Методические указания по лабораторной диагностике синдрома снижения яйценоскости у кур (ССЯ-76) методом иммуноферментного анализа (ИФА)

(утв. Минсельхозом СССР 12.02.1990)

Утверждены Минсельхозом СССР 12 февраля 1990 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ СИНДРОМА СНИЖЕНИЯ ЯЙЦЕНОСКОСТИ У КУР (ССЯ-76) МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА (ИФА)

1. Общие положения.

Для проведения лабораторной диагностики синдрома снижения яйценоскости у кур (ССЯ-76) используют метод иммуноферментного анализа для выявления специфических антител в сыворотках крови кур.

Сущность метода заключается в выявлении комплекса антиген — антитело в результате взаимодействия специфических антител с антивидовым пероксидазным конъюгатом, который вызывает разложение субстрата с образованием цветного продукта реакции.

Для постановки ИФА используют «Набор для диагностики ССЯ-76 иммуноферментным методом», состоящий из иммуноспецифических и неспецифических реагентов.

В ветеринарную лабораторию из птицеводческих хозяйств, где регистрируют снижение яичной продуктивности, появление яиц с депигментированной и декальцинированной скорлупой, доставляют по 20 ... 30 проб сывороток крови, объемом 0,3 ... 0,5 см3 каждая, от птицы трех возрастов: 100 ... 120 дней, 150 ... 180 дней и 200 ... 250 дней.

2. Порядок исследования.

Для постановки ИФА используют планшеты с адсорбированным антигеном вируса ССЯ-76.

Приготовление рабочих растворов.

Раствор № 1. 0,01 М калий-фосфатный буфер, содержащий 0,5 М раствор хлорида натрия с конечной концентрацией детергента (твин-20 или препарат ОС-20) 0,1%, pH 7,2 ... 7,4. Раствор предназначен для разведения сывороток, антивидового конъюгата, промывки планшетов.

Для его приготовления содержимое флакона концентрированного разбавителя из набора вместе с содержимым флакона детергента и 44,0 г хлорида натрия растворяют в 1500 см3 дистиллированной воды.

Раствор № 2. Содержимое ампулы с положительной сывороткой крови кур растворяют в 1,0 см3 раствора № 1.

Раствор № 3. Содержимое ампулы с отрицательной сывороткой крови кур растворяют в 1,0 см3 раствора № 1.

Раствор № 4. Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 см3 раствора № 1.

Раствор № 5. Таблетку гидроперита растворяют в 15 см3 дистиллированной воды. До использования раствор сохраняют в защищенном от света месте при 4 ... 8 °C.

Раствор № 6. Содержимое флакона с 5-аминосалициловой кислотой растворяют в 25 см3 горячей дистиллированной воды (70 +/- 2 °C) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят pH до 6,0 +/- 0,1 с помощью 1%-ного раствора гидроокиси натрия. Раствор готовят непосредственно перед использованием.

Раствор № 7. Для приготовления субстратно-индикаторной смеси к 0,1 см3 раствора № 5 добавляют 3,3 см3 холодной (4 ... 8 °C) дистиллированной воды, затем к 2 см3 полученного раствора приливают 18 см3 раствора № 6. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

3. Постановка реакции.

Образцы исследуемых сывороток разводят 1:100 раствором № 1. С этой целью к 9,9 см3 раствора № 1 добавляют 0,1 см3 сыворотки крови птиц. Затем в три лунки (A1, B1, C1) вертикального ряда планшета вносят по 0,1 см3 разведенной положительной сыворотки (раствор № 2) и в следующие три лунки (D1, E1, F1) вносят по 0,1 см3 разведенной отрицательной сыворотки (раствор № 3). В остальные лунки вносят по 0,1 см3 разведенных исследуемых сывороток, используя по две лунки на каждую пробу сыворотки крови. Планшеты ставят в термостат и инкубируют при 37,0 +/- 0,5 °C в течение 60 мин.

Планшеты промывают раствором № 1 три раза по 5 мин путем заполнения лунок по 0,2 см3 и удаления раствора сливанием или отсасыванием с помощью специального промывающего устройства. Затем планшеты подсушивают путем постукивания по фильтровальной бумаге.

Во все лунки вносят по 0,1 см3 раствора № 4 (антивидового конъюгата) и инкубируют в термостате (37 °C) в течение 60 мин.

Планшеты промывают три раза по 5 мин, как указано в п. 3.2.

Готовят субстратно-индикаторную смесь и вносят во все лунки планшета по 0,1 см3 раствора № 7, выдерживают при комнатной температуре 30 ... 40 мин.

4. Учет результатов реакции.

Результаты реакции учитывают визуально. При наличии специфических антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости (ССЯ-76) содержимое лунок с исследуемыми сыворотками имеет коричневое окрашивание, сравнимое с цветом окрашивания в лунках с положительной сывороткой (лунки планшета A1, B1, C1).

Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие бледно-желтую окраску лунок, аналогичную цвету содержимого лунок с отрицательной сывороткой (лунки планшета D1, E1, F1).

Печ. Цех УСЗ УД при Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, заказ № 179, тираж 300 экз.

---