Лабораторная диагностика хламидиозов. Методические рекомендации

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗОВ

(МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ)

ВВЕДЕНИЕ

Хламидиозы — разнообразные по патогенезу и клиническим проявлениям, распространенные заболевания человека и животных.

В последние десятилетия неуклонно возрастает роль в патологии человека, так называемых, антропонозных хламидиозов. Особенно большое значение приобретает урогенитальные хламидийные инфекции, которые относятся к числу наиболее распространенных заболеваний, передающихся половым путем. Они поражают мужчин и женщин, все чаще регистрируются у новорожденных, оказывают существенное влияние на репродуктивную функцию и часто являются причиной трубного бесплодия.

В связи с интенсификацией животноводства и птицеводства, созданием промышленных комплексов с высокой концентрацией животных, увеличивается потенциальная возможность возникновения крупных вспышек зоонозных хламидиозов, которые не только представляют серьезную угрозу для здоровья человека, но и наносят значительный экономический ущерб.

Следовательно, проблема хламидиозов приобретает все большее социально-экономическое и народнохозяйственное значение. Успешная организация борьбы с этими заболеваниями возможна лишь при условии их своевременного и полного выявления, а это, учитывая многообразие клинических форм, протекающих без патогномоничной симптоматики, представляет значительные трудности. В этой связи решающее значение в постановке диагноза приобретают методы лабораторной диагностики.

В настоящих Методических рекомендациях представлены основные методы лабораторной диагностики антропонозных и зоонозных хламидиозов с учетом возможности практической лабораторной службы.

1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛАМИДИЙ

Хламидии — грамотрицательные бактерии с облигатным внутриклеточным паразитизмом, характеризующиеся широким спектром естественных хозяев. Биологическое своеобразие хламидий, выражающееся в энергозависимом паразитизме и уникальном цикле развития, определяет самостоятельное положение этих микроорганизмов в системе прокариотов.

Хламидии выделены в отдельный порядок Chlamydiales, включающий одно семейство Chlamydiaceae содержащее один род Chlamydia, состоящий из 3 видов: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae.

Вид C. trachomatis — объединяет микроорганизмы, вызывающие заболевания, главным образом, у человека (антропонозные хламидиозы). Они обусловливают разнообразную патологию урогенитального тракта, глаз и связанную с ней хламидийную инфекцию иной локализации у мужчин, женщин и детей.

Вид C. psittaci — включает микроорганизмы, первично поражающие животных. У человека они могут вызывать зоонозные хламидиозы (орнитоз, генерализованные инфекции, связанные с сельскохозяйственными и домашними животными).

Вид C. pneumoniae — включает микроорганизмы, вызывающие респираторную патологию и передающиеся от человека к человеку <*>.

---

<*> Идентифицирован в 1989 г., недостаточно изучен.

Основными морфологическими формами хламидий являются элементарные и ретикулярные тельца. Элементарные тельца — инфекционная форма, мелкие ригидные сферические клетки с плотным нуклеоидом, диаметр 0,25 — 0,35 мкм. Окрашиваются по Романовскому-Гимзе в фиолетово-красный цвет.

Ретикулярные тельца — вегетативная неинфекционная форма, пластичные сферические клетки с рыхлым нуклеоидом, диаметр 0,6 — 1,5 мкм. Окрашиваются по Романовскому-Гимзе в синий цвет.

Хламидии культивируют в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов, в первичных или перевиваемых культурах клеток; некоторые штаммы хламидий — в организме белых мышей, чаще при заражении в мозг. На искусственных питательных средах хламидии не размножаются. Их паразитизм обусловлен выраженной метаболитической зависимостью от клетки хозяина.

Цикл развития хламидий протекает в клетке-хозяине в «цитоплазматическом включении», представляющем собой микроколонию микроорганизма. В процессе цикла развития происходит преобразование элементарных телец в ретикулярные. Последние размножаются бинарным делением и преобразуются через переходные формы в элементарные тельца нового поколения микроорганизмов. Цитоплазматические включения и морфологические структуры хламидий выявляются при световой, люминесцентной и фазовоконтрастной микроскопии.

Хламидии имеют сложную антигенную структуру. Выделяют три основных антигенных комплекса. Родоспецифический термостабильный, липополисахаридный комплекс, характерный для всех представителей рода. Его детерминантной группой является кислый полисахарид. Родоспецифический антигенный комплекс локализуется в клеточной стенке хламидий. Видоспецифические и типоспецифические термолабильные белковые фракции. Видоспецифический антиген определяет принадлежность штаммов к соответствующему виду. Типоспецифические антигены позволяют дифференцировать различные серовары (серотипы) хламидий внутри вида.

Хламидии чувствительны к антибиотикам тетрациклинового ряда, макролидам, рифампицину (рифадину), являющимися основными средствами этиотерапии хламидиозов. Пенициллин и его производные вызывают образование Л-подобных форм микроорганизмов, способных реверсировать в инфекционные.

Хламидии быстро инактивируются под действием высокой температуры: при 60 °C — в течение 15 мин., при 80 °C — через 10 мин., при кипячении — через 3 мин. Материал, содержащий штаммы C. psittaci, может быть обеззаражен в течение 3 часов при комнатной температуре: фенолом (1% р-р), хлорамином (3% р-р), лизолом (3% р-р), марганцевокислым калием (1:500), формалином с содержанием 38 — 40% формальдегида.

«Урогенитальные штаммы» хламидий, C. trachomatis, высокочувствительны к 70° этанолу, растворам — 2% лизола, 0,05% серебра нитрата, 0,1% калия йодида, 0,5% калия перманганата, 25% перекиси водорода и инактивируются при комнатной температуре в течение 2 сут. Хлорамин в 3% концентрации инактивирует в течение 1 мин.

2. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ

2.1. Методы лабораторной диагностики урогенитальных хламидиозов и связанных с ними заболеваний иной локализации.

Для диагностики этих инфекций используют бактериоскопический, бактериологический и серологические методы исследования. Техника лабораторных исследований приведена в Приложении I.

2.1.1 Бактериоскопический метод.

Бактериоскопическое исследование предполагает выявление хламидий, их морфологических структур и антигенов в пораженных клетках (клиническом материале).

Материалом для исследования служат соскобные препараты с доступных исследованию слизистых оболочек мочеполовых (уретра, шейка матки и т.п.) и других органов (конъюнктива, прямая кишка и пр.) при экстрагенитальных формах. Из исследуемого материала готовят мазки, которые окрашивают по Романовскому-Гимзе. Цитоплазматические включения хламидий (тельца Гальберштедтера-Провачека) содержат или крупные ретикулярные тельца, или мелкие элементарные тельца. Они по цвету и внутренней структуре отличаются от ядра клетки и цитоплазмы. Для постановки диагноза хламидийной инфекции достаточно обнаружить одно типичное цитоплазматическое включение. Метод характеризуется сравнительно низкой чувствительностью, позволяет диагностировать от 10 — 20% случаев урогенитальной инфекции. При хламидийной патологии глаз чувствительность способа составляет 90 — 100%.

Применение люминесцирующих поликлональных и моноклональных антител для выявления антигенов хламидий в цитоплазматических включениях в соскобных препаратах урогенитального тракта значительно увеличивает чувствительность и специфичность метода. С этой целью можно использовать как прямой, так и непрямой иммунофлуоресцентный метод. Первый предполагает обработку препарата непосредственно специфическими люминесцирующими моно- или поликлональными антителами, второй — иммунной и антивидовой флуоресцирующей сыворотками. При люминесцентной микроскопии антигены хламидий выявляют на красном или оранжевом фоне (при контрастировании синькой Эванса или родамином) цитоплазмы эпителиальных клеток в виде внутриклеточных включений ярко-зеленого цвета.

Метод отличается высокой информативностью и уступает по чувствительности только бактериологическому (выделение хламидий в клеточных культурах).

2.1.2 Бактериологический метод.

Бактериологический метод основан на выделении хламидий из исследуемого материала путем заражения куриных эмбрионов или клеточных культур с последующей идентификацией возбудителя. Исследуемый материал тот же, что и при бактериоскопическом методе. Для удаления сопутствующей бактериальной флоры клинический материал помещается в специальные транспортные среды, содержащие антибиотики, не влияющие на жизнеспособность хламидий. Способ может быть использован в течение всего периода заболевания. Особенно эффективен при острых формах, на ранних этапах инфекции до начала антибиотикотерапии.

2.1.2.1 Выделение хламидий на куриных эмбрионах.

Исследуемым материалом заражают 6 — 8-дневные куриные эмбрионы в полость желточного мешка. Наличие возбудителя определяют микроскопией мазков — отпечатков тканей оболочек желточного мешка, окрашенных по Маккиавелло, а также специфическими люминесцирующими поли- и моноклональными антителами.

2.1.2.2 Выделение хламидий в культурах клеток.

Выделение хламидий в культуре клеток проводят в 24-часовом монослое культуры клеток (L-929, McCoy, Hela), предварительно обработанном ДЕАЕ-декстраном (30 мкг/мл) в течение 30 мин. При инокуляции исследуемого материала на монослой применяют метод принудительной адсорбции — центрифугирование при 3000 об./мин. в течение часа. После центрифугирования неадсорбированный материал удаляют при промывании средой 199 без сыворотки и дальнейшее культивирование в течение 48 — 72 часов проводят при t = 36 °C в среде 199 с 5% фетальной сыворотки, 5% 0,5 М раствора глюкозы и 0,5 — 1,0 мкг/мл циклогексимида.

Оценку результатов проводят через 48 — 72 ч методами ПИФ (при использовании специфических люминесцирующих поли- и моноклональных антител), МГГ (при окраске Май-Грюнвальд-Гимза), Люголя (окраска раствором Люголя).

При исследовании препаратов инфицированных культур клеток хламидии выявляются в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Выявление хотя бы одного цитоплазматического включения, имеющего специфическое окрашивание, форму и структуру достаточно для определения хламидийной инфекции в исследуемом объекте. По специфичности метод диагностического выделения хламидий в культуре клеток является эталонным.

2.1.3 Серологические методы диагностики.

Методы серологической диагностики основаны на выявлении специфических антител в сыворотке крови, а также в секретах больных и переболевших. Для серодиагностики обычно используют реакцию связывания комплемента (РСК), непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА). Учитывая низкую иммуногенность «урогенитальных штаммов» хламидий при локализованных формах инфекции, возможность наличия антител, связанных с ранее перенесенной хламидийной инфекцией, необходимо исследовать несколько проб сыворотки в динамике заболевания с интервалом в 2 — 3 недели. Первую пробу забирают в момент обращения больного к врачу. Интерпретацию результатов серологического обследования следует проводить в совокупности с анализом клинико-эпидемиологических данных, а также с учетом особенностей использованного серологического теста. Оптимальным является параллельное применение нескольких серологических реакций. Эти серологические тесты могут быть также использованы для проведения эпиднадзора за хламидиозами.

РСК — выполняется с коммерческим диагностикумом, который выпускается Одесским предприятием по производству бактерийных препаратов Минмедпрома СССР. В РНГА и РНИФ — более эффективных серологических тестах, разработанных и успешно апробированных в последние годы, используются экспериментальные серии соответствующих препаратов, подготовленных к промышленному выпуску. Техника постановки этих реакций приведена в Приложении II.

2.1.3.1 Реакция связывания комплемента.

РСК проводят с родоспецифическим антигеном возбудителя орнитоза. Эту реакцию используют для диагностики так называемых «генерализованных» (осложненных) форы урогенитальных хламидиозов, венерической лимфогранулемы и ряда экстрагенитальных хламидийных поражений (болезнь Рейтера, пневмония новорожденных). При локализованных поражениях (уретрит, цервицит и т.п.) РСК недостаточно чувствительна.

2.2. Методы лабораторной диагностики орнитоза и других зоонозных хламидиозов <*> у людей.

---

<*> Поскольку методы диагностики орнитоза и других зоонозных хламидиозов аналогичны, то в последующем изложении материала использован только один термин — орнитоз.

Для диагностики орнитоза у людей и птиц используют бактериологический, серологический и кожно-аллергический методы исследования. Техника лабораторных исследований и постановки полной аллергической пробы приведены в Приложении I.

2.2.1 Бактериологическое исследование.

Возбудитель орнитоза по патогенности для человека относится к микроорганизмам II группы («Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения» утверждено МЗ СССР 18.05.1979), поэтому выделение возбудителей может проводиться только в лабораториях медицинского и ветеринарного профиля, имеющих разрешение режимной комиссии на работу с возбудителями второй группы патогенности со строгим соблюдением соответствующих режимных условий («Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I — II группы патогенности» утверждена МЗ СССР 29.06.1978).

Для выделения возбудителя орнитоза от больных в качестве исследуемого материала используют кровь или мокроту. Изоляция возбудителя возможна из крови на протяжении первых 7 — 10 дней, из мокроты — 14 — 20 дней заболевания. Применение антибиотиков широкого спектра действия для лечения больных значительно снижает возможность выделения возбудителя орнитоза. При исследовании секционного материала чаще используют кусочки печени, легкого.

Патологический материал, полученный от людей, используют для заражения мышей чаще в мозг или внутрибрюшинно и развивающихся куриных эмбрионов — в желточный мешок. Наличие возбудителя контролируют микроскопией мазков-отпечатков мозговой ткани (или внутренних органов) зараженных мышей и оболочек желточных мешков зараженных куриных эмбрионов, окрашенных различными способами: по Романовскому-Гимзе, Маккиавелло, акридином оранжевым или специфическими люминесцирующими поли- или моноклональными антителами.

Тот же патологический материал можно использовать для выделения возбудителя орнитоза в монослойных культурах различных клеток (фибробласты куриных эмбрионов, клетки L-929, Hela-229, Hep-2 и другие).

В этом случае первичными критериями диагностического выделения хламидий является обнаружение типичных для этих микроорганизмов морфологических и тинкториальных характеристик, а также содержание родоспецифического хламидийного антигена, определяемого в реакции иммунофлуоресценции.

2.2.2 Серологические методы исследования.

Серологические методы являются основными средствами практической диагностики орнитоза. Они могут применяться без ограничений в различных лабораториях медицинского профиля.

Традиционно используют реакцию связывания комплемента (РСК), диагностические препараты для которой (антиген специфический, контрольный и диагностическую сыворотку) выпускает Одесское предприятие по производству бактерийных препаратов Минмедпрома СССР.

В последние годы разработаны, успешно апробированы и другие, более информативные тесты (реакция непрямой гемагглютинации — РНГА, реакция непрямой иммунофлуоресценции — РНИФ, иммунофлуоресцентная реакция микроагглютинации — ИФРМА, иммуноферментный метод — ИФА), в них используются экспериментальные серии препаратов. Техника постановки этих реакций приведена в Приложении II.

Для серологической диагностики орнитоза у людей наиболее широко применяют РСК, РНГА и РНИФ.

В целях дифференциации серологических показателей текущей орнитозной инфекции от анамнестических реакций и естественной иммунизации, серологическое обследование на орнитоз необходимо проводить неоднократно, с интервалом 10 — 14 дней. Наиболее информативным является использование комплекса серологических реакций. Бесспорным основанием для постановки диагноза орнитоза у больных является обнаружение сероконверсии — 4-кратное повышение титра хламидийных антител. Вместе с тем более низкие показатели титра антител во 2 или 3 пробе сыворотки могут быть следствием косвенного влияния интенсивной антибиотикотерапии. В этих случаях достоверное увеличение титра антител в 2 — 3 раза может оцениваться в качестве диагностического показателя.

Положительные результаты серологических реакций без сероконверсий оценивают с учетом особенностей каждого конкретного случая, во взаимосвязи с клиническими показателями и эпидемической ситуацией.

2.2.2.1 Реакция связывания комплемента (РСК).

РСК ставят с родоспецифическим антигеном возбудителя орнитоза (выпускается Одесским предприятием по производству бактерийных препаратов Минмедпрома СССР).

Комплементсвязывающие антитела определяют у больных людей к 10 — 15 дню болезни, обычно в невысоком титре (1:16). Нарастание титра антител наблюдают в течение 4 — 6 недель и их снижение — через 3 — 6 месяцев. Антитела нередко выявляют в крови переболевших 1 — 2 года, а иногда и более длительный срок.

При однократном обследовании или при отсутствии нарастания уровня антител в динамике показатель их титра 1:64 может оцениваться диагностическим при наличии соответствующих клинико-эпидемиологических данных. Определение в этих условиях меньших титров антител требует индивидуального анализа и может быть использовано для подтверждения клинико-эпидемиологического диагноза. При обследовании «профессионально угрожаемых» коллективов комплементсвязывающие антитела могут обнаруживаться и в сыворотках клинически здоровых людей. Их выявление на фоне благополучной эпидситуации, при отсутствии клинически выраженных случаев орнитоза, может быть связано с ранее перенесенным орнитозом, с естественной иммунизацией за счет постоянного контакта с микродозами возбудителя (прямая зависимость от стажа работы обследуемых на предприятии), а также с другими хламидийными инфекциями.

2.2.3 Кожно-аллергический метод.

Для диагностики орнитоза у людей может быть использована кожно-аллергическая проба с орнитозным аллергеном (выпускается Одесским предприятием по производству бактерийных препаратов Минмедпрома СССР). Внутрикожная проба с орнитозным аллергеном становится положительной с первых дней заболеваний у 87 — 95% больных, сохраняясь до года и более. Она является чувствительным индикатором эпидемиологического неблагополучия в коллективах, профессионально связанных с птицей. С увеличением стажа работы повышается вероятность обнаружения сенсибилизации к орнитозному аллергену и процент положительных находок по внутрикожной пробе возрастает. Положительные реакции могут определяться у здоровых лиц, профессионально связанных с птицами, что можно объяснить перенесенным в прошлом заболеванием, латентной формой инфекции, естественной иммунизацией.

Специфичность внутрикожной пробы на введение орнитозного аллергена на одной руке подтверждается отсутствием реакции на введение контрольного субстрата на другой.

Учитывая высокий уровень аллергизации населения и возможность развития неспецифических реакций, оценку результатов кожной пробы у людей проводят при комплексном учете данных других диагностических тестов и клинико-эпидемиологических показателей.

1. ДИАГНОСТИКА УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ХЛАМИДИОЗОВ И СВЯЗАННЫХ С НИМИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ИНОЙ ЭТИОЛОГИИ

1.1 Меры предосторожности.

Сбор и обработку клинического материала для выявления или выделения C. trachomatis проводят, соблюдая режим работы бактериологических лабораторий. Необходимо исключить возможность загрязнения исследуемым материалом рук лабораторных работников, его попадание в глаза, нос, рот.

1.2 Сбор и транспортировка материала.

1.2.1 Материал для бактериоскопического исследования.

Соскобы со слизистых оболочек мочеиспускательного канала и шейки матки берут ложкой Фолькмана, соблюдая правила асептики. Наружные половые органы дезинфицируют, выделения удаляют тампоном. Соскобы делают из глубины канала, со всех четырех квадрантов. Соскобы шейки матки берут после удаления слизистой пробки из глубины и влагалищной части. В материале должно быть минимальное количество выделений, примеси крови. При экстрагенитальных поражениях соскобный материал получают аналогичным способом.

Взятый материал распределяют тонким слоем на поверхности обезжиренного предметного стекла, подсушивают и фиксируют. Для окраски по методу Романовского-Гимзы фиксируют смесью Никифорова (эфир + спирт, 1:1) в течение 10 мин., для окраски флуоресцирующими поли- или моноклональными антителами — холодным ацетоном (х.ч.) в течение 10 мин.

1.2.2 Материал для бактериологического исследования.

Аналогичным образом берут тот же соскобный материал, что и для бактериоскопического исследования. Его тщательно ресуспендируют в 1 мл (при выделении хламидий в культуре клеток) или в 2 — 3 мл (при выделении в куриных эмбрионах) охлажденной стерильной транспортной среде с бусами, пересылают в лабораторию при температуре +4 °C. После трехчасовой инкубации (при 4 °C) исследуемого материала с антибиотиками проводят заражение. В качестве транспортной среды используют 199 среду с 10% фетальной сывороткой крупного рогатого скота. В состав транспортной среды вводят антибиотики: стрептомицин (100 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл) и гентамицин (50 мкг/мл) для подавления сопутствующей флоры.

1.2.3 Материал для проведения серологического обследования.

Антитела выявляют в сыворотке крови и секретах. Кровь берут из вены в количестве 5 мл в стерильную пробирку. Сыворотку собирают после ретракции сгустка до наступления гемолиза, транспортируют в охлажденном состоянии (+4 °C), после ампулирования замораживают (-20 °C). Для исследования необходимо брать 2 — 3 пробы с интервалом в 10 — 14 дней, первую пробу — в начале заболевания.

Секреты половых желез собирают либо в нативном виде, либо с помощью полосок фильтровальной бумаги (5 x 20 мм). Капли секрета или полоски бумаги после насыщения помещают в отдельные сосуды, содержащие 0,2 мл фосфатного буферного раствора pH — 7,2. Материал транспортируют и сохраняют так же, как сыворотки. Первичное разведение учитывают при последующем титровании.

1.3. Окраска соскобных препаратов для бактериоскопического исследования.

1.3.1 Окраска по методу Романовского-Гимзы.

На исследуемый препарат наносят 2 — 3 капли неразведенной краски и оставляют на 5 минут. Затем добавляют дистиллированную воду из расчета 10 капель на 1 каплю краски. Через 30 минут промывают водой и дифференцируют в подкисленном 96° этаноле (1 — 2 капли ледяной уксусной к-ты на 10 мл этанола) 1 — 3 сек. до голубой окраски препарата.

1.3.2 Окраска препаратов люминесцирующими хламидийными антителами.

1.3.2.1 Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ).

ПИФ — метод, при наличии люминесцирующих хламидийных поли- или моноклональных антител, используют для обнаружения антигенов хламидий в исследуемом материале.

Высушенные на воздухе препараты фиксируют охлажденным (+4 °C) х.ч. ацетоном или этиловым спиртом (96°) 10 мин.;

• на препарат наносят 25 — 50 мкл люминесцирующих хламидийных поликлональных или моноклональных антител в рабочем разведении, в смеси с контрастирующим реагентом (бычий альбумин, меченный родамином в рабочем разведении, или синька Эванса в конечном разведении 1:10000);
• помещают во влажную камеру при температуре +37 °C на 20 — 30 минут;
  • промывают 2 раза по 5 минут фосфатно-солевым буферным раствором

(ФСБР): 6,8 г NaCl; 0,63 г KH PO  и 1,48 г Na HPO  на 1 л H O; pH - 7,2;
                             2  4            2   4         2

-  <a id="p100096"></a>наносят  забуференный  глицерин (9 частей глицерина + 1 часть 0,01 М

раствора  Na HPO ,  pH  -  8,5)  и монтируют препарат, накладывая покровное
            2   4

стекло;

• удаляют избыток глицерина фильтровальной бумагой и исследуют препарат в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров (для ЛМ-2) ФС 1-2, БС 8-2, СЭС-7-2, ЖС-18 и масляной иммерсии при увеличении 600 — 1000х.

При исследовании в микроскопе клинических препаратов хламидии выявляются в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в ярко-зеленый цвет, либо в виде отдельных ярко-зеленых элементарных и ретикулярных телец, четко выделяющихся на красном (синька Эванса) или оранжевом (родамин) фоне контрастно окрашенных эпителиальных клеток, или на темном фоне препарата.

1.3.2.2 Метод непрямой иммунофлуоресценции (НИФ).

НИФ-метод может быть использован с той же целью (1.3.2.1) при отсутствии люминесцирующих хламидийных поли- или моноклональных антител и наличии сыворотки (человека, животных), или м-АТ к родоспецифическому антигену хламидий. Антивидовые сыворотки (против глобулинов человека, животных), меченные ФИТЦ, выпускаются производственным предприятием НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР;

• на препарат после фиксации наносят 25 — 30 мкл сыворотки, содержащей хламидийные антитела;
• помещают во влажную камеру на 30 минут при +37 °C;
• промывают в ФСБР 2 раза по 5 минут;
• наносят люминесцирующую антивидовую сыворотку с контрастирующим реагентом (см. 1.3.2.1);
• помещают во влажную камеру на 30 минут при +37 °C;
• промывают в ФСБР 2 раза по 5 минут и монтируют аналогично указанному для прямого метода (см. 1.3.2.1).

Для контроля специфичности свечения антигена (антигенов) хламидий, обнаруживаемого ПИФ и НИФ-методами, в тех же условиях исследуют материал, заведомо не содержащий микроорганизмы, а также проводят замену иммунной хламидийной сыворотки на неиммунную. Специфическое свечение в обоих случаях должно отсутствовать.

1.4 Бактериологическое исследование.

1.4.1 Выделение хламидий заражением куриных эмбрионов.

Исследуемый материал вводят по 0,25 — 0,5 мл в желточный мешок 6 — 7 суточных развивающихся куриных эмбрионов, которые инкубируют при +35 — 36 °C. Обычно заражают 8 — 10 эмбрионов на 1 исследуемую пробу. При отсутствии специфической гибели эмбрионов спустя 4 — 10 суток после заражения, под контролем бактериоскопии проводят до 3 слепых пассажей.

1.4.1.1 Идентификация возбудителя.

Первичную идентификацию хламидий проводят на основании обнаружения типичных цитоплазматических включений, содержащих элементарные, ретикулярные тельца, и выявлении в их составе родоспецифического антигена. Для этого готовят мазки-отпечатки из желточных мешков куриных эмбрионов, которые окрашивают по Маккиавелло, а также люминесцирующими антителами (прямой и непрямой метод флуоресцирующих антител).

Обнаружение типичных цитоплазматических включений и родоспецифического хламидийного антигена являются основными критериями диагностического выделения возбудителя.

Для окраски мазков-отпечатков желточных мазков по методу Маккиавелло необходимы следующие реагенты: 0,25% раствор основного фуксина (0,25 г краски растворяют в 100 мл ФБР или бидистиллированной воды); 0,5% раствор лимонной кислоты (0,5 г лимонной кислоты растворяют в 200 мл бидистиллированной воды, свежеприготовленной); 1% раствор метиленового синего (1 г красителя растворяют в 100 мл бидистиллированной воды).

Подсушенные на воздухе предметные стекла с мазками-отпечатками фиксируют над пламенем горелки. Затем на них наносят отфильтрованный через бумажный фильтр раствор фуксина на 5 минут. Препарат слегка и равномерно нагревают над пламенем горелки. Краситель смывают проточной водой. Затем препарат быстро дифференцируют раствором лимонной кислоты (несколько секунд), вновь промывают проточной водой, докрашивают раствором метиленового синего (10 — 15 сек.), промывают, подсушивают фильтровальной бумагой и просматривают в световом микроскопе при масляной иммерсии (об. x 90, ок. x 7). Морфологические структуры хламидий в виде мелких красных округлых образований (элементарные тельца) и крупных синих (ретикулярные тельца) четко выявляются на голубом фоне препарата. Индикацию родоспецифического антигена хламидий проводят прямым (см. 1.3.2.1) и непрямым (см. 1.3.2.2) методами флуоресцирующих антител.

1.4.2 Выделение хламидий заражением культур клеток.

Монослой клеток L-929, выросший на покровном стекле в плоскодонной пробирке, покрывают 1 мл рабочего раствора М.В. 500000 ДЕАЕ-декстрана (30 мкг/мл), удаляемого после 30 мин. контакта с клетками при комнатной температуре <*>. Исследуемый клинический материал встряхивают и вносят по 0,2 мл в 4 — 6 плоскодонных пробирок, наслаивая на монослой клеток. Пробирки затем центрифугируют на горизонтальном роторе (2400 1 час, при +30 °C). Инокулят удаляют, 2 раза отмывают средой 199 и вносят 1 мл питательной среды (среда 199 с добавлением циклогексимида в концентрации 0,6 мкг/мл, 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и 5% 0,5 М раствора глюкозы). Культуру клеток инкубируют при температуре +35 — 36 °C до 72 часов.

---

<*> Можно использовать и другие клеточные культуры (McCoy, Hela-229), а также обрабатывать клеточный монослой после заражения антиметаболитами (см. соответствующие руководства).

Критерием диагностического выделения хламидий служит выявление в зараженных клетках типичных цитоплазматических включений при окраске по Май-Грюнвальду-Гимзе, а также родоспецифического антигена хламидий при окраске флуоресцирующими поли- и моноклональными антителами.

Оценку результатов первичного заражения клеток проводят обычно через 48 — 66 — 72 час. Покровные стекла из двух пробирок извлекают, споласкивают ФСБР (см. 1.3.2.1), подсушивают на воздухе и фиксируют соответственно по следующему методу окраски: Май-Грюнвальду-Гимзе (см. 1.3.1) или флуоресцирующими поли- и моноклональными антителами, ПИФ (см. 1.3.2.1), НИФ-методами (см. 1.3.2.2).

При отсутствии цитоплазматических включений в монослое первично зараженных клеток можно провести 1 — 2 слепых пассажа.

1.5 Серологические методы исследования.

1.5.1 Реакция связывания комплемента (РСК).

Принцип РСК основан на взаимодействии в 1 фазе реакции антигена с гомологичными антителами в присутствии комплемента. С помощью 2-ой индикаторной фазы реакции, за счет добавления гемолитической системы определяется связывание комплемента образовавшимся комплексом антиген-антитело. Отсутствие гемолиза свидетельствует о положительной РСК. Реакцию ставят в лунках полистироловых панелей или в стандартных серологических пробирках.

1.5.1.1 Ингредиенты реакции

• специфический и контрольный диагностикумы (антигены);
• исследуемая и иммунная хламидийная сыворотка;
• комплемент;
• гемолитическая сыворотка;
• эритроциты барана;
• физиологический раствор — pH 7,0 (8,5 г химически чистого NaCl на 1 л бидистиллированной воды).

1.5.1.2 Подготовка ингредиентов для постановки РСК.

1.5.1.2.1 Диагностикумы <*>.

---

<*> Производство Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов.

1.5.1.2.1.1 Специфический диагностикум.

Используют коммерческий препарат. Готовят его рабочее разведение на физиологическом растворе pH 7,0 согласно рекомендации изготовителя (рабочее разведение препарата указано на этикетке ампулы).

1.5.1.2.1.2 Контрольный диагностикум.

Используют коммерческий препарат. Готовят рабочее разведение на физиологическом растворе pH 7,0 согласно рекомендации изготовителя.

1.5.1.2.2 Исследуемая сыворотка.

Непосредственно перед постановкой реакции исследуемую сыворотку крови в разведении 1:4 инактивируют в течение 30 минут при температуре +56 °C.

1.5.1.2.2 Иммунная сыворотка.

Используют коммерческую сыворотку из комплекта диагностикума или любую хламидийную иммунную сыворотку с титром антител по РСК 1:64 и выше. Непосредственно перед постановкой реакции иммунную сыворотку разводят физиологическим раствором pH 7,0 1:8 и инактивируют в течение 30 минут при температуре +56 °C.

1.5.1.2.3 Комплемент.

В качестве комплемента используют свежую сыворотку морской свинки или коммерческий препарат (сухой). Готовят разведение комплемента 1:10 на физиологическом растворе pH 7,0.

1.5.1.2.4 Гемолитическая сыворотка.

Представляет собой сыворотку кролика, иммунизированного эритроцитами барана. Используют коммерческий препарат в тройном титре (3 минимальные гемолитические дозы). Титр гемолитической сыворотки указан на этикетке ампулы. Например, если титр гемолитической сыворотки 1:3000, то в реакции используют сыворотку в разведении 1:1000.

1.5.1.2.5. 3% взвесь эритроцитов барана.

Дефибринированную кровь барана центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 15 минут для осаждения эритроцитов. Полученный осадок эритроцитов 3-кратно отмывают физиологическим раствором pH 7,0 при центрифугировании в тех же условиях. Затем осадок эритроцитов ресуспендируют в физиологическом растворе pH 7,0 до 3% концентрации.

1.5.1.3. Методика постановки РСК (макрометод) (в соответствии с наставлением по применению хламидийного антигена).

1.5.1.3.1 Определение рабочей дозы комплемента.

Определение рабочей дозы комплемента предшествует постановке основного опыта. Ее определяют титрованием комплемента per se и в присутствии антигена.

В два параллельных горизонтальных ряда лунок полистироловой панели микропипеткой вносят возрастающие дозы комплемента (исходного разведения 1:10) с интервалом в 0,01 мл. Например, 0,01 — 0,02 — 0,03 мл и т.д. до 0,1 мл. Объем жидкости в лунках доводят до 0,1 мл физиологическим раствором pH 7,0. Затем в каждую лунку верхнего ряда вносят по 0,1 мл специфического антигена, взятого в рабочей дозе и по 0,1 мл физиологического раствора, в лунки второго горизонтального ряда — по 0,2 мл физиологического раствора (2-ой ряд титрование комплемента per se). После этого во все лунки добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно выдержанной в термостате при +37 °C в течение 30 минут. Гемолитическая система состоит из смеси равных объемов 3% взвеси эритроцитов барана и трех минимальных гемолизирующих доз гемолитической сыворотки. После встряхивания панели ставят в термостат при 37 °C на 30 мин., а затем учитывают результаты реакции по степени выраженности гемолиза.

За 1 полную единицу комплемента принимают количество комплемента во второй пробирке с полным гемолизом. Если связывание комплемента проводят на холоде (при +4 °C), то в качестве рабочей дозы берут одну полную единицу комплемента.

Количество комплемента, разведенного 1:10	0,01	0,02	0,03	0,04	0,05	0,06	0,07	0,08	0,09	0,1
Результат	++++	+++	-	-	-	-	-	-	-	-

(«++++» — полная задержка гемолиза; «-» — полный гемолиз).

В данном примере одна полная единица комплемента — 0,04 мл, две полные единицы комплемента — 0,08 мл. Следует учитывать, что расчет рабочей дозы комплемента (соответственно, 1-ой или 2-х полных единиц) необходимо проводить исходя из результатов титрования в присутствии антигена. В том случае, если при титровании комплемента per se и в присутствии антигена получены однозначные результаты, при последующих постановках РСК с этой серией диагностикума можно ограничиться титрованием комплемента.

1.5.1.3.2 Постановка основного опыта РСК.

В горизонтальном ряду лунок полистироловой панели готовят последовательные разведения (два ряда) исследуемой сыворотки в объеме 0,1 мл, начиная с разведения 1:4. К каждому разведению первого ряда добавляют по 0,1 мл специфического диагностикума и 0,1 мл комплемента, взятых в рабочей дозе; к разведениям второго ряда — по 0,1 мл комплемента и 0,1 мл контрольного диагностикума, также в рабочем разведении.

Аналогичным образом готовят разведения гомологичной иммунной сыворотки (3 и 4 ряд).

Панели тщательно встряхивают и оставляют при +4 °C на 16 — 18 часов. После чего реакцию выдерживают 1 час при комнатной температуре, а затем в каждую лунку добавляют по 0,2 мл гемолитической системы, предварительно инкубированной при +37 °C в течение 30 минут. После тщательного встряхивания панели ставят в термостат при +37 °C до завершения гемолиза в контролях. Затем панели вынимают из термостата и через час проводят окончательный учет реакции (по системе «4+»). Реакция считается положительной при наличии задержки гемолиза не менее чем на 3+. Основной опыт можно также ставить при +37 °C в течение 1 часа 40 минут — до добавления гемолитической системы 1 час, после добавления — 40 минут. При этой модификации может наблюдаться снижение чувствительности реакции.

Постановка основного опыта должна сопровождаться следующими контролями:

1. Контроль исследуемой сыворотки на антикомплементарность в разведениях 1:4 — 1:64 — 0,1 мл сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента в рабочей дозе, взятой в опыт.

2. Контроль орнитозного диагностикума — 0,1 мл разведения специфического диагностикума, взятого в опыт, + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

3. Контроль контрольного диагностикума — 0,1 мл разведения, взятого в опыт, + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

4. Контроль орнитозной иммунной сыворотки в разведениях 1:4 — 1:64 — 0,1 мл соответствующего разведения сыворотки + 0,1 мл физиологического раствора + 0,1 мл комплемента.

5. Контроль комплемента — 0,1 мл комплемента, содержащего соответственно 0,5, 1 и 2 дозы комплемента, + 0,2 мл физиологического раствора.

6. Контроль гемолитической системы — 0,3 мл физиологического раствора + 0,2 мл гемолитической системы.

Добавление гемолитической системы и прочие условия для контролей должны быть равнозначны опытным рядам.

Контроли 1, 2, 3, 4, 5 (1 и 2 дозы) должны быть отрицательны — полный гемолиз. В контроле 6 должна быть задержка гемолиза на 4+, контроль 5 — 0,5 дозы — задержка гемолиза на 2+.

Контрольный диагностикум не должен реагировать с исследуемой сывороткой, орнитозный (специфический) диагностикум в присутствии гомологичной сыворотки должен вызывать задержку гемолиза не менее чем на 3+.

За титр испытуемой сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, которое в присутствии специфического диагностикума обусловливает задержку гемолиза на менее чем на 3+.

1.5.1.3.3 Микровариант постановки РСК.

При проведении микроварианта РСК при постановке основного опыта все ингредиенты используют в реакции в объеме 0,025 мл.

2. ДИАГНОСТИКА ОРНИТОЗА

2.1 Меры предосторожности.

Сбор и обработку материала для выявления возбудителя орнитоза проводят при соблюдении режима работы с возбудителями особо опасных инфекций. Работающий должен быть одет в спецодежду. (Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I — II группы (Утв. МЗ СССР 29.06.1978)).

2.2 Сбор и транспортировка материала.

2.2.1 Материал для выделения возбудителя орнитоза.

Для выделения хламидий берут кровь, мокроту (желательно до антибиотикотерапии), а в случае секции — кусочки органов (печень, легкое, селезенка), плевральный экссудат.

Кровь берут из вены (не менее 5 мл) в первые 7 — 10 дней заболевания в стерильные флаконы с бусами, дефибринируют и в том же флаконе пересылают в лабораторию.

Мокроту берут до 14 дня заболевания в стерильную посуду, утром. При скудном отделяемом назначают отхаркивающие или делают смыв из зева стерильной дистиллированной водой.

Асептически собранный секционный материал помещают в стерильную посуду, плотно закрывают притертыми или резиновыми пробками.

Пересылку материала в лабораторию проводят в специальных опечатанных металлических пеналах (контейнерах). Если транспортировка будет продолжаться более 1 часа, необходимо обеспечить охлаждение материала. В пеналы следует вложить углекислоту или поместить их в термосы со льдом. Оптимальным является хранение и пересылка материала в сосудах Дюара с жидким азотом.

2.2.2 Материал для серологического обследования.

Исследуемым материалом служит сыворотка крови. Взятие и транспортировка материала — см. 1.2.3.

2.3 Выделение хламидий.

2.3.1 Обработка исследуемого материала.

Дефибринированную кровь для выделения возбудителя обычно используют без дополнительной обработки.

Мокроту разводят равным объемом дистиллированной воды или 199 средой с добавлением антибиотиков: стрептомицина 500 ед. мл или р-ра Хенкса или фосфатном буферном растворе pH 7,0 — 7,2. Приготовленную взвесь помещают на 1 — 2 часа в холодильник при +4 °C. Образовавшуюся надосадочную часть взвеси обрабатывают антибиотиками и вновь помещают в холодильник. Спустя 3 часа проводят заражение лабораторных моделей.

2.3.2 Заражение куриных эмбрионов (см. 1.4.1).

2.3.3 Заражение белых мышей (биопроба).

Исследуемый материал вводят белым мышам массой 6 — 7 г в мозг или внутрибрюшинно, соответственно, по 0,03 мл и 0,2 мл. Слепые пассажи проводят через 6 — 7 дней, используя для этого 10% взвеси мозговой ткани или селезенки и печени — в зависимости от способа заражения.

2.3.4 Идентификация возбудителя орнитоза.

Первичную идентификацию возбудителя орнитоза проводят на основании обнаружения его типичных морфологических структур (элементарные, ретикулярные тельца, цитоплазматические включения) и определения в составе выделенного микроорганизма родоспецифического хламидийного антигена. Для этого готовят мазки-отпечатки из желточных мешков куриных эмбрионов и органов белых мышей, которые окрашивают традиционными способами по Романовскому-Гимзе, Маккиавелло, акридином оранжевым, а также люминесцирующими поли- и моноклональными антителами (прямой и непрямой методы флуоресцирующих антител). Обнаружение типичных элементарных телец, цитоплазматических включений и родоспецифического хламидийного антигена является основными критериями диагностического выделения возбудителя орнитоза.

Для выделения, а лучше для первичной идентификации возбудителя орнитоза используют также монослойные культуры различных клеток (куриные фибробласты, Hela и др.), выращиваемых на покровных стеклах в плоскодонных стаканчиках. При наличии микроорганизма в исследуемом материале, через 36 — 48 — 72 часа после заражения монослоя клеток, в окрашенных вышеуказанными способами препаратах определяются цитоплазматические включения, содержащие морфологические структуры и антигены возбудителя орнитоза.

2.3.4.1. Окраска препаратов по Романовскому-Гимзе, Маккиавелло и Хименесу проводится традиционными методами, описанными в руководствах по медицинской и ветеринарной микробиологии и гистологии.

Мазки-отпечатки желточного мешка куриных зараженных эмбрионов лучше окрашивать методом Маккиавелло (см. 1.4.1), позволяющим дифференцировать морфологические структуры хламидий от желточного материала и детрита.

Мазки-отпечатки тканей биопробных животных (белых мышей), соответствующих пути заражения, окрашивают аналогично по Маккиавелло либо по Романовскому-Гимзе (см. 1.4.1, 1.3.1).

При втором методе окраски элементарные тельца имеют фиолетово-красную окраску, а ретикулярный — фиолетово-синие (во включении).

2.3.4.2 Окраска акридином оранжевым.

Мазок-отпечаток на предметном стекле или монослой зараженных клеток на покровном стекле:

• фиксируют 5 минут в кислом спирте (19 частей этилового спирта + 1 часть ледяной уксусной кислоты);
  • промывают перед окрашиванием в буферном растворе Мак-Ильвейна pH 3,8

в  3-х  сменах  (буферный  раствор Мак-Ильвейна - pH 3,8 - 4,0; раствор А -
21,0  г  кристаллической лимонной кислоты растворить в 1 л дистиллированной
воды,  раствор  Б  -  36,6  г  кристаллического  Na HPO   растворить  в 1 л
                                                   2   4
дистиллированной  воды,  собственно  буфер:  122,9  мл раствора А + 77,1 мл

раствора Б);

• окрашивают в растворе акридина оранжевого (1:10000) в течение 5 минут (наносят капли краски на препарат);
• промывают препарат в 3-х сменах буфера по 1 мин.;
• монтируют препарат:

мазок-отпечаток на предметном стекле (сохраняя влажную среду) покрывают тонким покровным стеклом, которое заливают по краям смесью парафина с воском (1:1), монослой клеток на покровном стекле монтируют на предметном стекле (клетками вниз) тем же способом;

• просматривают препараты в люминесцентном микроскопе со светофильтрами ФС-1-2 и ФС-1-4. Цитоплазматические включения люминесцируют ярко-красным (мелкие), желто-зеленым или зеленым (крупные) цветом. Элементарные тельца имеют ярко-зеленую окраску.

2.3.4.3 Окраска препаратов люминесцирующими хламидийными антителами.

2.3.4.3.1 Метод прямой иммунофлуоресценции (ПИФ).

ПИФ-метод (см. 1.3.2.1) используют для обнаружения антигенов возбудителя орнитоза в различном исследуемом материале: мазки-отпечатки, соскобы, культура клеток и др.

2.3.4.3.2 Метод непрямой иммунофлуоресценции (НИФ).

НИФ-метод (см. 1.3.2.2) также может быть использован для выявления антигенов возбудителя орнитоза при отсутствии люминесцирующих хламидийных антител и наличии сыворотки (человека, животных), содержащей антитела к родоспецифическому антигену хламидий или моноклональных антител к родоспецифическому антигену хламидий.

2.4 Серологические методы исследования.

2.4.1 Реакция, связывания комплемента (РСК) (см. 1.5.1).

2.5 Кожная аллергическая реакция.

Для постановки внутрикожной аллергической пробы используют коммерческий аллерген <*>.

---

<*> Производство Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов.

Специфический и контрольный аллергены вводят по 0,1 мл внутрикожно на внутреннюю поверхность соответственно правого и левого предплечья.

Реакцию учитывают через 24 — 48 часов по системе «4+», исходя из размеров образующегося инфильтрата:

1+ — размер инфильтрата 0,5 x 0,5 см

    2+ -        -"-         1,0 x 1,0 см
    3+ -        -"-         2,0 x 3,0 см
    4+ -        -"-         более чем 2,0 x 3,0 см.

Приложение II

1. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ

Принцип реакции основан на взаимодействии антигена, фиксированного на поверхности эритроцитов, с гомологичными антителами, приводящем к специфической агглютинации эритроцитов.

РНГА ставят с родоспецифическим эритроцитарным орнитозным диагностикумом (готовится к выпуску Пермским НПО «Биомед» Минмедпрома СССР), что дает возможность использовать ее при антропонозных и зоонозных хламидиозах. Реакция выявляет относительно кратковременно циркулирующие в крови хламидийные антитела, что существенно облегчает оценку ее результатов даже при однократном исследовании сывороток или при отсутствии нарастания титра антител в процессе заболевания.

Хламидийные антитела, определяемые в этом диагностическом тесте, появляются в сыворотках больных острыми формами хламидийной инфекции в конце первой, начале второй недели заболевания, достигают максимума на 3 — 4 неделе, после чего уровень их снижается. Через 3 — 5 месяцев после заболевания эти антитела обычно исчезают. При «генерализованных» формах урогенитальной хламидийной инфекции диагностическими следует считать титры 1:160 и выше, при «локализованных» — показатели РНГА 1:40 могут служить подтверждением клинико-эпидемиологического диагноза.

РНГА особенно целесообразно использовать при различных хламидийных антропонозах в качестве скринингового теста для более углубленного последующего целенаправленного обследования на хламидиоз.

Обнаружение антител у больных орнитозом в титре 1:160 служит основанием для постановки диагноза при наличии соответствующих клинико-эпидемиологических данных. В некоторых случаях (обследование в поздние сроки — 3 - 4 недели, проведение антибиотикотерапии) и меньшие титры антител, выявляемые РНГА (1:40 — 1:80), могут служить подтверждением клинического диагноза соответствующей эпидситуации.

1.1 Ингредиенты реакции

• специфический и контрольный эритроцитарный диагностикумы;
• исследуемая и гомологичная иммунные сыворотки;
• физиологический раствор pH 7,0 (8,5 г х.ч. — хлорида натрия на 1 л бидистиллированной воды);
• физиологический формалинизированный раствор pH 7,2 — 7,4 (физ. раствор с добавлением коммерческого формалина 3,0 мл на 1 л).

1.1.1 Диагностикумы.

Специфический и контрольный диагностикумы ресуспендируют каждый в 1 мл физиологического раствора pH 7,0 — 7,2, тщательно встряхивают до полного растворения.

1.1.2 Сыворотки.

Готовят исходные разведения исследуемой и гомологичной иммунной сыворотки 1:40 в объеме 1 мл на физ. растворе.

1.1.3 Методика постановки РНГА (макровариант).

В горизонтальном ряду полистироловой панели с лунками готовят последовательные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,4 мл, начиная с разведения 1:40 до 1:2560 (2 ряда). Сыворотки разводят на формалинизированном физ. растворе pH 7,2 — 7,4 (применение формалина предотвращает «сползание» специфического агглютинина в лунках при длительном стоянии реакции). В каждую лунку первого ряда добавляют по 0,01 мл специфического эритроцитарного диагностикума; второго ряда — по 0,1 мл контрольного эритроцитарного диагностикума. Содержание панелей тщательно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 2 — 3 часа, после чего считывают результаты реакции.

Постановка РНГА должна сопровождаться следующими контролями:

1. Контроль специфического эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации: в 3 лунки, содержащие по 0,4 мл формалинизированного физ. раствора, вносят по 0,1 мл специфического эритроцитарного диагностикума.

2. Заведомо положительный контроль — постановка РНГА с орнитозной иммунной сывороткой. Готовят последовательные разведения этой сыворотки по 0,4 мл от 1:40 до 1:2560. В каждую лунку добавляют по 0,1 мл специфического эритроцитарного диагностикума.

3. Контроль контрольного эритроцитарного диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации: в 3 лунки, содержащие по 0,4 мл формалинизированного физ. раствора, вносят по 0,1 мл контрольного эритроцитарного диагностикума.

Все условия постановки контролей должны быть равнозначны условиям постановки опыта.

Учет результатов реакции проводят по степени агглютинации эритроцитов по системе «4+»:

4+ — агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают все дно лунки, образуя по форме перевернутый купол;

3+ — на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается широкое кольцо с тонким неровным «фестончатым» краем, — осадок неагглютинировавших эритроцитов;

2+ — на фоне равномерно агглютинировавших эритроцитов отмечается менее широкое кольцо с более ровным краем, — осадок неагглютинировавших эритроцитов;

1+ — значительная часть эритроцитов не агглютинируется и оседает на дно лунки в виде кольца с четким краем;

• эритроциты оседают в центре лунки в виде диска или компактного кольца с четким краем.

Реакцию считают положительной при степени выраженности агглютинации не менее чем на 3+.

За титр исследуемой сыворотки принимают то ее наибольшее разведение, которое еще вызывает агглютинацию орнитозного эритроцитарного диагностикума не менее чем на 3+.

Контроли 1, 3 должны быть отрицательны. Контроль 2 должен быть положителен. При равном взаимодействии исследуемой сыворотки со специфическим и с контрольным диагностикумом реакция оценивается как неспецифическая.

1.2 Микровариант РНГА.

Микровариант РНГА ставят в микротитраторах системы «Такачи» или панелях одноразового пользования. Разведения сывороток используют в объеме 0,05 мл, а диагностикумы добавляют по 0,01 мл.

2. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИИ (РНИФ) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИОЗОВ

Принцип метода основан на взаимодействии антигена со специфическим иммуноглобулином (в исследуемой сыворотке) и специфической реакции последнего с антииммуноглобулином, меченным флуорохромом. Образовавшийся комплекс выявляется при люминесцентной микроскопии.

В РНИФ используют экспериментальный хламидийный антиген, (готовится к выпуску Пермским НПО «Биомед» Минмедпрома СССР), представляющий собой обработанную азидом натрия и формалином 3 — 5% взвесь оболочек желточных мешков, зараженных соответственно C. psittaci и C. trachomatis куриных эмбрионов, и антивидовую (против глобулина человека) сыворотку, меченную флуоресцеинизотиоцианатом (выпускается предприятием НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи).

РНИФ характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и является традиционным методом серодиагностики, эпиданализа урогенитальных хламидиозов. Применение антигенов 2-х видов хламидий по разнице в титрах антител позволяет дифференцировать заболевания, вызываемые этими возбудителями. Диагностическим показателем для урогенитальных хламидийных поражений при наличии соответствующих клинико-эпидемиологических данных можно считать титры 1:32 — 1:64 и выше с учетом преобладания видоспецифических антител к C. trachomatis.

Использование антивидовых сывороток к различным классам иммуноглобулинов дает возможность дифференцировать «свежее» инфицирование (обнаружение ранних IgM — антител) и выявлять поздние — IgG хламидийные антитела.

Важное диагностическое значение имеет обнаружение хламидийных IgM антител в сыворотке крови и IgA в секретах половых желез (титры >= 1:8).

РНИФ может быть использована и для диагностики орнитоза.

Диагностическое значение хламидийных IgG антител имеют показатели 1:256. Эти антитела нередко выявляют в крови переболевших орнитозом более года.

2.1 Ингредиенты реакции

• специфические и контрольный антигены;
• исследуемая и гомологичная иммунные сыворотки;
• люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека <*>;
• бычий альбумин, меченный родамином <*> (либо синька Эванса);
• забуференный глицерин (см. 1.3.2.1);
• ФСБР (см. 1.3.2.1);
• ацетон (х.ч.).

2.1.1 Антигены.

В качестве специфических антигенов используют 3 — 5% взвесь инфицированных C. psittaci и C. trachomatis оболочек желточных мешков куриных эмбрионов. Взвесь готовят в ступке на охлажденном (+4 °C) ФСБР, содержащим для инактивации хламидий 0,1% азида натрия и 0,05% формалина. Взвесь выдерживают в холодильнике при +4 °C 3 суток, затем ее центрифугируют при 3000 об./мин. 20 минут. Средний слой, содержащий элементарные и ретикулярные тельца микроорганизма, используют как антиген.

Контрольный антиген готовят аналогично из оболочек желточных мешков 10 — 12-дневных незараженных куриных эмбрионов.

2.1.2 Сыворотки.

Готовят исходные разведения исследуемой и гомологичной иммунной сывороток, начиная с разведения 1:16 на ФСБР.

Люминесцирующую сыворотку против глобулинов человека и бычий альбумин, меченный родамином, разводят каждый в 0,5 мл ФСБР, тщательно встряхивая до полного растворения. Для определения рабочего разведения люминесцирующей сыворотки приводят ее титрование с гомологичной иммунной сывороткой.

Готовят смесь люминесцирующей сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином, взятых в равных объемах и удвоенных рабочих разведениях (для контрастирования фона можно использовать также синьку Эванса в конечном разведении 1:10000).

2.1.3 Методика постановки РНМИФ.

Специфический и контрольный антигены наносят тонким писчим пером в виде «точек» на чистые обезжиренные предметные стекла, помещенные на трафарет, на котором отмечены точки — зоны нанесения на предметное стекло используемых антигенов.

Предметные стекла с нанесенными антигенами высушивают на воздухе 10 — 15 минут и фиксируют в охлажденном ацетоне (+4 °C) 15 — 20 минут.

На отдельные группы антигенов, расположенных на предметных стеклах, соответственно количеству сывороток и их разведений, наносят пипеткой или бактериологической петлей 10 мкл соответствующих разведений сывороток, начиная с наибольшего разведения. Препарат помещают во влажную камеру на 30 — 40 минут при +37 °C; промывают 2 раза по 10 минут в ФСБР. Стекла подсушивают на воздухе и на группы антигенов, контактировавших с исследуемыми сыворотками, наносят смесь люминесцирующих сыворотки и бычьего альбумина (по 10 мкл), меченного родамином. Препарат помещают во влажную камеру на 30 минут при +37 °C; промывают 2 раза по 10 минут в ФСБР; с тыльной стороны стекла карандашом отмечают зоны расположения антигенов; на группы антигенов наносят забуференный глицерин и заключают под покровное стекло. Просмотр препаратов проводят в люминесцентном микроскопе при комбинации светофильтров (для ЛМ-2) ФС 1-5; БС 8-2; СЭС 7-2; ЖС-18 с масляной иммерсией.

За титр исследуемой сыворотки принимают то наибольшее ее разведение, при котором отмечается четкая зеленая флуоресценция антигенов, связанная с хорошо различимыми элементарными и ретикулярными тельцами микроорганизма.

Специфичность показателей, получаемых РНМИФ, подтверждается контролями:

• люминесцирующая сыворотка против глобулинов человека не окрашивает контрольный антиген, обработанный иммунной к хламидиям человеческой сывороткой;
• неиммунная в отношении хламидий сыворотка человека или ФСБР, контактировавшие с антигенами возбудителя орнитоза, не обуславливают их окрашивания после обработки люминесцирующей антисывороткой.

Приложение III

ИНСТРУКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ЛИТЕРАТУРА

1. Инструкция по проведению противоэпидемических и профилактических мероприятий при орнитозе (утверждена МЗ СССР 18.11.1960 и согласована с Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 12.12.1960).

2. Инструкция о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I — II группы (утверждена МЗ СССР 20.06.78)

3. Положение о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения (утверждено МЗ СССР 18.05.1979).

---