Методические указания по диагностике парвовирусной болезни свиней

(утв. Минсельхозом СССР 21.01.1989)

Утверждены 21 января 1989 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ДИАГНОСТИКЕ ПАРВОВИРУСНОЙ БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ

1. Общие положения.

1.1. Парвовирусная болезнь свиней — контагиозное вирусное заболевание, сопровождающееся нарушением воспроизводительной функции свиноматок. Возбудитель болезни — парвовирус свиней.

1.2. Диагноз на парвовирусную болезнь свиней устанавливают на основании характерных клинических признаков болезни у свиноматок (прохолосты, малоплодные пометы, мумифицированные плоды) и обнаружение вирусного антигена в суспензии внутренних органов плодов или специфических антител в сыворотке крови новорожденных поросят до приема молозива.

1.3. Для исследования в ветеринарную лабораторию направляют абортированные плоды длиной не более 15 см, сыворотки крови (по 2...5 см3) от свиноматок с нарушением воспроизводительной функции и по 2...3 новорожденных поросенка до приема молозива от каждой из этих свиноматок.

2. Лабораторные исследования.

2.1. Специфические антитела в сыворотке крови свиней и новорожденных поросят до приема молозива определяют в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с помощью диагностического набора, состоящего из специфического инактивированного антигена парвовируса свиней, специфической и нормальной сывороток свиней. Все компоненты набора расфасованы по 1 см3 в инсулиновые флаконы, лиофилизированы и пригодны в течение двух лет. Перед постановкой реакции каждый компонент набора растворяют в 1 см3 дистиллированной воды.

2.2. В РТГА используют рабочее разведение антигена, содержащее в 0,025 см3 8 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Для этого антиген разводят фосфатно-буферным раствором во столько раз, сколько получают от деления гемагглютинирующего титра антигена, указанного на этикетке флакона, на 8.

2.3. Сыворотки крови перед постановкой реакции разводят в 32 раза фосфатно-буферным раствором, прогревают на водяной бане при (56 +/- 1) °C в течение 30 мин и обрабатывают эритроцитами морской свинки. К 0,2 см3 инактивированной сыворотки добавляют 2 капли осадка эритроцитов и выдерживают 1 ч при температуре (20 +/- 2) °C в течение 1 ч. Эритроциты осаждают центрифугированием 20 мин при 2000 об/мин и сыворотки используют для постановки РТГА.

2.4. РТГА ставят микрометодом в лунках полистироловых пластин с U-образным дном с использованием 0,6%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. В лунки пластины вносят по 0,025 см3 фосфатно-буферного раствора и готовят двукратные разведения сывороток. В каждую лунку добавляют 0,025 см3 рабочего антигена (8 ГАЕ) и выдерживают 1 ч при температуре (20 +/- 2) °C. Затем в каждую лунку вносят 0,025 см3 0,6%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Пластину осторожно встряхивают и оставляют при температуре (6 +/- 2) °C в течение 2...3 ч. За титр антител принимают предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирующую активность антигена (8 ГАЕ). При обнаружении в сыворотках специфических антител в разведении 1:64 и выше реакцию считают положительной.

2.5. В РТГА ставят контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию в фосфатно-буферном растворе, контроль рабочей дозы антигена (8 ГАЕ) и контроль специфичности антигена с гипериммунной и нормальной сыворотками свиней.

Для контроля эритроцитов на спонтанную агглютинацию в 3 лунки вносят по 0,025 см3 фосфатно-буферного раствора и добавляют равный раствор 0,6%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Эритроциты в фосфатно-буферном растворе не должны спонтанно агглютинироваться.

Для контроля рабочей дозы антигена в 5 лунок пластины вносят по 0,025 см3 фосфатно-буферного раствора. В первую лунку добавляют 0,025 см3 рабочего разведения антигена и после смешивания 0,025 см3 жидкости переносят во вторую лунку и т.д. Из последней лунки 0,025 см3 жидкости удаляют. Затем во все лунки добавляют по 0,025 см3 0,6%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. При правильном приготовлении рабочего разведения антигена в первой, второй и третьей лунках, содержащих соответственно 4, 2 и 1 ГАЕ, должна быть полная агглютинация эритроцитов. В четвертой и пятой лунках агглютинация эритроцитов должна отсутствовать или быть незначительной.

Контроль специфичности антигена с гипериммунной и нормальными сыворотками свиней ставят, как описано в п. 2.4. Гипериммунная сыворотка свиней должна полностью подавлять гемагглютинирующую активность антигена в титре, указанном на этикетке флакона. Нормальная сыворотка свиней не должна подавлять гемагглютинирующую активность антигена.

2.6. Парвовирусный антиген в суспензии внутренних органов абортированных плодов определяют в реакции гемагглютинации (РГА). Для постановки реакции из легких, почек, печени и кишечника плодов длиной не более 15 см готовят 30%-ную суспензию на фосфатно-буферном растворе. Суспензию центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин и надосадочную жидкость используют в РГА. Плоды старше 70-дневного возраста (длиной более 17 см) непригодны для обнаружения парвовирусного антигена.

2.7. В лунки пластины вносят по 0,025 см3 фосфатно-буферного раствора и готовят двукратные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят 0,025 см3 0,6%-ной суспензии эритроцитов морской свинки. Пластину осторожно встряхивают и выдерживают при температуре 6...8 °C в течение 2...3 ч. За титр гемагглютинирующего антигена принимают его наибольшее разведение, которое вызывает полную агглютинацию эритроцитов. При обнаружении в испытуемых пробах гемагглютинирующего антигена в разведении 1:32 и выше реакцию считают положительной.

2.8. Идентификацию гемагглютинирующего антигена проводят в РТГА с использованием гипериммунной сыворотки и специфического антигена, входящих в состав диагностического набора. Реакцию ставят с испытуемым гемагглютинирующим и специфическим антигенами в рабочей дозе (8 ГАЕ), как описано в п. 2.4. Готовят двукратные разведения гипериммунной сыворотки параллельно в двух рядах пластины и в лунки каждого ряда добавляют отдельный антиген. Если титр гипериммунной сыворотки с испытуемым гемагглютинирующим антигеном отличается не более, чем в 2 раза, от титра этой же сыворотки со специфическим антигеном, то результат идентификации считают положительным.

2.9. Диагноз на заболевание считается установленным при положительной реакции на наличие парвовирусного антигена в суспензии внутренних органов плодов или специфических антител в сыворотки крови новорожденных поросят до приема молозива и характерных клинических признаков болезни у свиноматок. Обнаружение антител к парвовирусу свиней в сыворотке крови только свиноматок и хряков-производителей недостаточно для постановки диагноза на парвовирусную болезнь свиней и свидетельствует лишь о циркуляции вируса в хозяйстве.

С утверждением настоящих методических указаний Методические указания по диагностике парвовирусной болезни свиней, утвержденные Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 19 февраля 1986 г., отменяются.

Директор Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Г. Ф. Коромыслов

Приложение

к «Методическим указаниям по диагностике парвовирусной болезни свиней»

1. Приготовление фосфатно-буферного раствора, pH 7,2.

В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют 8,0 г натрия хлористого, 2,83 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного (или 1,22 г 2-водного) и 0,2 г калия фосфорнокислого однозамещенного.

2. Приготовление раствора Альсевера.

В 1,2 см3 дистиллированной воды растворяют 24,6 г глюкозы, 9,6 г натрия лимоннокислого трехзамещенного и 5,04 г натрия хлористого. Раствор стерилизуют на кипящей водяной бане в течение 30 мин.

3. Приготовление эритроцитов морской свинки.

Кровь у морской свинки берут стерильно из сердца, помещают в раствор Альсевера в соотношении 1:5 и хранят при температуре 6...8 °C. Эритроциты пригодны для использования в течение 3...4 недель. Смесь крови с раствором Альсевера центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют и осадок эритроцитов три раза отмывают фосфатно-буферным раствором до получения прозрачной жидкости над осадком эритроцитов. Отмытые неразведенные эритроциты используют для обработки сывороток и приготовления 0,6%-ной суспензии эритроцитов.

---