0,2</td><td><a id="p100140"></a>0,2</td><td><a id="p100141"></a>0,2</td><td><a id="p100142"></a>0,2</td><td><a id="p100143"></a>0,2</td><td><a id="p100144"></a>0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100145"></a>Гемолитическая система</td><td><a id="p100146"></a>0,2</td><td><a id="p100147"></a>0,2</td><td><a id="p100148"></a>0,2</td><td><a id="p100149"></a>0,2</td><td><a id="p100150"></a>0,2</td><td><a id="p100151"></a>0,2</td></tr>
<tr><td><a id="p100152"></a>Результат</td><td><a id="p100153"></a>++++</td><td><a id="p100154"></a>++</td><td><a id="p100155"></a>0</td><td><a id="p100156"></a>0</td><td><a id="p100157"></a>0</td><td><a id="p100158"></a>0</td></tr>
</table>


<a id="p100159"></a>За титр комплемента принимается наименьшая доза его, вызывающая полный гемолиз эритроцитов гемолитической системы через 30 мин при температуре 37 °C.
<a id="p100160"></a>Комплемент титруют не чаще 1 раза в месяц.
<a id="p100161"></a>Титрование комплемента в присутствии антигенов и сывороток проводят по следующей [схеме](#p100122) (см. с. 216).
<a id="p100162"></a>Инкубируют систему на водяной бане при температуре 37 ... 38 °C в течение 60 ... 90 мин, добавляют гемолитическую систему по 0,2 мл во все пробирки всех рядов.


<table>
<colgroup><col width="6%"><col width="33%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100163"></a>Ряд</td><td rowspan="2"><a id="p100164"></a>Компоненты, мл</td><td colspan="6"><a id="p100165"></a>Искомые дозы комплемента</td></tr>
<tr><td><a id="p100166"></a>0,19</td><td><a id="p100167"></a>0,22</td><td><a id="p100168"></a>0,25</td><td><a id="p100169"></a>0,28</td><td><a id="p100170"></a>0,31</td><td><a id="p100171"></a>0,34</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100172"></a>1</td><td><a id="p100173"></a>Антиген специфический</td><td><a id="p100174"></a>0,1</td><td><a id="p100175"></a>0,1</td><td><a id="p100176"></a>0,1</td><td><a id="p100177"></a>0,1</td><td><a id="p100178"></a>0,1</td><td><a id="p100179"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100180"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100181"></a>0,1</td><td><a id="p100182"></a>0,1</td><td><a id="p100183"></a>0,1</td><td><a id="p100184"></a>0,1</td><td><a id="p100185"></a>0,1</td><td><a id="p100186"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100187"></a>Комплемент</td><td><a id="p100188"></a>0,1</td><td><a id="p100189"></a>0,1</td><td><a id="p100190"></a>0,1</td><td><a id="p100191"></a>0,1</td><td><a id="p100192"></a>0,1</td><td><a id="p100193"></a>0,1</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100194"></a>2</td><td><a id="p100195"></a>Антиген испытуемый</td><td><a id="p100196"></a>0,1</td><td><a id="p100197"></a>0,1</td><td><a id="p100198"></a>0,1</td><td><a id="p100199"></a>0,1</td><td><a id="p100200"></a>0,1</td><td><a id="p100201"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100202"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100203"></a>0,1</td><td><a id="p100204"></a>0,1</td><td><a id="p100205"></a>0,1</td><td><a id="p100206"></a>0,1</td><td><a id="p100207"></a>0,1</td><td><a id="p100208"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100209"></a>Комплемент</td><td><a id="p100210"></a>0,1</td><td><a id="p100211"></a>0,1</td><td><a id="p100212"></a>0,1</td><td><a id="p100213"></a>0,1</td><td><a id="p100214"></a>0,1</td><td><a id="p100215"></a>0,1</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100216"></a>3</td><td><a id="p100217"></a>Сыворотка специфическая</td><td><a id="p100218"></a>0,1</td><td><a id="p100219"></a>0,1</td><td><a id="p100220"></a>0,1</td><td><a id="p100221"></a>0,1</td><td><a id="p100222"></a>0,1</td><td><a id="p100223"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100224"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100225"></a>0,1</td><td><a id="p100226"></a>0,1</td><td><a id="p100227"></a>0,1</td><td><a id="p100228"></a>0,1</td><td><a id="p100229"></a>0,1</td><td><a id="p100230"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100231"></a>Комплемент</td><td><a id="p100232"></a>0,1</td><td><a id="p100233"></a>0,1</td><td><a id="p100234"></a>0,1</td><td><a id="p100235"></a>0,1</td><td><a id="p100236"></a>0,1</td><td><a id="p100237"></a>0,1</td></tr>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100238"></a>4</td><td><a id="p100239"></a>Сыворотка отрицательная</td><td><a id="p100240"></a>0,1</td><td><a id="p100241"></a>0,1</td><td><a id="p100242"></a>0,1</td><td><a id="p100243"></a>0,1</td><td><a id="p100244"></a>0,1</td><td><a id="p100245"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100246"></a>Физиологический раствор</td><td><a id="p100247"></a>0,1</td><td><a id="p100248"></a>0,1</td><td><a id="p100249"></a>0,1</td><td><a id="p100250"></a>0,1</td><td><a id="p100251"></a>0,1</td><td><a id="p100252"></a>0,1</td></tr>
<tr><td><a id="p100253"></a>Комплемент</td><td><a id="p100254"></a>0,1</td><td><a id="p100255"></a>0,1</td><td><a id="p100256"></a>0,1</td><td><a id="p100257"></a>0,1</td><td><a id="p100258"></a>0,1</td><td><a id="p100259"></a>0,1</td></tr>
</table>


<a id="p100260"></a>За рабочую дозу комплемента принимают его наименьшее количество, которое вызывает полный гемолиз эритроцитов во всех рядах с антигенами и сыворотками. Результаты учитывают через 30 ... 45 мин инкубации при температуре 37 ... 38 °C. В главном опыте используют 1,5 или 2 дозы комплемента.
<a id="p100261"></a>5.6. Главный опыт. Положительной считается реакция, при которой наблюдается связывание комплемента (полная задержка гемолиза) в пробирках первого или второго рядов, содержащих испытуемый антиген и одну из специфических сывороток, при задержке гемолиза - в этих же рядах со специфическими антигенами. В пробирках третьего ряда с отрицательной сывороткой и в контролях на антикомплементарность должен быть полный гемолиз.
<a id="p100262"></a>Главный опыт ставят по следующей схеме:


<table>
<colgroup><col width="6%"><col width="21%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="8%"><col width="6%"><col width="6%"><col width="6%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="10%"></colgroup>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100263"></a>Ряд</td><td rowspan="3"><a id="p100264"></a>Сыворотка</td><td colspan="8"><a id="p100265"></a>Антиген</td><td rowspan="3"><a id="p100266"></a>Антикомплементарность</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100267"></a>специфический</td><td rowspan="2"><a id="p100268"></a>отрицательный</td><td rowspan="2"><a id="p100269"></a>1:2</td><td rowspan="2"><a id="p100270"></a>1:4</td><td rowspan="2"><a id="p100271"></a>1:8</td><td rowspan="2"><a id="p100272"></a>1:16</td><td rowspan="2"><a id="p100273"></a>1:32</td></tr>
<tr><td><a id="p100274"></a>1-й подгруппы</td><td><a id="p100275"></a>2-й подгруппы</td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100276"></a>1</td><td><a id="p100277"></a>Специфическая</td><td><a id="p100278"></a>++</td><td><a id="p100279"></a>+</td><td><a id="p100280"></a>0</td><td><a id="p100281"></a>++</td><td><a id="p100282"></a>++</td><td><a id="p100283"></a>++</td><td><a id="p100284"></a>+</td><td><a id="p100285"></a>0</td><td><a id="p100286"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100287"></a>1-й подгруппы</td><td><a id="p100288"></a>++</td><td><a id="p100289"></a>-</td><td></td><td><a id="p100290"></a>++</td><td><a id="p100291"></a>++</td><td><a id="p100292"></a>++</td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100293"></a>2</td><td><a id="p100294"></a>Специфическая</td><td><a id="p100295"></a>+</td><td><a id="p100296"></a>++</td><td><a id="p100297"></a>0</td><td><a id="p100298"></a>++</td><td><a id="p100299"></a>+</td><td><a id="p100300"></a>0</td><td><a id="p100301"></a>0</td><td><a id="p100302"></a>0</td><td><a id="p100303"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100304"></a>2-й подгруппы</td><td><a id="p100305"></a>-</td><td><a id="p100306"></a>++</td><td><a id="p100307"></a>0</td><td><a id="p100308"></a>++</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100309"></a>3</td><td><a id="p100310"></a>Отрицательная</td><td><a id="p100311"></a>0</td><td><a id="p100312"></a>0</td><td><a id="p100313"></a>0</td><td><a id="p100314"></a>0</td><td><a id="p100315"></a>0</td><td><a id="p100316"></a>0</td><td><a id="p100317"></a>0</td><td><a id="p100318"></a>0</td><td><a id="p100319"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100320"></a>4</td><td><a id="p100321"></a>Антикомплементарность антигена</td><td><a id="p100322"></a>0</td><td><a id="p100323"></a>0</td><td><a id="p100324"></a>0</td><td><a id="p100325"></a>0</td><td><a id="p100326"></a>0</td><td><a id="p100327"></a>0</td><td><a id="p100328"></a>0</td><td><a id="p100329"></a>0</td><td><a id="p100330"></a>0</td></tr>
</table>



## 6. <a id="p100331"></a>Выделение вирусов респираторно-кишечных инфекций.

<a id="p100332"></a>6.1. С целью выделения вируса используют соскобы со слизистой носовой полости, трахеи, кишечника, кусочки паренхиматозных органов и пробы фекалий. Исследуемый материал предварительно обрабатывают, как указано в [пп. 2.5](#p100066), [2.6](#p100067) и [2.9](#p100071).
<a id="p100333"></a>6.2. Выделение вируса проводят путем заражения первично-трипсинизированных или субкультур клеток почек эмбриона коров (ПЭК), почек телят (ПТ), тестикул бычков (ТБ), селезенки эмбриона коров (СЭК), легких эмбриона коров (ЛЭК), а также куриных эмбрионов в соответствии со схемой [п. 1.3](#p100009).
<a id="p100334"></a>Культуры клеток готовят в соответствии с "Методическими указаниями по приготовлению и контролю культур клеток крупного рогатого скота".
<a id="p100335"></a>6.3. Выделение вируса в культуре клеток. Пробирки с монослоем клеток отмывают раствором Хенкса и заражают по 0,2 ... 0,3 мл каждым испытуемым материалом. Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 60 ... 90 мин, а затем из них удаляют испытуемую жидкость и добавляют 1 мл поддерживающей среды, содержащей 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мкг/мл стрептомицина. Для контроля оставляют 5 пробирок, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.
<a id="p100336"></a>Зараженные и контрольные культуры клеток инкубируют при температуре 37 °C до 7 ... 14 сут и ежедневно просматривают под микроскопом с целью выявления цитопатического действия (ЦПД) вируса, имея в виду, что характер ЦПД и сроки его появления зависят от свойств размножающегося вируса и вида культуры клеток.
<a id="p100337"></a>6.3.1. Вирус ИРТ вызывает ЦПД, как правило, раньше, чем вирусы ПГ-3, РС, ВД и адено. ЦПД характеризуется округлением клеток, отслоением их от стекла и полным разрушением клеточного монослоя.
<a id="p100338"></a>6.3.2. ЦПД вируса ПГ-3 характеризуется очаговым округлением и зернистым перерождением пораженных клеток, появлением удлиненных полиморфных клеток, симпластов и синцитиальных полей, которые отслаиваются от стекла, разрежая монослой.
<a id="p100339"></a>6.3.3. Респираторно-синцитиальный вирус в культуре ткани ПЭК и ТБ вызывает округление клеток, слияние их сначала в небольшие, но постепенно увеличивающиеся синцитиальные поля. Часть клеток отслаивается от стекла, образуя пустоты в монослое.
<a id="p100340"></a>6.3.4. ЦПД вируса диареи выражается в появлении мелкозернистой инфильтрации, округлении и отторжении клеток от стекла. Часто обнаруживают вакуолизацию цитоплазмы пораженных клеток. Возможно выделение нецитопатогенных штаммов.
<a id="p100341"></a>6.3.5. Размножение аденовирусов в культуре клеток сопровождается медленным развитием ЦПД. Вначале отдельные клетки, а затем группы клеток увеличиваются в объеме, становятся рефрактерными, приобретают округлую форму, собираются в конгломераты, похожие на гроздья винограда.
<a id="p100342"></a>6.3.6. При отсутствии ЦПД в первых пассажах или слабом его проявлении проводят три последовательных пассажа. Каждый пассаж проверяют в реакции гемадсорбции (см. [п. 9](#p100354)) с эритроцитами морской свинки.
<a id="p100343"></a>При наличии в культуре клеток цитопатических изменений или положительной гемадсорбции проводят идентификацию выделенного вируса.
<a id="p100344"></a>6.4. Выделение вируса на куриных эмбрионах. Для заражения используют куриные эмбрионы 9 ... 11-суточного возраста. Эмбрионы заражают в аллантоисную полость в дозе 0,2 мл. После заражения их инкубируют при температуре 37 °C и ежедневно овоскопируют.
<a id="p100345"></a>Гибель эмбрионов в течение 48 ч считают неспецифической. Эмбрионы, погибшие через 3 ... 7 сут после заражения, вскрывают и отбирают экстраэмбриональную жидкость для проверки ее на гемагглютинирующую активность с эритроцитами петуха и проведения исследований по идентификации вируса-изолята. При отсутствии гибели эмбрионов в первом пассаже проводят второй и третий пассажи, используя для заражения экстраэмбриональную жидкость.


## 7. <a id="p100346"></a>Идентификация возбудителей методом иммунофлуоресценции.

<a id="p100347"></a>7.1. Для идентификации выделенного вируса им заражают культуру клеток, выращенную в пробирке на покровном стеклышке. В момент появления выраженного ЦПД в зараженной культуре стеклышки вынимают из пробирок, фиксируют в ацетоне и окрашивают флуоресцирующими сыворотками, как описано в [п. 3](#p100073).


## 8. <a id="p100348"></a>Идентификация вируса ИРТ и ВД в реакции нейтрализации в культуре клеток.

<a id="p100349"></a>8.1. Компоненты реакции: испытуемый (выделенный) вирус; специфическая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка.
<a id="p100350"></a>8.2. Сыворотки перед постановкой реакции разводят 1:10 питательной средой, инактивируют на водяной бане при 56 °C 30 мин. В два ряда стерильных пробирок (по 7 шт.) вносят по 2 мл сыворотки, в первый ряд - специфическую, во второй ряд - контрольную отрицательную.
<a id="p100351"></a>Готовят десятикратные разведения вируса от 10-1 до 10-7 на питательной среде в объемах, достаточных для постановки реакции, и вносят в два ряда с сыворотками, начиная с разведения 10-7, в объеме по 2 мл каждого разведения на пробирку.
<a id="p100352"></a>Пробирки со смесью разведений вируса и сывороток встряхивают и выдерживают в термостате при 37 °C 1 ч. Каждую смесь сыворотки с разведениями вируса вносят по 1 мл в 4 пробирки с культурой клеток. Пробирки инкубируют при температуре 37 °C и учитывают результаты реакции по ЦПД на 5 ... 7-е сутки.
<a id="p100353"></a>Определяют титр вируса в присутствии специфической и отрицательной сывороток и выражают его в lg ТЦД50/мл. Видовую принадлежность вируса устанавливают при наличии разности в титрах вируса с отрицательной и положительной сыворотками не менее чем на 2 логарифма.


## 9. <a id="p100354"></a>Идентификация вируса ПГ-3 в реакциях гемадсорбции (РГАд) и торможения гемадсорбции (РТГАд).

<a id="p100355"></a>9.1. Постановка реакции гемадсорбции. В пробирки с культурой клеток на 3 ... 7-й день после заражения исследуемым материалом вносят по 1 мл 0,5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки.
<a id="p100356"></a>Пробирки выдерживают в наклонном положении клеточным слоем вниз при комнатной температуре в течение 10 ... 15 мин, после чего их слегка встряхивают для отделения от клеток неадсорбированных эритроцитов, затем микроскопируют.
<a id="p100357"></a>При наличии вируса в материале отчетливо видны прикрепившиеся к клеткам эритроциты, тогда как в контрольных пробирках они проплывают в поле зрения.
<a id="p100358"></a>При положительной гемадсорбции идентификацию вируса проводят в реакции торможения гемадсорбции со специфической сывороткой к вирусу ПГ-3.
<a id="p100359"></a>9.2. Постановка реакции торможения гемадсорбции. Реакцию ставят после 3 ... 7-суточного инкубирования пробирок с инфицированной культурой клеток. Для этого из них удаляют питательную среду, промывают клетки раствором Хенкса и вносят в каждые 4 пробирки по 0,5 мл специфической к вирусу ПГ-3 сыворотки в разведении 1:10. Пробирки в наклонном положении оставляют при комнатной температуре на 30 мин для контакта клеток с антителами. Затем во все пробирки вносят по 1 мл 0,5%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Через 30 мин учитывают реакцию гемадсорбции. Отсутствие гемадсорбции в пробирках со специфической сывороткой и проявление ее в пробирках с зараженной культурой клеток, но не обработанной специфической сывороткой, свидетельствует о наличии вируса ПГ-3 в культуре клеток.


## 10. <a id="p100360"></a>Идентификация вирусов парагриппа-3 и гриппа в реакции торможения гемагглютинации (РТГА).

<a id="p100361"></a>10.1. Реакцию проводят в панелях с лунками из оргстекла в объеме 0,45 мл или микрометодом.
<a id="p100362"></a>10.2. Вначале вирус титруют в РГА и определяют его рабочее разведение. Для этого вирус разводят в объеме 0,2 мл на физиологическом растворе от 1:2 до 1:256. Затем во все лунки вносят по 0,05 мл (по одной капле) 5%-ной взвеси эритроцитов морской свинки. Для контроля на спонтанную агглютинацию смешивают в нескольких лунках по 0,05 мл взвеси эритроцитов с 0,2 мл физиологического раствора. Для перемешивания компонентов панели встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 60 ... 90 мин до полного оседания эритроцитов в контрольных лунках, после чего их просматривают на освещенном белом фоне.
<a id="p100363"></a>Положительная РГА оценивается по форме осадка эритроцитов, которые осаждаются на стенках, образуя "зонтик".
<a id="p100364"></a>10.3. Титром вируса считается наибольшее разведение его, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов, что соответствует одной гемагглютинирующей единице (1 ГАЕ) в 0,2 мл. Рабочее разведение должно содержать в 0,2 мл 4 ГАЕ, поэтому показатель последнего разведения антигена, вызвавшего агглютинацию, делят на 4. Например, если агглютинирующий титр равен 1:128, то рабочее разведение (4 ГАЕ в 0,2 мл) будет соответствовать 1:32 (128:4 = 32).
<a id="p100365"></a>10.4. Рабочую дозу антигена контролируют в РГА. Для этого в 4 лунки наливают по 0,2 мл физиологического раствора. В первую лунку вносят 0,2 мл рабочего разведения вируса, смешивают и переносят в последующие лунки. Из четвертой лунки 0,2 мл удаляют. Во все лунки добавляют по 0,2 мл физиологического раствора и по 0,05 мл взвеси эритроцитов. Реакцию учитывают через 60 ... 90 мин. При правильном выборе рабочего разведения вируса в первой и второй лунках, содержащих соответственно 2 ГАЕ и 1 ГАЕ, должна быть полная агглютинация, а в третьей и четвертой лунках агглютинации не должно быть.
<a id="p100366"></a>10.5. Для постановки основного опыта в одном ряду готовят в объеме 0,2 мл двукратные разведения специфической сыворотки до указанного на этикетке ампулы титра. Во втором ряду разводят отрицательную сыворотку. В каждую лунку обоих рядов вносят по 0,2 мл рабочего разведения вируса, содержащего 4 ГАЕ. В третьем ряду ставят контроль эритроцитов (0,05 мл эритроцитов и 0,4 мл физиологического раствора). Панели встряхивают и после 60 ... 90-минутного контакта сыворотки с вирусом в каждую лунку добавляют по 0,05 мл 5%-ной взвеси эритроцитов.
<a id="p100367"></a>Реакцию учитывают через 60 ... 90 мин после оседания эритроцитов в контрольных лунках третьего ряда.
<a id="p100368"></a>Идентификация вируса считается завершенной, если специфическая сыворотка тормозит гемагглютинирующую активность вируса до ее титра.


## 11. <a id="p100369"></a>Идентификация вирусов РС, адено и диареи в реакции диффузионной преципитации (РДП).

<a id="p100370"></a>11.1. Для идентификации в РДП респираторно-синцитиального вируса, аденовируса и вируса диареи необходимо изготовить из вируссодержащей культуральной жидкости концентрированный антиген. Для этого к 10 мл вируссодержащей жидкости с разрушенными путем однократного замораживания и оттаивания клетками добавляют 0,5 мл 1%-ного раствора гексаметафосфата натрия, после чего добавляют 0,1 н. раствор соляной кислоты для снижения pH смеси в пределах 3,8 ... 4,1. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин, затем центрифугируют при 3 ... 4 тыс. об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость выбрасывают, а осадок растворяют в 1 мл 0,1 М фосфатно-буферного раствора pH 7,9, содержащего 0,85% хлористого натрия. Нерастворившиеся частицы осаждают повторным центрифугированием при том же режиме. Надосадочную жидкость, представляющую собой концентрированный антиген, исследуют в РДП или РСК.
<a id="p100371"></a>11.2. Реакцию ставят в чашках Петри, в слое застывшего агара, приготовленного, как указано в [п. 4.3](#p100086), делают лунки диаметром 5 ... 7 мм при помощи металлического штампа. Лунки заполняют, как указано на рисунке 21.

<a id="p100372"></a> ![11. Идентификация вирусов РС, адено и диареи в реакции диффузионной преципитации](https://i.bukva.ai/yH9n8B0v/img_0.png) 

<a id="p100373"></a>Рис. 21
Линии преципитации между специфическим антигеном
и специфической сывороткой

<a id="p100374"></a>11.3. Учет реакции проводят через 24 и 48 ч. Первые сутки чашки выдерживают при температуре 37 °C, вторые - при комнатной температуре.
<a id="p100375"></a>В агаре находят основные линии преципитации между специфическим антигеном и специфической сывороткой (см. [рис. 21](#p100373)). При положительном результате реакции образуется закругление (отклонение) конца основной линии преципитации в сторону между лункой с испытуемым антигеном и специфической сывороткой (1, 3) или появляются четкие линии преципитации (2, 4). При отрицательном результате реакции (7, 8) основная линия преципитации идет по прямой к испытуемому антигену. С контрольным отрицательным антигеном (5, 6) реакция должна быть отрицательной.


## 12. <a id="p100376"></a>Идентификация вируса адено, РС и диареи в реакции связывания комплемента (РСК).

<a id="p100377"></a>12.1. Для идентификации вирусов адено, РС, диареи в РСК из вируссодержащей культуральной жидкости готовят концентрированный в 10 ... 20 раз антиген. Методика изготовления антигена описана в [п. 11.1](#p100370).
<a id="p100378"></a>12.2. Титрование комплемента проводят по схемам, приведенным в [п. 5.5](#p100099).

#### <a id="p100379"></a>12.3 Главный опыт ставят по следующей схеме:



<table>
<colgroup><col width="9%"><col width="25%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="9%"><col width="19%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="3"><a id="p100380"></a>Комплемент</td><td rowspan="3"><a id="p100381"></a>Антиген в разведениях</td><td colspan="4"><a id="p100382"></a>Сыворотка</td><td rowspan="3"><a id="p100383"></a>Антикомплементарность антигенов</td></tr>
<tr><td colspan="3"><a id="p100384"></a>Специфическая (в удвоенном титре)</td><td rowspan="2"><a id="p100385"></a>Контрольная отрицательная</td></tr>
<tr><td><a id="p100386"></a>1:8</td><td><a id="p100387"></a>1:16</td><td><a id="p100388"></a>1:32</td></tr>
<tr><td rowspan="6"><a id="p100389"></a>1,5 дозы</td><td rowspan="2"><a id="p100390"></a>Испытуемый</td><td><a id="p100391"></a>++</td><td><a id="p100392"></a>++</td><td><a id="p100393"></a>+</td><td rowspan="2"><a id="p100394"></a>0</td><td rowspan="2"><a id="p100395"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100396"></a>++</td><td><a id="p100397"></a>++</td><td></td></tr>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100398"></a>Специфический</td><td><a id="p100399"></a>++</td><td><a id="p100400"></a>++</td><td><a id="p100401"></a>++</td><td rowspan="2"><a id="p100402"></a>0</td><td rowspan="2"><a id="p100403"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100404"></a>++</td><td><a id="p100405"></a>++</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100406"></a>Контрольный отрицательный</td><td><a id="p100407"></a>0</td><td><a id="p100408"></a>0</td><td><a id="p100409"></a>0</td><td><a id="p100410"></a>0</td><td><a id="p100411"></a>0</td></tr>
<tr><td><a id="p100412"></a>Антикомплементарность сывороток</td><td><a id="p100413"></a>0</td><td><a id="p100414"></a>0</td><td><a id="p100415"></a>0</td><td><a id="p100416"></a>0</td><td><a id="p100417"></a>-</td></tr>
</table>


<a id="p100418"></a>Связывание комплемента проводят при температуре 4 °C в течение 16 ... 18 ч.
<a id="p100419"></a>12.4. Положительной считается реакция, при которой происходит связывание комплемента (полная задержка гемолиза) в присутствии специфической сыворотки с антигеном из испытуемого материала и со специфическим антигеном, при полном гемолизе в рядах с отрицательным антигеном и отрицательной сывороткой.


## 13. <a id="p100420"></a>Идентификация аденовируса в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА).

<a id="p100421"></a>13.1. Реакцию проводят в панелях с лунками из оргстекла в объеме 0,45 мл или микрометодом.
<a id="p100422"></a>В одном ряду готовят в объеме 0,2 мл двукратные разведения испытуемого вируса от 1:1 до 1:128. Во втором разводят нормальную (безвирусную) культуральную жидкость. К каждому разведению обоих рядов добавляют по 0,2 мл специфической к аденовирусу сыворотки, разведенной на три двукратных разведения меньше, чем титр, указанный на этикетке ампулы (например, титр сыворотки в РНГА 1:128, для реакции ее разводят 1:16).
<a id="p100423"></a>13.2. Разведения вируса, нормальной культуральной жидкости и сыворотки готовят на физиологическом растворе, pH 7,2 ... 7,4, содержащем 1% нормальной сыворотки кролика, истощенной эритроцитами барана, или 0,02% бычьего альбумина.
<a id="p100424"></a>Панели осторожно встряхивают и оставляют на 40 ... 60 мин при температуре 37 °C. Затем во все лунки обоих рядов добавляют по 0,05 мл (по одной капле) эритроцитарного диагностикума (антигена). Панели повторно встряхивают и выдерживают в течение 1 ... 2 ч при комнатной температуре.
<a id="p100425"></a>13.3. Реакцию считают положительной, а аденовирус идентифицированным, если в первом ряду с вирусом произойдет торможение агглютинации в первых, хотя бы в 2 ... 3, лунках при условии полной агглютинации во всех лунках второго (контрольного) ряда.


## 14. <a id="p100426"></a>Ретроспективная диагностика.

<a id="p100427"></a>14.1. Ретроспективную диагностику респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота проводят с целью обнаружения специфических антител в сыворотке крови переболевших животных при помощи РТГА, РСК, РДП, РНГА, РН, РНВГ согласно схеме [п. 1.3](#p100009).
<a id="p100428"></a>14.2. В реакции используют парные пробы сывороток, взятые в первые 2 ... 3 сут болезни и через 14 ... 30 сут.
<a id="p100429"></a>Сыворотки исследуют в течение 3 сут со дня взятия крови или после хранения в замороженном виде в течение не более 3 мес.
<a id="p100430"></a>Пробы сывороток прогревают при температуре 56 °C в течение 30 мин и исследуют на наличие антител в различных серологических реакциях, используя для этой цели соответствующие наборы диагностикумов.
<a id="p100431"></a>14.3. Методы постановки РТГА, РДП, РСК описаны в [пп. 10](#p100360), [11](#p100369), [12](#p100376).
<a id="p100432"></a>14.4. Постановка реакции нейтрализации вирусных гемагглютининов (РНВГ) при диагностике ПГ-3. Реакцию ставят микрометодом.
<a id="p100433"></a>Прогретые испытуемые сыворотки разводят физиологическим раствором 1:40 (или 1:32) и разливают по 0,025 мл (одной капле) в 10 ... 12 лунок (лучше V-образной формы) по горизонтальным рядам панели микротитратора. В первый ряд (контрольный) вместо сыворотки вносят по 0,025 мл физиологического раствора. По вертикальным рядам справа налево в лунки вносят по 0,025 мл различных разведений гемагглютинирующего антигена. Готовят двукратные разведения антигена от 1:2 до 1:512 ... 1024 в объеме 1 ... 5 мл или больше (антиген должен быть разведен на одно разведение больше титра, указанного на этикетке ампулы). Каждое разведение антигена, начиная с наибольшего, вносят в один вертикальный ряд. Панели встряхивают и после 30 ... 60-минутного контакта сыворотки с антигеном в каждую лунку добавляют по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитов морской свинки.
<a id="p100434"></a>Реакцию учитывают через 60 ... 90 мин в следующем порядке. Вначале по контрольному ряду определяют количество гемагглютинирующих единиц (ГАЕ), содержащихся в каждом разведении антигена. За одну ГАЕ принимают наибольшее разведение антигена, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. Затем контролируют сыворотки на неспособность спонтанно агглютинировать эритроциты по оседанию последних в лунках вертикальных рядов справа, содержащих меньше 1 ГАЕ антигена. После этого определяют количество ГАЕ антигена, нейтрализованных каждой сывороткой, и по нему находят титр антител.
<a id="p100435"></a>Титр антител соответствует количеству нейтрализованных сывороткой гемагглютинирующих единиц, умноженному на 10. Например, если сыворотка нейтрализовала 8 ГАЕ антигена, то титр ее будет соответствовать 1:80 (8·10 = 80). При исследовании сыворотки 1:32 число ГАЕ умножают на 8.
<a id="p100436"></a>14.5. Постановка реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при диагностике ИРТ и аденоинфекции. Исследуемые и контрольные (специфическую и отрицательную) сыворотки разводят двукратно в объеме 0,2 мл. К каждому разведению добавляют по 0,05 мл (одной капле) эритроцитарного диагностикума.
<a id="p100437"></a>Разведения сывороток готовят на физиологическом растворе pH 7,2 ... 7,4, содержащем 1% нормальной сыворотки кролика, истощенной эритроцитами барана, или 0,02% бычьего альбумина. Смесь сыворотки с антигеном осторожно встряхивают и оставляют на 1 ... 2 ч при комнатной температуре. Реакцию можно ставить микрометодом.
<a id="p100438"></a>За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, которое вызвало агглютинацию эритроцитарного диагностикума (антигена). В ряду с контрольной отрицательной сывороткой агглютинации не должно быть.
<a id="p100439"></a>14.6. Реакцию нейтрализации с целью ретроспективной диагностики инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи ставят методом разведения испытуемых сывороток с постоянной дозой вируса.
<a id="p100440"></a>14.6.1. Для постановки реакции нейтрализации необходимо предварительно титровать вирус в культуре клеток. Для этого сухой антиген (вирус) разводят десятикратно от 10-1 до 10-10 (конечный титр сухого антигена указан на этикетке) питательной средой. Каждым разведением в объеме 1 мл заражают по 4 пробирки с культурой клеток, отмытой раствором Хенкса. Культуры клеток инкубируют при 37 °C, ежедневно просматривают и учитывают результаты на 5 ... 7-е сутки.
<a id="p100441"></a>Титром вируса считают наибольшее разведение его, вызывающее ЦПД в 50% культур клеток. Вычисляют титр по методу Рида и Менча и выражают в ТЦД50/мл.
<a id="p100442"></a>14.6.2. Испытуемые сыворотки прогревают на водяной бане при 56 °C 30 мин, затем готовят двукратные разведения от 1:2 до 1:64 на питательной среде в объеме 0,5 мл. Для этого в стерильные пробирки вносят по 0,5 мл питательной среды, затем в первую пробирку вносят 0,5 мл испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, переносят во вторую и т.д.
<a id="p100443"></a>Затем готовят необходимый объем вируса, содержащего 100 или 1000 ТЦД50 в 0,1 мл, и добавляют равный объем его (0,5 мл) в каждую пробирку с разведением сыворотки. Смесь сыворотки и вируса встряхивают, выдерживают при 37 °C в течение 1 ч для вируса ИРТ, для ВД - в течение 2 ... 3 ч при температуре 4 °C. После этого в 4 пробирки с культурой клеток вносят по 0,2 мл смеси сыворотки и вируса и по 0,8 мл поддерживающей среды. Культуры клеток инкубируют при 37 °C.
<a id="p100444"></a>14.6.3. Учет реакции проводят после появления цитопатических изменений в культуре клеток. Для контроля оставляют 4 пробирки с незараженной культурой клеток, 4 пробирки заражают по 0,2 мл вируса в рабочей дозе.
<a id="p100445"></a>14.6.4. Титром сыворотки считают ее предельное разведение, сдерживающее развитие ЦПД вируса в 50% зараженных культур клеток.
<a id="p100446"></a>14.7. Ретроспективный диагноз ставят при четырехкратном и больше приросте антител в парных пробах сывороток переболевших животных [(1)](https://bukva.ai/docs/115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-8#p100200).



<a id="p100447"></a>

---