Методические рекомендации по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями
Актуально на 11.11.2026.
Как цитировать: "Методические рекомендации по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных неспорообразующими анаэробными бактериями". https://bukva.ai/docs/metodicheskie-rekomendatsii-po-minzdrav-sssr-ministerstvo-2
(утв. Минздравом СССР)
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИМИ АНАЭРОБНЫМИ БАКТЕРИЯМИ
Методические рекомендации подготовлены канд. мед. наук В.И. Кочеровцом (Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова, кафедра микробиологии); канд. мед. наук А.А. Петраковым (Центральный ордена Трудового Красного Знамени НИИ травматологии и ортопедии МЗ СССР); канд. мед. наук Т.Р. Пономаревой (Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР); канд. мед. наук В.С. Михайловой (Всесоюзный научно-методический и контрольный центр по лабораторному делу МЗ СССР).
Методические рекомендации могут быть использованы бактериологами для микробиологической диагностики анаэробных инфекций в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений, а также в лабораториях научно-исследовательских институтов клинического профиля.
Современные достижения теоретической и клинической медицины значительно расширили наши знания об инфекционном процессе, в частности об анаэробной инфекции.
Установлено, что инфекционный процесс при анаэробной инфекции является следствием патогенного действия не только клостридий, но и большой группы неспорообразующих бактерий (бактероидов, пептококков, пептострептококков, вейлонелл, фузо-бифидо-пропионибактерий, эубактерий, актиномицетов).
Практически нет такого органа или анатомической области, где бы анаэробы не могли вызвать инфекционный процесс. Подобные потенциальные возможности неспорообразующих анаэробов объясняются тем, что они являются обычными представителями нормальной микрофлоры слизистых кишечника, дыхательных и половых путей, ротовой полости и кожи.
При нарушении баланса «организм — микроб» вследствие различных причин, например, при длительной терапии иммунодепрессантами, антибиотиками, а также в результате травмы, хирургического вмешательства, эти микроорганизмы попадают в кровяное русло, брюшную и другие закрытые полости, различные органы и ткани и становятся причиной тяжелых воспалительных процессов, сопровождающихся высокой смертностью, особенно при анаэробной бактериемии.
Важную роль анаэробы играют в хирургии при развитии инфекционных осложнений и заболеваний у торако-абдоминальных, стоматологических и гинекологических больных и при некоторых инфекциях мягких тканей. Частота обнаружения анаэробов при гнойно-воспалительных заболеваниях в зависимости от локализации представлена в табл. 1.
ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЛОКАЛИЗАЦИИ (ДАННЫЕ ВОЕННО-МЕДИЦИНСКОЙ АКАДЕМИИ ИМ. С.М. КИРОВА)
| Локализация | Частота обнаружения, % |
|---|---|
| Челюстно-лицевая область | 100 |
| Легкие | 85 |
| Органы брюшной полости | 70 |
| Женские половые органы | 84 |
| Кожа, и другие мягкие ткани | 62 — 87 |
| Опорно-двигательный аппарат | 39 |
Микрофлора патологического очага часто отражает видовой состав ее на прилежащих слизистых оболочках. Возможные этиологические вариации анаэробного инфекционного процесса могут быть практически безграничны. Например, только в толстой кишке обитает более 400 видов микроорганизмов. Классификационно эти микроорганизмы относятся к следующим семействам:
Однако не все виды анаэробов в равной степени причастны к развитию гнойно-воспалительных и септических процессов. Около 2/3 из них вызваны бактериями нескольких видов:
Под термином «анаэробы» подразумевают микроорганизмы, которые обладают бескислородным типом дыхания и чувствительны к токсическому действию молекулярного кислорода.
Особенность культивирования анаэробных микроорганизмов состоит в том, что воздух нормальной атмосферы замещается бескислородным газом, а питательные среды предварительно восстанавливаются до окислительно-восстановительного потенциала 60 — 120 мВ.
Среды для анаэробов готовят на высокопитательной ростовой основе с добавлением ряда специальных ингредиентов: гемина, витамина К, цистеина. Селективность средам можно придать путем добавления неомицина, канамицина, гентамицина, ванкомицина, налидиксовой кислоты и желчи.
Культивирование и идентификация неспорообразующих анаэробов требуют значительного времени, что обусловлено их медленным ростом и необходимостью изучения многочисленных таксономических признаков.
Характерной особенностью метаболизма анаэробов является продукция летучих жирных кислот: пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой и/или капроновой. Аэробные бактерии летучих жирных кислот не продуцируют.
Большинство видов анаэробных бактерий чувствительны к метронидазолу (трихополу), клиндамицину, линкомицину, левомицетину, цефокситину и пеннициллину. К пенициллину, однако, нечувствительны штаммы группы B. fragilis и часто — штаммы группы B. melaninogenicus.
Взятие патологического материала и его исследование на наличие неспорообразующих анаэробов наиболее целесообразно проводить при наличии клинических признаков анаэробной инфекции.
Диагностические признаки анаэробной инфекции:
1. Неприятный запах отделяемого.
Большинство анаэробных микроорганизмов, в отличие от аэробных, продуцируют летучие жирные кислоты, обладающие резким неприятным запахом. Запах, который описывают как фекальный, обусловлен именно анаэробами, а не кишечной палочкой. Для клостридальных инфекций характерен запах прогорклого масла.
2. Некроз тканей, формирование абсцесса.
Анаэробные бактерии являются одними из ассоциантов, почти всегда выделяемыми из содержимого легочных абсцессов или абсцессов, локализованных в брюшной полости.
3. Локализация около поврежденной слизистой оболочки.
Нарушение при травме или операции целостности слизистых оболочек приводит к контаминации прилежащих тканей аэробными и анаэробными бактериями.
4. Развитие инфекции на фоне лечения антибиотиками аминогликозидной группы.
Анаэробные бактерии обладают природной устойчивостью к аминогликозидным антибиотикам (канамицину, гентамицину, амикацину, тобрамицину и др.). Поэтому развитие инфекции при лечении больного антибиотиками этой группы позволяет заподозрить анаэробную инфекцию.
5. Наличие газа в тканях или клинической картины газовой гангрены.
Образование газа в тканях может наблюдаться не только при клостридиальной инфекции, но и при целлюлитах, вызванных анаэробными стрептококками.
6. Черное окрашивание экссудата.
Черное окрашивание экссудата обусловлено наличием среди возбудителей бактерий группы B. melaninogenicus. Эти микроорганизмы обладают способностью продуцировать черный или темно-коричневый пигмент.
7. Наличие септического тромбофлебита.
При анаэробной инфекции довольно часто развиваются септические тромбофлебиты.
1. Оборудование для культивирования и исследования анаэробных бактерий, приспособления для забора материала, контроль анаэробиоза
1. Оборудование для культивирования анаэробных бактерий.
Применение строгой анаэробной техники — необходимое требование к культивированию облигатно анаэробных бактерий. Использование комплекса технических приемов и бактериологических методов, направленных на защиту микроорганизмов от токсического действия кислорода — важное условие, которое строго следует соблюдать на всех этапах работы с анаэробными бактериями. Для создания строго анаэробных условий необходимы:
а) микроанаэростаты любого типа для хранения питательных сред и культивирования посевов. Отечественная промышленность выпускает в настоящее время микроанаэростаты МИ-752;
б) вакуумный насос любого типа, создающий разрежение — 1 атм.;
в) газ, свободный от примеси кислорода. Лучшей для культивирования анаэробов является трехкомпонентная газовая смесь (80% азота, 10% водорода и 10% двуокиси углерода). Смесь готовят по заявкам на кислородных заводах.
При отсутствии трехкомпонентной газовой смеси можно использовать азот «особой чистоты», другой инертный газ (аргон, гелий), а также водород и двуокись углерода той же квалификации. Вполне пригоден природный (магистральный) газ. Содержание кислорода в газах не должно превышать 0,01%. При большем содержании кислорода необходимо использовать палладиевый катализатор.
Вакуумный насос и баллон с газом с помощью резиновых шлангов через тройник соединяют с микроанаэростатом. Порядок работы по созданию анаэробных условий в микроанаэростате следующий: цилиндр микроанаэростата закрывают крышкой, завинчивают крепежный винт и откачивают воздух до отметки на вакуумметре — 1 атм. Вакуумирование проводят медленно, чтобы предотвратить вспенивание жидкости в пробирках и смачивание пробок. Перекрывают зажимом шланг, ведущий от тройника к вакуумному насосу, и открывают кран для заполнения микроанаэростата бескислородным газом. Такую процедуру повторяют трижды для удаления следовых количеств кислорода. Микроанаэростат закрывают и отсоединяют от системы. При использовании природного газа выброс газа из микроанаэростата во внешнюю среду осуществляется при условии соблюдения правил техники безопасности; после заполнения микроанаэростата природный газ, оставшийся в шлангах, также откачивается и только после этого отключают вакуумный насос.
Для контроля анаэробиоза в микроанаэростате используют один из следующих способов:
а) в микроанаэростат помещают пробирку со скошенной цитратной средой Симмонса, засеянной культурой Pseudomonas aeruginosa.
В строго анаэробных условиях косяк сохраняет зеленый цвет, а при наличии в анаэростате кислорода синегнойная палочка утилизирует цитрат и цвет среды меняется на синий.
б) в микроанаэростат помещают прокипяченную 5 мин. и быстро остуженную пептонно-дрожжевую среду или среду для контроля стерильности, в которые добавлен резазурин в концентрации 1 мкг/мл. В анаэробных условиях индикатор бесцветен, а при наличии кислорода верхняя часть питательной среды приобретает розовый оттенок;
в) в микроанаэростат помещают среду для контроля стерильности, в которую добавлено 2 — 3 капли 1% водного раствора метиленового синего. В анаэробных условиях среда обесцвечивается; при контакте с кислородом воздуха верхний слой среды приобретает зеленовато-синеватое окрашивание.
При наличии в системе кислорода проверяют герметичность микроанаэростата, резиновых шлангов и исправность вакуумного насоса.
3. Подготовка транспортных средств и приспособлений для взятия проб.
Для транспортировки образцов, предназначенных для исследования на наличие анаэробных бактерий, используют заполненные бескислородным газом и герметизированные флаконы из-под пенициллина, герметизированные шприцы, пробирки с резиновыми пробками, а также флаконы или пробирки с транспортной средой (рец. 8).
Шприцы заполняют газом через иглу, введенную в резиновую трубку, идущую от баллона; для герметизации конец иглы вкалывают в стерильную пробку.
Для заполнения флаконов и пробирок к резиновой трубке присоединяют фрагмент стерильной пластиковой трубки с иглой и ватным фильтром от системы для переливания крови однократного применения (ПР 11-01). Флаконы и пробирки продувают газом через эту иглу. За несколько секунд до окончания процедуры пробирки и флаконы прикрывают резиновыми пробками, чтобы предупредить попадание в них атмосферного воздуха, затем быстро извлекают иглу и плотно закрывают пробку. Пенициллиновые флаконы дополнительно обкатывают алюминиевыми колпачками с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах ПОК-1, стерилизуют при 1 атм. в течение 15 мин. Цвет пептонно-дрожжевого бульона в хорошо приготовленных флаконах с транспортной средой — желтоватый. Розовое окрашивание среды свидетельствует о разгерметизации; такие флаконы непригодны для употребления.
Сбор патологического материала из глубоких отделов ран производят ватным тампоном, пропитанным составом с лизированной кровью. Для этого из стальной нержавеющей проволоки диаметром 1,5 — 2,0 мм изготавливают стержень тампона длиной 21 — 22 см. На одном из концов стержня делают насечки, другой загибают в виде петли для удобства пользования. Монтируют плотную ватно-марлевую пробку и на конце с насечками — ватный тампон. Ширина его не должна превышать 0,5 см, чтобы обеспечить удобное введение в свищевой ход. Готовый ватный тампон пропитывают смесью, состоящей из 10% лизированной двукратным замораживанием и оттаиванием донорской крови, 10% глицерина и 80% физиологического раствора хлористого натрия. Излишек влаги отжимают и помещают тампон в пробирку так, чтобы конец не касался дна пробирки. Пробирку заворачивают в крафтбумагу и стерилизуют при 1 атм. в течение 20 мин. Готовые тампоны хранят в холодильнике и используют в течение недели.
4. Приборы для обнаружения аутофлуоресценции анаэробов.
Для обнаружения аутофлуоресценции анаэробных бактерий могут быть использованы следующие источники ультрафиолетового света: прибор для обнаружения витаминов в растворе (модель 833) и люминесцентный микроскоп (фильтры СЗС-72, СЗС-14-4, ФС-1-4). Исследуемый материал освещают через просвет для фиксации объектива (объектив предварительно извлекают). Исследование аутофлуоресценции проводят в темной комнате.
2. Сбор и доставка патологического материала
При наличии показаний материал для исследования на наличие анаэробов берет лечащий врач со строгим соблюдением правил асептики. Так как анаэробы являются представителями нормальной флоры человека, материал для исследования следует брать так, чтобы исключить постороннюю контаминацию и получение ложного результата.
Для бактериологического исследования пригодны материалы, полученные при пункции или вскрытии абсцессов, пункции полостей и органов, отделяемое из глубоких отделов ран. Изучение отхаркиваемой мокроты, отделяемого, взятого при бронхоскопии, мазков с поверхности ран, а также естественно выпущенной мочи дает ложные результаты.
Антибактериальная терапия и вскрытие гнойников изменяют микробный пейзаж очагов инфекции. Поэтому материал для бактериологического исследования следует брать по возможности до начала химиотерапии и до или во время вскрытия или дренирования очага. Взятие повторных анализов наиболее показано при неблагоприятном течении болезни, при неэффективности антибактериальной терапии или при возникновении осложнений (генерализация, суперинфекция и т.д.). Частая смена возбудителей при повторных анализах свидетельствует о нарушении асептики в процессе лечения.
Характер патологического очага определяет конкретные действия хирурга и выбор им необходимого приспособления для взятия материала.
Содержимое ограниченных очагов и замкнутых полостей пунктируют стерильным 2-, 5- или 10-миллилитровым шприцем с плотными резиновыми кольцами на поршне. 3 — 5 мл материала вносят путем прокола резиновой пробки во флакончик с бескислородной газовой смесью.
Если же материала всего несколько капель, то его таким же образом вносят во флакончик с транспортной средой или в пробирку, содержащую 1 мл стерильной смеси из 10% лизированной крови и 90% физиологического раствора (гемоглобин способствует более длительному выживанию анаэробов при доступе воздуха).
Доставка патологического материала в шприце, заполненном бескислородным газом, менее удобна.
В случае отсутствия транспортных флаконов, 8 — 15 мл гноя помещают в пробирку (в таком количестве гной является хорошей транспортной средой) и немедленно доставляют в лабораторию.
Отделяемое глубоких ран и свищей (после тщательной очистки их поверхностных частей) берут с помощью двух ватных тампонов, пропитанных смесью, содержащей лизированную кровь и глицерин.
Фрагменты костной и мышечной ткани берут во время операции по 3 — 4 образца, каждый объемом 0,5 — 1 см3, в отдельные стерильные пробирки (выделение одних и тех же микроорганизмов из нескольких образцов позволяет отделить микрофлору собственно очага от попавшей случайно).
При подозрении на анаэробную бактериемию берут 6 — 10 мл крови больного и, прокалывая резиновую пробку (после обработки 70% этиловым спиртом), вносят ее в герметизированный аптечный флакон с завинчивающимися алюминиевым колпачком, содержащий 80 — 100 мл предварительно восстановленной пептонно-дрожжевой среды с глюкозой или обогащенной среды для контроля стерильности (рец. 4, 8).
3. Выделение анаэробных бактерий
1. Посев патологического материала.
Посев поступившего в лабораторию материала проводят немедленно.
При поступлении нескольких образцов определяют последовательность их обработки. Для посева сначала готовят пробы, доставленные в шприцах, пробирках и флаконах без транспортных сред. Затем обрабатывают материалы, доставленные в жидких средах. Очередность определяется условиями поддержания жизнеспособности микроорганизмов.
Для культивирования в анаэробных условиях используют:
а) свежеразлитые (в течение 2 часов после приготовления) или прередуцированные (не менее суток выдержанные в анаэростате) чашки с анаэробным гемагаром (рец. 1 или 2). Использование этих сред позволяет получить рост не только всех групп клинически значимых анаэробов, но и рост факультативно-анаэробных бактерий;
б) селективные среды — для выделения только анаэробных бактерий. Для этого в анаэробный гемагар добавляют один из следующих антибиотиков: неомицин, канамицин (по 75 — 80 мкг/мл), гентамицин (50 мкг/мл) или налидиксовую кислоту (невиграмон, неграм — 40 мкг/мл). Вместо добавления антибиотиков в среду на засеянную поверхность анаэробного гемагара можно накладывать по 2 — 4 диска с канамицином (1000 мкг в диске). В зоне задержки роста факультативных анаэробов вокруг дисков часто отмечается рост чистой культуры облигатно анаэробных бактерий. Однако все эти антибактериальные препараты могут подавлять рост отдельных видов анаэробов. Поэтому посев на неселективную среду обязателен;
в) обогащенную питательную среду для контроля стерильности (прокипяченную 5 мин. и быстро остуженную) или, при отсутствии добавок для ее приготовления — питательную среду для контроля стерильности (рец. 3 и 4);
г) на общепринятые элективные и селективные среды — для выделения аэробных бактерий.
Для посева на плотные среды каплю жидкого патологического материала помешают на поверхность агара и рассевают методом «истощения», несколько раз прожигая петлю с целью получения изолированных колоний микроорганизмов.
Патологический материал с тампона (используя всю поверхность тампона) также наносят на небольшой участок агара и рассевают методом «истощения». После этого тампон вносят в жидкую среду и материал переводят в питательную среду вращением пробирки между ладонями.
Фрагменты мягких тканей измельчают в стерильной ступке, предварительно залив небольшим количеством жидкой среды для анаэробов или 10%-ной лизированной кровью в физиологическом растворе. Для посева используют несколько капель полученной эмульсии. Костные фрагменты погружают в небольшое количество жидкой среды, встряхивают 1,5 — 2 мин., вращая пробирку между ладонями, и высевают петлей на плотную среду. Оставшийся материал заливают жидкой средой для анаэробов в таком количестве, чтобы соотношение тканевого фрагмента и среды составляло примерно 1:10.
Немедленно после посева пробирки и чашки (крышками вверх) укладывают в микроанаэростат. Туда же ставят пробирку для контроля анаэробиоза. Проводят трехкратную замену газа в микроанаэростате, помещают его в термостат и инкубируют при 37 °C 2 — 7 суток.
2. Микроскопическое исследование патологического материала.
Делают мазок на стекле, окрашивают его по Граму или по Граму в модификации Копелова (см. приложение) и просматривают. Подробно описывают все обнаруженные виды организмов. Отдельные виды анаэробных бактерий имеют уникальную морфологию: для P. nucleatum характерные тонкие зернистые грамотрицательные палочки с заостренными концами, для C. perfringena — крупные грамположительные палочки с обрубленными концами. Обнаружение очень мелких грамотрицательных коккобацилл позволяет сделать предположение о наличии в материале бактероидов. Данные, полученные при микроскопии первичного материала, сопоставляют впоследствии с результатами изучения морфологии микроорганизмов, выросших в аэробных и анаэробных условиях. Обнаружение в глазке морфологических форм не растущих в аэробных условиях, также указывает на присутствие в образце анаэробных бактерий.
3. Просмотр патологического материала в ультрафиолетовом свете.
Для выявления в клиническом материале бактерий группы B. melaninogenicus/asaccharolyticus пробу исследуют в лучах длинноволнового ультрафиолета. При наличии бактероидов этой группы микроколонии или весь материал светятся красным светом.
4. Хроматографическое исследование материала (см. гл. 7).
Фиксируют и оценивают полученные в первый день исследования данные. Наличие красной аутофлуоресценции материала, обнаружение в мазке бактерий с характерной морфологией, наличие специфического запаха или пиков летучих жирных кислот на хроматограмме позволяют бактериологам в некоторых случаях уже в первый день исследования сообщить клиницистам о наличии среди возбудителей анаэробных бактерий.
Через 48 часов инкубации в анаэробных условиях приступают к выделению чистых культур. Для этого выросшие колонии просматривают с помощью бинокулярного микроскопа (серии МБС) и по нескольку колоний каждого типа рассевают параллельно секторами на две чашки: с анаэробным гемагаром и 5% кровяным агаром. Из тех же колоний готовят мазки и окрашивают их.
После этого чашку с первичным посевом просматривают в лучах ультрафиолета и регистрируют колонии, светящиеся красным (группа B. melaninogenicus) или зеленым (Fusobacterium, C. difficile) светом. Другие бактероиды, стафилококки и стрептококки могут светиться розоватым светом.
Микроскопируют мазки из жидкой среды с первичным посевом.
В случае обнаружения морфологических форм бактерий, не выделенных с плотной среды, делают высев на анаэробный гемагар и кровяной агар. Все чашки с гемагаром вновь помещают в анаэростат на 1 — 4 суток для обнаружения медленно растущих анаэробов, а чашки с кровяным агаром — в термостат.
На следующий день (4-ый день исследования) определяют наличие роста на секторах агара, инкубированного в аэробных и анаэробных условиях. Колонии, выросшие в аэробных условиях, идентифицируют по общепринятым схемам. Колонии, выросшие только в анаэробных условиях, расценивают как облигатные анаэробы и приступают к их идентификации.
На этом этапе ориентировочно можно сообщить (или подтвердить) клиницистам о наличии в исследуемом материале анаэробных бактерий. Морфологические особенности клеток и колоний, наличие аутофлуоресценции, каталазная активность бактерий в некоторых случаях позволяют определить родовую принадлежность микроба (см. гл. 4).
4. Идентификация анаэробных бактерий
Исследуемые культуры идентифицируют до вида на основании результатов изучения культуральных, морфологических, биохимических свойств и чувствительности к антибиотикам. В таблицах 2 - 5 приводятся дифференциальные характеристики наиболее часто выделяемых в бактериологических лабораториях видов анаэробных бактерий (95% всех выделяемых штаммов анаэробных бактерий). Схемы составлены на основе существующих руководств по анаэробной бактериологии (V. Sutter et al., 1980; J.A. Washington, 1981) и адаптированы к условиям клинических бактериологических лабораторий. Справочные материалы по клостридиям приведены для дифференциации их от неспорообразующих анаэробов в случае бактериальных ассоциаций.
Для идентификации используют культуры анаэробных бактерий с секторов первичного рассева на анаэробном гемагаре. Однако эти культуры, несмотря на видимую однородность, довольно часто бывают смешанными. Поэтому, если нет большой срочности, желательно еще раз рассеять культуру на анаэробном гемагаре методом «истощения».
Порядок выполнения всех тестов должен быть четко определен, все манипуляции следует выполнять быстро, чтобы предотвратить гибель анаэробных бактерий. Для получения стабильных результатов пользуются только прередуцированными средами. Чистую культуру исследуемого организма обильно засевают на следующие диагностические среды:
-
на кровяной агар — для проверки на аэротолерантность и выявления микроаэрофильных бактерий;
-
среду для контроля стерильности с бромтимолблау (рец. 7) - для выявления способности ферментировать глюкозу. Для выявления индолообразования между пробкой и стенкой пробирки укрепляют индикаторную бумажку;
-
среду для контроля стерильности или обогащенную среду для контроля стерильности (рец. 3 и 4) — для сохранения культуры и изучения характера роста на жидких средах;
-
на анаэробный гемагар (рец. 1 или 2). Предварительно в нижней части чашки с анаэробным гемагаром делают Т-образный вырез агара. На поверхность засеянного агара накладывают диски с канамицином, полимиксином, ристомицином и желчью. Диски с эскулином и нитратами помещают на густо засеянные изолированные участки агара в нижней части чашки. Это позволяет ограничить диффузию эскулина и нитратов и накопить культуру для изучения сахаролитической активности бактерий.
Грамположительные палочки засевают кроме того на:
-
среду с желатиной (рец. 11) - для выявления протеолитической активности. Пробирку со средой кипятят 5 мин., остужают в холодной воде и засевают уколом;
-
желточный агар (рец. 10) - для выявления липазы и лецитиназы.
Засеянные среды 3, 4, 5 и 6 немедленно помещают в анаэростат, среду 2 инкубируют в термостате, среду 1 — в эксикаторе с зажженной свечой.
После этого приступают к подробному изучению чистой культуры анаэробов на гемагаре: описывают морфологию колоний, наличие аутофлуоресценции и пигмента, врастание в агар, проверяют каталазную активность, готовят и окрашивают мазок и описывают морфологию клеток.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ АНАЭРОБНЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОККОВ
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ АНАЭРОБНЫХ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОККОВ
Примечание: обозначения см. таблицу 3.
ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ СПОРООБРАЗУЮЩИХ ПАЛОЧЕК
Примечание: обозначения см. таблицу 3.
Морфология и флуоресценция колоний.
Изучение морфологии колоний проводят с помощью стереоскопического микроскопа (серии МБС). Некоторые морфологические особенности полезны при ориентировочной дифференциации бактерий.
Крупные, иногда достигающие размера 5 — 6 мм, колонии с двойной зоной гемолиза характерны для Clostridium perfringens. У штаммов Fusobacterium nucleatum колонии напоминают хлебные крошки, имеют испещренную поверхность. F. varium, F. mortiferum, F. necrophorum формируют крупные колонии с выпуклым непрозрачным центром и прозрачными, плоскими, неровными краями, напоминающие «яичницу-глазунью». Через 20 — 30 мин. экспозиции на воздухе вокруг колоний фузобактерий может образовываться зеленоватое окрашивание. Для B. ureolyticus характерны врастающие в агар колонии. Колонии Actinomyces имеют розовую, рыжевато-коричневую или желтую окраску.
Для B. melaninogenicus и B. asaccharolyticus характерна ярко-красная флуоресценция в лучах ультрафиолетового света. После 5 — 14 дней инкубации флуоресценция исчезает и колонии B. melaninogenicus и B. asaccharolyticus приобретают темный пигмент (от коричневого до интенсивно-черного). F. nucleatum и некоторые виды клостридий, в частности C. difficile, могут светиться в лучах ультрафиолета зеленоватым светом. Некоторые бактероиды, пептококки и вейлонеллы имеют иногда в лучах ультрафиолетового света розовую окраску.
Многие виды клостридий, штаммы B. melaninogenicus, B. asaccharolyticus и часто Propionibacterium acnes обладают выраженной гемолитической активностью (при посеве на агар с нелизированной кровью).
Окраску мазков из чистых культур рекомендуется выполнять по Граму в модификации Копелова в связи с тем, что дифференциация анаэробных бактерий при окраске по Граму бывает затруднена. Так клетки старых культур клостридий окрашивается по Граму отрицательно и их трудно отличить от истинных грамотрицательных бактерий. Клетки в мазках из молодой культуры B. melaninogenicus выглядят как мелкие грамположительные палочки или коккобациллы. В более старых культурах клетки светло-розовые, однородные.
Клетки B. fragilis — обычно грамотрицательные, умеренно плеоморфные палочки с более ярко окрашенными закругленными концами.
Клетки F. nucleatum имеют характерную морфологию: это тонкие, длинные грамотрицательные палочки с заостренными концами, напоминающие веретено и располагающиеся сетчатыми скоплениями. Для фузобактерий других видов характерен плеоморфизм: в мазке одной культуры могут быть крупные, неровные, рожковидные и длинные нитевидные формы со вздутиями.
Толстые грамположительные палочки с обрубленными концами, располагающиеся часто парами, характерны для C. perfringens.
Анаэробные кокки (пептококки и пептострептококки) по морфологии неотличимы от стафилококков и стрептококков.
На предметное стекло наносят каплю 3% перекиси водорода, в нее вносят петлю агаровой культуры, предварительно выдержанной на открытом воздухе в течение 30 мин. Наличие пузырьков газа свидетельствует о положительной реакции. Большинство наиболее часто выделяемых представителей группы B. fragilis, а также некоторые виды пентококков, пропионибактерий и штаммы Eubacterium lentum — каталазоположительны.
После 24 — 72 часов (в зависимости от скорости роста) учитывают результаты посева бактерий на диагностические среды.
Отсутствие роста на кровяном агаре, инкубированном в эксикаторе, свидетельствует о том, что исследуемый организм действительно облигатный анаэроб.
При ферментации глюкозы происходит сдвиг pH в кислую сторону и обесцвечивание среды с бромтимолблау. Индолообразование выявляется по покраснению конца индикаторной бумажки.
Бактероиды растут гомогенно, постепенно образуя на дне пробирки осадок. Рост B. melaninogenicus иногда не виден глазом и определяется только при просмотре мазка. Рост штаммов B. melaninogenicus, B. ureolyticus, а также пептококков и вейлонелл стимулируется добавлением в среду сыворотки. Штаммы Propionibacterium acnes могут формировать в жидкой среде взвешенные колонии различного размера. Для штаммов F. varium и F. mortiferum и некоторых клостридий характерен рост с обильным образованием крупных пузырей газа.
Измеряют размер диаметра зон задержки роста исследуемого организма дисками с антибиотиками. Чувствительными считают культуры с зоной задержки роста > 10 мм, устойчивыми — < 10 мм.
а) Чувствительность к каламицину отличает фузобактерии от бактероидов. Последние, за исключением B. ureolyticus, устойчивы к этому препарату.
б) Устойчивость к полимиксину и ристомицину позволяет уточнить вопрос о принадлежности бактерий к грамположительным или грамотрицательным. Грамположительные бактерии обычно чувствительны к ристомицину, но устойчивы к полимиксину. Грамотрицательные устойчивы и ристомицину, но чувствительны к полимиксину.
в) Устойчивыми к желчи считают культуры, растущие у края диска с желчью. Чувствительные образуют вокруг диска зону ингибиции роста. Устойчивость к желчи отличает штаммы группы B. fragilis от других бактероидов и F. varium и F. mortiferum от фузобактерий других видов.
г) Гидролиз эскулина выявляется двумя способами:
- при освещении лучами длинноволнового ультрафиолетового света участок агара около диска с эскулином флуоресцирует голубым светом. При гидролитическом расщеплении препарата бактериями способность флуоресцировать теряется,
- путем нанесения 2 — 3 капель 1% водного раствора цитратноаммонийного железа на поверхность диска. Если эскулин гидролизовался, через 2 — 5 мин. вокруг диска образуется темно-коричневое или черное окрашивание.
д) Редукция нитратов в нитриты.
Диск с нитратом снимают с поверхности гемагара и помещают в чистую чашку. На поверхность диска наносят по 1 капле раствора А и Б. При редукции нитратов в нитриты диск окрашивается в синий (при использовании крахмально-водного раствора) или розовый цвет (при использовании реактива Грисса). Если цвет не меняется, на поверхность диска наносят порошок цинка. Окрашивание в синий (или розовый — при использования реактива Грисса) цвет свидетельствует о том, что нитраты не были редуцированы, а отсутствие окрашивания — о полном разрушении нитрата и нитрита.
Нитраты в нитриты редуцируют штаммы B. ureclyticus, Veillonella, Eubacterium lentum. Тест важен также при дифференциации грамположительных кокков и палочек.
Среду с желатиной инкубируют в анаэростате до появления хорошо видимого роста и помещают в холодильник вместе с контрольной пробиркой до застывания среды в незасеянной пробирке. При наличии протеолиза среда в засеянной пробирке не застывает.
Лецитиназа выявляется по наличию зоны помутнения внутри среды вокруг колоний, липаза — по наличию на поверхности среды вокруг колоний узкой, радужной, блестящей, маслянистой зоны, видимой при косом освещении.
Для определения сахаролитической активности анаэробных бактерий используют системы индикаторные бумажные (СИБ) для идентификации Enterobacteriaceae. Суточную или двухсуточную культуру собирают тампоном с поверхности гемагара (можно с гемагара с диагностическими дисками), суспендируют в предварительно прокипяченном пептонно-дрожжевом бульоне. В пробирки помещают диски с углеводами и вносят по 0,3 мл густой взвеси бактерий. Инкубируют 24 часа при 37 °C в аэробных условиях. Изменение цвета диска из малинового в желтый свидетельствует о ферментации углевода.
При использовании дисков, приготовленных в лаборатории, после суточной инкубации в пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора бромтимолблау. Изменение цвета индикатора из синего в желтый расценивается как положительная реакция.
Обнаружение бактероидов, фузобактерий, клостридий или анаэробных кокков в посеве крови расценивается как клинически значимое. Обнаружение пропионибактерий расценивается как загрязнение кожной микрофлорой. Присутствие анаэробов в повторных пробах подтверждает диагноз бактериемии.
В полной мере изложенное положение относится и к трактовке посевов ликвора. При этом, как и при посеве другого материала, необходимо всегда оценивать результаты микроскопии нативного материала и сопоставлять их с результатами бактериологического исследования.
Однозначно оцениваются положительные результаты посевов из изолированных гнойных очагов любой локализации. При этом учитывают данные бактериоскопии нативного материала, так как присутствующие в пробе анаэробы не всегда могут дать рост.
Менее информативны результаты бактериологического исследования проб, взятых с поверхности ран и дренированных гнойных очагов, так как они могут быть загрязнены анаэробной флорой извне. Однако квалифицированное и правильное взятие материала из глубины раны и исключение контакта инструмента с кожей и слизистыми делает достоверным результат бактериологического исследования.
Наличие анаэробов в пробе мочи, взятой надлобковой пункцией, имеет диагностическое значение даже без количественного подсчета колоний.
При анализе трупного материала важное значение следует придавать гисто-бактериоскопии тканевых срезов мышц и межфасциальных пространств. Именно там преимущественно обнаруживаются клостридии и анаэробные кокки.
5. Исследование анаэробных бактерий при отсутствии бескислородных газов
При отсутствии бескислородных газов и микроанаэростатов культивирование анаэробов проводят на жидких средах, разлитых в пробирки высоким столбиком (высотой 6 — 7 см). Среды перед использованием редуцируют. При инкубации в аэробных условиях кислород диффундирует на 1,5 — 2 см от поверхности, а в средней и нижней трети питательной среды сохраняются анаэробные условия. Обнаружение в жидких питательных средах микроорганизмов, не растущих при последующих высевах на кровяной агар, а также микроскопическое исследование позволяет сделать заключение о присутствии среди возбудителей строгих анаэробов.
1. Микроскопия нативного материала и исследование в лучах ультрафиолетового света.
2. Исследуемую пробу засевают одновременно на несколько сред:
а) питательную среду для контроля стерильности или обогащенную питательную среду для контроля стерильности (рец. 3 и 4) — элективную для роста аэробных и анаэробных микроорганизмов;
б) среду для контроля стерильности с налидиксовой кислотой (рец. 5) - для выделения анаэробов из ассоциаций с колиформными бактериями;
в) среду для контроля стерильности, содержащую канамицин и желчь (рец. 6) - для селективного выделения бактероидов группы B. fragilis.
Посевы инкубируют в термостате в обычной атмосфере при 37 °C в течение 2 — 7 дней.
3. При появлении видимого роста из каждой среды готовят мазки и производят высев на 5 кровяной агар. Посевы инкубируют при 37 °C в обычной атмосфере и в эксикаторе со свечой 24 — 48 ч.
Оценка результатов первичного посева и высевов на кровяной агар дается в таблице 6. При наличии в пробе только штаммов B. fragilis рост наблюдается во всех жидких средах, но отсутствует в пересевах на кровяной агар. Если в исследуемом материале присутствуют микроаэрофилы или факультативные анаэробы, то на кровяном агаре, инкубируемом в термостате или эксикаторе, будет получен рост бактерий.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ПОСЕВА НА ЭЛЕКТИВНЫЕ И СЕЛЕКТИВНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
Микроскопия нативного материала или мазков из жидких сред иногда позволяет сделать заключение о групповой (иногда видовой) принадлежности анаэробов (гл. 3 и 4).
Таким образом даже при отсутствии анаэробной техники возможна бактериологическая диагностика анаэробной инфекции. В этом случае отчет бактериолога ограничивается указанием на наличие в исследуемом материале бактероидов группы B. fragilis, других анаэробных грамотрицательных палочек, анаэробных кокков или грамположительных анаэробных палочек.
6. Определение чувствительности анаэробных бактерий к антибактериальным препаратам
Антибактериальное лечение анаэробных инфекций начинают эмпирически до получения окончательных результатов бактериологического исследования. Основой для выбора рациональной химиотерапии могут служить таблицы по лекарственной чувствительности анаэробных бактерий (таблица 7). Однако при лечении инфекций, не поддающихся терапии эмпирически выбранными препаратами, необходимо определение чувствительности возбудителя, которое проводят следующими методами:
СПЕКТР ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ (ПО FINEGOLD S.M., 1982)
| Бактерии | антибактериальный препарат | |||||||
| пенициллин | карбенициллин | цефалоспорины <**> | клиндамицин | эритромицин | метронидазол | левомицетин | тетрациклин | |
| Анаэробные кокки | 1 — 2 | 2 | 2 | 2 — 3 | 2 — 3 | 3 | 2 | 3 — 4 |
| Группа B. fragilis | 4 | 2 — 3 | 4 | 2 | 3 — 4 | 2 | 2 | 3 — 4 |
| Группа B. melaninogenicus/asaccharolyticus | 2 <*> | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 — 3 |
| Другие бактероиды и фузобактерии | 2 | 2 | 2 — 3 | 2 | 2 — 3 | 2 | 2 | 2 — 3 |
| Eubacterium и Actinomyces | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 4 | 2 | 2 — 3 |
| Clostridium perfringens | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 3 |
| Другие клостридии | 2 | 2 | 2 — 3 | 3 | 2 — 3 | 2 | 2 | 3 |
<*> Некоторые штаммы устойчивы.
<**> Некоторые цефалоспорины третьего поколения более активны.
4 — плохая или непостоянная активность
-
методом диффузии в агар из диска (рекомендуется для анаэробов как ориентировочный),
-
метод элюции из диска с оценкой по пограничной концентрации. Необходимое количество дисков (таблица 8), выпускаемых промышленностью для определения чувствительности бактерий, вносят в пробирку с 5 мл обогащенной среды для контроля стерильности. Через 2 ч после завершения диффузии антибиотика в питательную среду в пробирки вносят 2 капли суточной культуры. Пробирки встряхивают, инкубируют 48 ч при 37 °C в аэробных условиях и учитывают результаты.
КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МЕТОДОМ ЭЛЮЦИИ ИЗ ДИСКОВ
| препарат | содержание препарата в диске (мкг) | количество дисков на 5 мл среды | конечные концентрации антибиотиков (мкг/мл) |
|---|---|---|---|
| Пенициллин С1 | 6 (10 ЕД) | 1 | 1,2 (2 ЕД) |
| Ампициллин | 10 | 2 | 4 |
| Карбенициллин | 100 | 3 | 60 |
| Цефалексин | 30 | 2 | 12 |
| Левомицетин | 30 | 2 | 12 |
| Тетрациклин | 30 | 1 | 6 |
| Эритромицин | 15 | 1 | 3 |
| Клиндамицин <*> | 2 | 4 | 1,6 |
| Метронидазол <*> | 80 | 1 | 16 |
<*> Диски изготавливаются в лаборатории.
Чувствительными считает штаммы, не выросшие при данной концентрации антибиотиков или дающие мутность <= 50% по сравнению с контролем.
Данная методика позволяет легко менять тест-концентрации путем изменения объема среды или количества дисков (но не более 5 дисков на 5 мл среды).
Метод применяется для одновременного определения чувствительности большого количества штаммов.
Двукратные разведения антибактериальных препаратов вносят в растопленный и остуженный до 50 °C анаэробный гемагар. После застывания чашки подсушивают и используют немедленно или выдерживают в микроанаэростате при комнатной температуре.
Суточную культуру исследуемого организма в обогащенной среде для контроля стерильности разводят этой же регенерированной средой до мутности 1,5·108 бактериальных тел в 1 мл и с помощью репликатора наносят на поверхность агара. В каждый набор включают по 4 чашки без антибиотика: 2 засевают до и 2 после нанесения реплик на чашки с разведениями антибиотика. Одна из каждой пары является контролем роста и инкубируется 48 ч в микроанаэростате вместе с другими чашками; другая — контролем чистоты культуры и инкубируется в аэробных условиях в термостате.
За минимальную подавляющую концентрацию антибиотика для данного штамма принимают ту, при которой рост отсутствует, на поверхности агара имеется едва заметный налет или рост единичных колоний.
Для контроля правильности определения минимальной подавляющей концентрации в набор штаммов рекомендуется включать анаэробные микроорганизмы с известной чувствительностью.
7. Экспресс-диагностика анаэробной инфекции
Микробиологическая диагностика анаэробных инфекций и идентификация неспорообразующих анаэробов требуют значительного времени. Это обусловлено их медленным ростом, а также необходимостью изучения многочисленных таксономических признаков.
В подобных обстоятельствах большое значение приобретают методы экспресс-диагностики, которые позволяют обнаружить возбудителей в первый день лабораторных исследований. Применительно к анаэробным инфекциям такими методами являются: срочная микроскопия нативного материала, исследование пробы в ультрафиолетовых лучах и газохроматографический анализ.
-
микроскопия нативного препарата (см. раздел 3),
-
исследование пробы в ультрафиолетовых лучах (см. раздел 3),
Метод газовой хроматографии основан на определении летучих жирных кислот (ЛЖК) С3 - С6 (пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой, изокапроновой и капроновой), которые являются специфическими конечными продуктами метаболизма анаэробных бактерий, выявляемых как в среде роста, так и патологически измененных тканях. Аэробные бактерии этих кислот не продуцируют. В условиях клинических лабораторий наиболее приемлемым для быстрой диагностики анаэробных инфекций является парофазный вариант газохроматографического анализа (ПФА), разработанный в Ленинградском государственном университете им. А.А. Жданова. При ПФА анализу подвергают не сам образец, а находящуюся с ним в контакте газовую фазу, насыщенную ЛЖК исследуемого образца. Основное достоинство метода — простота подготовки образца для исследования и автоматическое введение пробы в хроматограф.
Исследование может быть выполнено на газовом хроматографе «Цвет-500», в комплект которого входит приставка для пневматического дозирования паровой фазы, или на хроматографах других типов, дополнительно укомплектованных такой приставкой (А.Г. Витенберг с соавт., «Лаб. дело», 1985, № 3, 151 — 154). Детектор — ионизационно-пламенный. Хроматографическая колонка стеклянная 2 м, с внутренним диаметром 3 мм, заполненная хромосорбом w (80 — 100 меж) и нанесенными на него 1% оротофосфорной кислоты (из воды) и 10% стационарной фазы SP — 1000 (из хлороформа) или полиэтиленгликоля 20 М. Температура колонки 130 °C — 150 °C, пневматического дозатора — 140 °C. Давление газа-носителя на входе в хроматографическую колонку должно соответствовать его расходу через колонку — 30 мл/мин. Давление во вспомогательной линии газа-носителя превышает давление в колонке на 0,2 — 0,4 атм. Расход водорода — 30 мл/мин., воздуха — 300 мл/мин. Шкала электрометра — 10-10 А, самописца — 10 мВ. Скорость движения диаграммной ленты 120 мм/час. Время анализа одного образца около 45 мин.
После выхода прибора на режим приступают к анализу. В пенициллиновый флакон с исследуемым образцом (0,1 — 1 мл) добавляет равное количество кристаллического бисульфата калия. Флакон закрывают резиновой пробкой. Для исключения сорбционных потерь поверхность резиновой пробки лучше защитить фторопластовой пленкой. Герметизация флакона обеспечивается специальным патроном, навинчивающаяся крышка которого плотно прижимает резиновую пробку к торцу горлышка флакона. Постоянная температура во флаконе (90 °C) поддерживается подача через штуцеры патрона термостатируемой жидкости из ультра-термостата. Патрон с образцом присоединяют к пневматическому дозатору, при этом дозирующая игла приставки, прокалывая резиновую пробку, вводится через отверстие в крышке патрона внутрь флакона на 5 — 10 мм.
В течение 10-минутного термостатирования во флаконе с образцом поддерживается давление, превышающее давление в колонке. При вводе пробы внутреннее пространство флакона соединяется с колонкой и проба за счет выравнивания давления импульсом поступает в хроматографическую колонку.
Пики на хроматограммах исследуемых образцов идентифицируются путем сравнения времени их выхода со временем выхода пиков ЛЖК при аналогичном исследовании тест-кислот. Градуировочный раствор тест-кислот содержит по 1 мкг/мл уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, валериановой, изокапроновой и капроновой кислот.
Обнаружение в клиническом материале одной или нескольких ЛЖК является убедительным доказательством наличия анаэробов. В отдельных случаях хроматограмма гноя может быть идентична картине, получаемой при ПФА чистой культуры выделенного организма. Однако обычно судить о видовой принадлежности возбудителя по хроматограмме патологического материала нельзя.
Отсутствие ЛЖК не всегда является абсолютно надежным признаком отсутствия анаэробных бактерий в очаге инфекции. Отдельные, относительно редко встречающиеся в клинических материалах анаэробные бактерии (B. ureolyticus, B. ruminicola, Peptococcus saccharolyticus и некоторые другие) ЛЖК не продуцируют. Поэтому окончательный вывод о наличии или отсутствии анаэробов следует делать с учетом данных бактериологического исследования.
Оценка результатов экспресс-диагностики.
Заключение о результатах экспресс-диагностики производится на основании комплексной оценки полученной информации. Так, обнаружение коротких грамотрицательных палочек с закругленными концами в сочетании с одновременным присутствием изомасляной или изовалериановой кислот свидетельствует о наличии бактероидов. В случае выявления грамотрицательных кокковидных палочек в материале, который давал ярко-красное свечение в ультрафиолетовом свете, и тот же спектр ЛЖК, можно однозначно заключить и о присутствии бактероидов группы B. melaninogenicus. Если в мазке обнаружены веретенообразные или длинные, тонкие, слабоокрашенные, беспорядочно расположенные палочки, часто подвижные (выявляется при просмотре в висячей капле), а при хроматографическом анализе выявлена масляная кислота без изокислот — вытекает вывод о присутствие фузобактерий. Указанные варианты результатов иллюстрируют случаи анаэробной моноинфекции. В практике подобные процессы чаще протекают с участием ассоциаций различных видов анаэробов. Поэтому этиологически достоверно указать все виды на этом этапе диагностики нельзя. Тем не менее, полученная с помощью экспресс-методов информация с высокой степенью надежности подтверждает сам факт анаэробной инфекции.
8. Приложение
1. Окраска по Граму в модификации Копелова.
-
раствор «А»: 2,5 г кристаллического фиолетового растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 3 — 4 недели);
-
раствор «Б»: 12,5 г натрия углекислого растворить в 250 мл дистиллированной воды (годен 2 недели до выпадения кристаллов);
-
раствор йода: 1 г едкого натра растворить в 7 мл дистиллированной воды, затем добавит 5 г кристаллического йода и 0,25 г йодистого калия, к полученному раствору добавить дробно 243 мл дистиллированной воды;
-
смывная жидкость для обесцвечивания: 75 мл ацетона добавить к 175 мл этилового спирта;
-
раствор сафранина: 5 г сафранина растворить в 15 — 20 мл этилового спирта и добавить до 250 мл дистиллированной воды.
Мазки фиксируют над пламенем горелки. На свободную от исследуемого материала часть стекла наносят 6 капель раствора «А» и одновременно раствора «Б». Смешивают стеклянной палочкой и равномерно распределяют по стеклу. Экспозиция — 2 мин.
Удаляют остатки краски и наносят раствор йода на 2 мин.
Удаляют остатки йода и наносят 10 — 20 капель смывной жидкости, повторяют манипуляцию до полного обесцвечивания, постоянно покачивая стекло.
Промывают водопроводной водой.
Промывают водой, просушивают и микроскопируют.
2. Добавки к средам для анаэробов.
Растворяют 1 г гемина в 10 мл 1М раствора едкого натра и доводят до объема 100 мл дистиллированной водой. Хранят при 4 °C.
Растворяют 0,2 г витамина K1 (или менадиона) в 20 мл 96% этилового спирта. Хранят в темном флаконе с притертой пробкой при 4 °C.
Растворяют 1 мл 1% раствора витамина K1 в 100 мл дистиллированной воды. Хранят при 4 °C в темном флаконе.
Растворяют 5 мг резазурина в 20 мл дистиллированной воды. Хранят в темном месте при комнатной температуре.
Рецепт 1. Анаэробный гемагар на основе эритрит-агара.
| Эритрит-агар | - 36,0 г |
|---|---|
| Крахмал растворимый | - 1,0 г |
| Аммоний сернокислый | - 0,4 г |
| Натрий углекислый кислый | - 1,0 г |
| Гемин (1% раствор) | - 1,0 мл |
| Твин-80 | - 1,0 мл |
| Вода дистиллированная | - 1000,0 мл |
Компоненты растворить при нагревании, установить pH 7,2, профильтровать через ватный тампон, разлить во флаконы, автоклавировать при 1 атм 20 минут. Перед употреблением среду растопить, охладить до 50 °C, добавить 5% лизированной двукратным замораживанием и оттаиванием цитратной крови донора и витамин K1 из расчета 0,1 мл 1% раствора на 100 мл среды, перемешать, разлить в чашки Петри. После застывания подсушить 10 — 15 мин.
Свежеразлитую (в течение 2 ч после приготовления) или прередуцированную, т.е. выдержанную в течение суток в анаэростате, среду используют для первичного выделения, субкультивирования, определения чувствительности к антибактериальным препаратам в диагностических дисках, редукции нитратов и гидролиза эскулина.
Рецепт 2. Анаэробный гемагар на основе сухой питательной среды для контроля стерильности.
Компоненты растворить при нагревании, довести pH до 7,2 и разлить во флаконы. Автоклавировать при 1 атм 20 минут.
Перед употреблением агар растопить, остудить до 50 °C, добавить 5% лизированной двукратным замораживанием и оттаиванием нитратной крови донора и 0,1 мл 1% раствора витамина K1 на 100 мл среды.
Среда может быть использована для первичного выделения и субкультивирования микробов.
Рецепт 3. Питательная среда для контроля стерильности.
33,0 г сухого порошка среды для контроля стерильности растворить в 1000,0 мл дистиллированной воды, довести до кипения, кипятить 2 — 3 мин., профильтровать. Если в составе среды отсутствует тиогликолят натрия, необходимо добавить 0,3 мл тиогликолевой кислоты. Разлить по пробиркам высоким столбиком (по 10 — 12 мл). Стерилизовать при 1 атм 15 — 20 минут. pH готовой среды 7,0 +/- 0,2.
Рецепт 4. Обогащенная питательная среда для контроля стерильности.
Компоненты растворить при нагревании, довести pH до 7,1 — 7,2 и разлить по пробиркам высоким столбиком (по 10 — 12 мл). Стерилизовать при 1 атм 15 — 20 минут.
Среда монет быть использована для выделения, субкультивирования и хранения анаэробов.
Рецепт 5. Обогащенная питательная среда для контроля стерильности с налидиксовой кислотой.
Налидиксовую кислоту (невиграмон) добавить в обогащенную питательную среду для контроля стерильности из расчета 30 кг/мл. Для этого 0,5 г невиграмона растворить в 45 мл стерильной дистиллированной воды с добавлением 5 мл 1М раствора едкого натра. Нагревание улучшает растворимость препарата. 3 мл полученного раствора добавить к 1 литру среды до стерилизации.
Среда может быть использована для выделения анаэробов из ассоциаций с колиформными бактериями.
Рецепт 6. Обогащенная питательная среда для контроля стерильности с канамицином и желчью.
Канамицин добавить в среду из расчета 1 мг/мл. Для этого 1 г канамицина растворить в 10 мл дистиллированной воды. Весь объем раствора канамицина и 20 г сухой желчи добавить к 1 л среды до стерилизации.
Среда может быть использована для селективного выделения бактероидов группы B. fragilis.
Рецепт 7. Обогащенная питательная среда для контроля стерильности с бромтимолблау.
1 мл 1%-ного раствора бромтимолблау добавить в 1 л среды. Разлить в пробирки по 10 — 12 мл. Автоклавировать при 1 атм 20 минут.
Среда может быть использована при ориентировочной идентификации для определения способности бактерий ферментировать глюкозу и продуцировать индол.
Рецепт 8. Пептонно-дрожжевой бульон.
| Кальций хлористый | - 0,2 г |
|---|---|
| Магний сернокислый | - 0,2 г |
| Калий фосфорнокислый однозамещенный | - 1,0 г |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный | - 1,0 г |
| Натрий углекислый кислый | - 10,0 г |
| Натрий хлористый | - 2,0 г |
Растворить хлористый кальций и сернокислый магний в 300 мл дистиллированной воды, добавить 500,0 мл воды и, слегка помешивая, внести оставшиеся соли. Добавить еще 200,0 мл воды. Смешать и хранить при 4 °C.
Суспендировать ингредиенты (за исключением цистеина, витамина K1 и гемина). Прокипятить до обесцвечивания резазурина и в токе бескислородного газа остудить до 45 °C. Добавить цистеин, гемин и витамин K1, довести pH до 7,0. Разлить в токе бескислородного газа и герметически завальцевать пенициллиновые флакончики или плотно закрыть пробирки резиновыми пробками. Автоклавировать при 1 атм 20 минут.
Среда используется для транспортировки патологического материала.
Рецепт 9. Пептонно-дрожжевой бульон с глюкозой (или другими углеводами).
Готовится аналогично пептонно-дрожжевому бульону с добавлением 1% глюкозы или другого углевода, предусмотренного схемой видовой идентификации.
Среда используется для биохимической идентификации анаэробов. Изменение кислотности в среде регистрируется pH-метрически.
Ингредиенты хорошо смешать, довести pH до 7,6. Кипятить до растворения компонентов, разлить во флаконы. Автоклавировать при 1 атм 15 минут. Осадить до 50 °C, добавить 20% взвеси желтка и разлить в чашки Петри.
Приготовление взвеси желтка: скорлупу яйца тщательно обработать 70% спиртом, вскрыть воздушный мешок, белок аккуратно вылить, — а желток суспендировать в 200 мл физиологического раствора.
Среда используется для определения лецитовителлазной и липазной активности анаэробных бактерий.
Смешать ингредиенты (за исключением цистеина, гемина, витамина K1), нагреть до растворения желатина, добавить гемин, витамин K1, цистеин, установить pH 7,1 — 7,2. Разлить в пробирки по 10 мл. Стерилизовать при 1 атм 15 минут.
Среда используется для определения протеолитической активности анаэробных бактерий.
4. Диагностические диски и полоски.
- Диски для ориентировочной идентификации анаэробных бактерий «Анаэродиски» разрабатываются ВНИИА и будут производиться ПО «Мосмедпрепараты».
При отсутствии «Анаэродисков» можно пользоваться дисками, изготовленными в лаборатории. Для этого на стандартные (6 мм) стерильные диски наносят по 0,01 мл водных растворов антибиотиков в следующих концентрациях: канамицина — 100000 мкг/мл, полимиксина B — 1000 мкг/мл, ристомицина — 500 мкг/л. Диски с метронидазолом (80 мкг для определения чувствительности методом элюции из диска) готовят аналогичным образом. Для приготовления основного раствора в <...> 8000 мкг/мл таблетку метронидазола 0,25 г растирают в ступке, постепенно добавляя 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО). К полученному раствору добавляют 25 мл воды. Диски высушивают в термостате и помещают во флакон с силикагелем. Хранят при 4 °C.
Содержание антибиотиков в диске: канамицина — 1000 мкг, полимиксина B — 10 мкг, ристомицина — 5 мкг.
2,0 сухой желчи растворить в 8,0 мл дистиллированной воды, проавтоклавировать при 1 атм 15 минут, пропитать стерильные диски теплым раствором и подсушить их. Диски хранить в холодильнике. Содержание желчи в диске (в пересчете на нативную) — 25 мг.
Диски с эскулином готовят путем пропитывания стандартных стерильных дисков 10% теплым раствором эскулина. Диски подсушивают и хранят в холодильнике.
Для определения сахаролитической активности анаэробных бактерий пригодны диски с углеводами из бумажной индикаторной системы (СИБ) для идентификации энтеробактерий, выпускаемой Горьковским НИИ эпидемиологии и микробиологии.
Диски с углеводами, которые отсутствуют с СИБ, готовят путем пропитывания стерильных стандартных дисков 10% раствором соответствующих углеводов. Диски подсушивают и хранят при 4 °C.
Для приготовления индикаторных бумажек готовят раствор:
| Парадиметиламинобензальдегид | - 5,0 г |
|---|---|
| Ортофосфорной кислоты | - 10,0 мл |
| Спирта этилового 96% | - 50,0 мл |
В теплом растворе смачивают фильтровальную бумагу, высушивают, нарезают полосками, хранят в темном месте. Цвет бумаги — желтый.
Стандартные стерильные диски пропитать профильтрованным раствором следующего состава:
| Калий азотнокислый | - 30,0 г |
|---|---|
| Натрий молибденовокислый двуводный | - 0,1 г |
| Вода дистиллированная | - 100,0 мл |
Диски подсушивают при комнатной температуре и хранят в холодильнике.
Раствор А: 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 20% уксусной кислоты.
Раствор Б: 0,2 г нафталамина растворяют в 150 мл 20% уксусной кислоты при слабом нагревании.
Раствор А: 1,0 г растворимого крахмала растворяют в 100 мл кипящей воды, остужают и добавляют 0,5 г йодистого калия.
Раствор Б: 10% раствор химически чистой серной кислоты.