Методические указания по лабораторной диагностике возбудителей дерматомикозов животных

(утв. Минсельхозом СССР 18.03.1980)

Утверждены Минсельхозом СССР

2.2. Корочки с остатками волос, волосы выдергивают пинцетом из пораженных участков (по возможности менее загрязненных) и помещают в пробирки с ватными пробками или бумажные пакетики.

2.3. Образцы снабжают этикеткой с указанием области, района, хозяйства, возраста и степени поражения животного, а также даты взятия материала и высылают для исследования в лабораторию.

3. Люминесцентный анализ патологического материала.

3.1. Для люминесцентного анализа патологического материала используют ртутно-кварцевые лампы ПРК-2, ПРК-4, Л-80 и другие люминесцентные аппараты, оснащенные фильтром Вуда.

3.2. Материал просматривают через 10 — 15 мин после включения лампы, материал (волосы, кожные чешуйки), инфицированный возбудителем микроспории, дает характерное изумрудно-зеленое свечение. При трихофитии пораженные волосы не имеют такого свечения.

4. Микроскопия патологического материала.

4.1. Для микроскопического исследования патматериал помещают в стерильную чашку Петри, которую ставят на темный фон (черную бумагу).

4.2. С помощью препаровальной иглы и глазного скальпеля отбирают и отрезают утолщенные корневые части волос, покрытые белым налетом, и кожные чешуйки. Длина отрезков, подготовленных к микроскопии, 1 — 2 мм. Затем несколько отрезков волосков и чешуек (8 — 10) переносят на предметное стекло в каплю 10 — 15%-ного KOH или NaOH, слегка подогревают над пламенем горелки до появления белого ореола вокруг капли, после чего добавляют каплю 50%-ного водного раствора глицерина и препарат накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с объективом x10, затем x40.

4.3. При микроскопии пораженных волос от животных, больных дерматомикозами, обнаруживаются чехол из артроспор вокруг волоса, артроспоры, расположенные в виде цепочек внутри волоса, или развитие мицелия вокруг и внутри волоса, в кожных чешуйках отмечается мицелий гриба и цепочки артроспор. Размер артроспор в патологическом материале от животных, больных трихофитией, составляет 2,5 — 7 мкм, в патологическом материале от животных, больных микроспорией, — 1,5 — 3,5 мкм.

4.4. Обнаружение грибных элементов в патологическом материале (артроспоры, мицелиальные нити) дает возможность поставить предварительный диагноз на трихофитию или микроскопию. Для точного определения вида возбудителя необходимо выделить грибы в чистой культуре.

5. Выделение чистой культуры возбудителя.

5.1. Для получения чистой культуры гриба и определения его вида проводят посевы корневых частей волос и кожных чешуек.

Посев делают на следующие питательные среды: сусло-агар и мясо-пептонно-глицериновый агар с 2% глюкозы (МПГА) — для выделения культур возбудителя от крупного рогатого скота, зебу, буйволов, овец, северных оленей; сусло-агар и агар Сабуро — для выделения культур от лошадей, пушных зверей, кроликов, морских свинок, мышевидных грызунов, кошек и собак.

При первичной изоляции дерматофитов с целью подавления роста сопутствующей микрофлоры к указанным средам можно добавлять антибиотики: пенициллин со стрептомицином (100 — 200 ЕД/мл) и актидион (циклогексимид) 0,1 — 0,5 мг/мл.

5.2. Пораженные частички волос и чешуйки кожи размером не более 2 мм переносят в стерильную чашку Петри, откуда берут отборочный материал для высева на питательные среды в пробирки. Посев производят микологической иглой. Предварительно иглу прокаливают над пламенем горелки и, слегка погружая в питательную среду, охлаждают ее. Затем иглой прикасаются к частичке волоса (чешуйке) и, соблюдая стерильность, переносят их по одному на поверхность косяка питательной среды. Волоски высевают в два-три участка поверхности агара на расстоянии 1 — 1,5 см друг от друга. На каждую экспертизу берут по 7 — 10 пробирок. Посевы выдерживают в термостате при температуре 28 °C до 30 дней.

5.3. В случае сильного загрязнения материала посторонней микрофлорой, быстро опережающей рост возбудителя, прибегают к обработке 70°-ным этиловым спиртом. При этом отобранные частички материала переносят в стерильную чашку Петри, заливают на 5 мин 15 мл спирта, затем спирт удаляют пипеткой и дважды промывают стерильной водой: наливают по 15 — 20 мл стерильной воды и отсасывают пипеткой. Волоски подсушивают в термостате при 37 °C и высевают на питательные среды. Обработанный спиртом патологический материал высевают на питательные среды без антибиотиков.

5.4. Появление роста колоний дерматофитов на месте посева пораженных волосков или кожных чешуек можно отметить на 3 — 5-й день. В отдельных случаях развитие возбудителя заметно только на 20-й день, в связи с чем наблюдения за посевами надо вести в течение месяца. Формирование колоний дерматофитов разных видов наступает в различные сроки — на 10 — 14-й день после начала роста для T. mentagrophytes, T. equinum, M. canis, equinum и на 20 — 25-й день для T. verrucosum. Описание культур следует проводить в этот период.

6. Определение вида возбудителя.

6.1. При определении вида возбудителя описывают культуральные признаки: размеры колоний, их структуру и цвет, строение растущего края, пигментацию обратной стороны колонии и питательной среды и проводят микроскопическое исследование культур, отмечая строение и ширину мицелия, форму и размеры микроконидий, макроконидий, хламидоспор и артроспор.

Для микроскопии культур готовят препараты: нагретой в пламени горелки и охлажденной микологической иглой или лопаточкой вырезают кусочек выросшей колонии гриба (при этом пробирку держат около пламени горелки), помещают его на предметное стекло в каплю 50%-ного водного раствора глицерина или воды и накрывают покровным стеклом, слегка раздавливая кусочек колонии. Микроскопируют препараты с объективом x10 и x40.

7. Характеристика культурально-морфологических признаков возбудителей дерматомикозов животных.

7.1. Trichophyton verrucosum (син. T. faviforme) (основной возбудитель дерматомикозов крупного и мелкого рогатого скота, зебу, буйволов, северных оленей). Культуры развиваются медленно, рост заметен на 5 — 7-й день.

Сусло-агар	МПГА
Культуральные признаки
К 20 — 25-му дню на питательных средах формируются колонии:
белые, сероватые или желтоватые, бархатистые, кожисто-бархатистые, кожистые, плоские или возвышенные, ровные или бугристые, неправильноскладчатые, растущий край ровный, дольчатый или лучистый, диаметр 5 — 8 мм	белые, бархатистые, плоские или возвышенные, гладкие или бугристые, растущий край дольчатый, диаметр 8 — 12 мм
Морфология
Мицелий ветвящийся, шириной 0,7 — 4 мкм	Мицелий ветвящийся, шириной 1 — 3 мкм
Микроконидии овальные, грушевидные, палочковидные, размером 1 — 3 x 2 — 8 мкм, немногочисленные	Микроконидии овальные, грушевидные, палочковидные, размером 1 — 3 x 2 — 8 мкм, немногочисленные или отсутствуют
Макроконидии неправильной формы, удлиненные, размером 3,5 — 8 x 20 — 50 мкм, немногочисленные или отсутствуют	Макроконидии отсутствуют
Артроспоры диаметром 3,5 — 8 мкм, немногочисленные или отсутствуют	Артроспоры диаметром 3,5 — 8 мкм, обильные или немногочисленные
Хламидоспоры диаметром 5 — 15 мкм	Хламидоспоры диаметром 5 — 15 мкм

7.2. Trichophyton mentagrophytes (син. T. gypseum) (основной возбудитель дерматомикозов пушных зверей, кроликов, морских свинок, мышевидных грызунов). Культуры развиваются быстро, рост заметен на 3 — 5-й день.

Сусло-агар	Агар Сабуро
Культуральные признаки
К 14-му дню на питательных средах формируются колонии:
белые, желтоватые, розоватые, плоские, ровные, мучнистые, зернистые или бархатистые, растущий край ровный или звездчатый, обратная сторона колонии желтоватая или красно-коричневая, колония покрывает всю поверхность косяка	белые, желтоватые, розоватые, плоские, ровные, бархатистые, мучнистые, обратная сторона колонии желтоватая или розоватая, колония покрывает всю поверхность косяка
Морфология
Мицелий ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 3 мкм, встречаются спиралевидные и кольцевидные окончания гиф	Мицелий ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 3 мкм, встречаются спиралевидные и кольцевидные окончания гиф
Микроконидии многочисленные, округлые, округло-овальные, диаметром 2 — 4 мкм	Микроконидии многочисленные, округлые, округло-овальные, диаметром 2 — 4 мкм
Макроконидии немногочисленные, цилиндрические с закругленными концами, булавовидные, удлиненно-овальные, размером 5 — 10 x 30 — 50 мкм	Макроконидии немногочисленные или отсутствуют, цилиндрические с закругленными концами, булавовидные, удлиненно-овальные, размером 5 — 10 x 30 — 50 мкм
Артроспоры отсутствуют	Артроспоры отсутствуют
Хламидоспоры единичные или отсутствуют	Хламидоспоры единичные или отсутствуют

7.3. Trichophyton equinum (основной возбудитель трихофитии лошадей). Культуры развиваются быстро, рост появляется на 3 — 5-й день.

Сусло-агар	Агар Сабуро
Культуральные признаки
К 14-му дню на питательных средах формируются колонии:
белые, бархатистые, плоские, гладкие или радиальнобороздчатые, обратная сторона колонии желтоватая, красноватая, зарастает вся поверхность косяка	белые, пушистые, плоские, обратная сторона желтоватая, розовая, диаметр колонии 10 — 15 мм, некоторые штаммы растут очень слабо
Морфология
Мицелий ветвящийся, шириной 1 — 3 мкм, редко встречаются спиралевидные и кольцевидные окончания гиф	Мицелий ветвящийся, шириной 1 — 3 мкм, редко встречаются спиралевидные и кольцевидные окончания гиф
Микроконидии многочисленные, овальные, грушевидные, размером 1 — 3 x 3 — 7 мкм	Микроконидии немногочисленные, овальные и грушевидные, размером 1 — 3 x 3 — 7 мкм
Макроконидии немногочисленные, удлиненно-овальные, булавовидные, с 1 — 4 перегородками, тонкостенные, размером 3 — 7 x 15 — 45 мкм	Макроконидии единичные или отсутствуют, удлиненно-овальные, булавовидные, тонкостенные, с 1 — 4 перегородками, размером 3 — 7 x 15 — 45 мкм
Артроспоры отсутствуют	Артроспоры отсутствуют
Хламидоспоры единичные или отсутствуют	Хламидоспоры единичные или отсутствуют

7.4. Microsporum canis (син. M. lanosum, M. felineum, основной возбудитель дерматомикозов кошек и собак). Культуры развиваются быстро, рост заметен на 3 — 5-й день.

Сусло-агар	Агар Сабуро
Культуральные признаки
К 14-му дню на питательных средах формируются колонии:
белые, сероватые или бежевые, пушистые, бархатистые, бархатисто-мучнистые, распростертые, растущий край паутинистый, зарастает весь косяк	белые, желтоватые, бежевые, пушистые, бархатистые, распростертые, растущий край паутинистый, зарастает весь косяк
Морфология
Мицелий ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 4 мкм, встречаются гифы из ракеткообразных клеток	Мицелий ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 4 мкм, встречаются гифы из ракеткообразных клеток
Микроконидии немногочисленные, овальные, грушевидные, размером 1 — 3 x 1,5 — 5 мкм	Микроконидии немногочисленные, овальные, грушевидные, размером 1 — 3 x 1,5 — 5 мкм
Макроконидии многочисленные, веретеновидной формы с вытянутыми концами, с толстостенной гладкой или зубчатой оболочкой, с 5 — 11 перегородками, размером 11 — 16 x 53 — 85 мкм	Макроконидии многочисленные, веретеновидной формы с вытянутыми концами, с толстостенной гладкой или зубчатой оболочкой, с 5 — 11 перегородками, размером 11 — 16 x 53 — 85 мкм
Артроспоры отсутствуют	Артроспоры отсутствуют
Хламидоспоры единичные или отсутствуют	Хламидоспоры единичные или отсутствуют

Сусло-агар	Агар Сабуро
Культуральные признаки
К 14-му дню на питательных средах формируются колонии:
серовато-коричневые, пленчатые или бархатистые, радиально-складчатые, растущий край паутинистый, ровный, зарастает вся поверхность косяка	беловато-желтоватые, пушистые, по краю паутинистые, обратная сторона желтоватого или коричневатого, красноватого цвета, зарастает вся поверхность косяка
Морфология
Мицелий ровный или неравномерно утолщенный, ветвящийся, шириной 1 — 5 мкм	Мицелий ровный или неравномерно утолщенный, ветвящийся, шириной 1 — 5 мкм
Микроконидии единичные или отсутствуют, грушевидные, размером 1 — 2 x 3 — 5 мкм	Микроконидии отсутствуют
Макроконидии немногочисленные или отсутствуют, овальные, веретеновидные, с 1 — 3 перегородками, размером 5 — 8 x 15 — 35 мкм	Макроконидии немногочисленные или отсутствуют, овальные, веретеновидные с 1 — 3 перегородками, размером 5 — 8 x 15 — 35 мкм
Артроспоры отсутствуют	Артроспоры отсутствуют
Хламидоспоры единичные или отсутствуют	Хламидоспоры единичные или отсутствуют

7.6 Сравнительная культурально-морфологическая

характеристика основных возбудителей дерматомикозов животных при развитии на сусло-агаре

Вид возбудителя	Культуральные признаки	Морфологические признаки
		мицелий	микроконидии	макроконидии	артроспоры
T. verrucosum	Колонии медленнорастущие, белые, сероватые, желтоватые, гладкие или складчатые, возвышенные	Ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 4 мкм	Немногочисленные, овальные, грушевидные, 1 — 3 x 2 — 8 мкм	Немногочисленные, удлиненной неправильной формы, 3,5 — 8 x 20 — 50 мкм или отсутствуют	Немногочисленные, цепочками, 3,5 — 5 мкм в диаметре
T. mentagrophytes	Колонии быстрорастущие, белые, желтоватые, розоватые, мучнистые, распростертые	Ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 3 мкм, имеются спирали и завитки	Многочисленные, округлые, диаметром 2 — 4 мкм	Немногочисленные, булавовидные или цилиндрические, 5 — 10 x 30 — 50 мкм	Отсутствуют
T. equinum	Колонии быстрорастущие, белые, бархатистые, гладкие	Ровный, ветвящийся, шириной 1 — 3 мкм, имеются завитки	Многочисленные, овальные, грушевидные, 1 — 3 x 3 — 7 мкм	Немногочисленные, удлиненно-овальные, булавовидные, 3 — 7 x 15 — 45 мкм	То же
M. canis	Колонии быстрорастущие, белые, сероватые, бежевые, бархатистые, распростертые	Ровный, ветвящийся, шириной 0,7 — 5 мкм	Немногочисленные, овальные, грушевидные, 1 — 3 x 1,5 — 5 мкм	Многочисленные, веретеновидные, 11 — 16 x 53 — 85 мкм	«»
M. equinum	Колонии быстрорастущие, серовато-коричневатые, кожистые, радиально-складчатые, распростертые	Ровный, ветвящийся или неравномерно утолщенный	Единичные грушевидные или отсутствуют, 1 — 2 x 3 — 5 мкм	Немногочисленные, овальные, веретеновидные, 5 — 8 x 15 — 35 мкм	«»

8. Состав и приготовление питательных сред для культивирования дерматофитов

8.1. Сусло-агар. Неохмеленное пивное сусло, имеющее плотность 12 — 17% по сахарометру, получают на пивоваренном заводе. Разбавляют его водопроводной водой до плотности 7% по сахарометру, устанавливают pH до 8 — 8,2 добавлением 10%-ного NaOH. Разведенное сусло нагревают, не доводя до кипения, и растворяют в нем 2% агар-агара. Среду фильтруют через марлю (4 — 5 слоев), разливают в пробирки и другую стерильную посуду и стерилизуют в автоклаве 30 мин под давлением 0,5 атм. После стерилизации pH среды 6,4 — 6,7.

8.2. Агар Сабуро: глюкоза (мальтоза, декстроза) 40 г; пептон 10 г; агар-агар 20 г; вода водопроводная 1 л. В небольшом объеме воды растворяют глюкозу и пептон, доводят объем жидкости до 1 л, добавляют агар-агар и расплавляют его, нагревая среду, но не доводя до кипения. Питательную среду фильтруют через марлю (4 — 5 слоев), разливают в пробирки и другую посуду и стерилизуют в автоклаве под давлением 0,5 атм в течение 30 мин. После стерилизации pH среды 6,5 — 6,7.

8.3. Мясо-пептонно-глицериновый агар с 2% глюкозы (МПГА): глюкоза 20 г, глицерин 25, пептон 10, хлористый натрий 5 г; стерильная мясная вода (разбавленная дистиллированной водой 1 : 2) 1 л.

После растворения в мясной воде компонентов и расплавления агар-агара среду фильтруют через марлю (4 — 5 слоев), разливают в пробирки и другую посуду и стерилизуют в автоклаве под давлением 0,5 атм в течение 30 мин.

---