Инвазионные болезни пчел. Нозематоз. Методические указания по лабораторным исследованиям на нозематоз медоносных пчел

(утв. Минсельхозом СССР 25.04.1985)

Утверждены 25 апреля 1985 года

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ НА НОЗЕМАТОЗ МЕДОНОСНЫХ ПЧЕЛ

Составители: Б.И. Антонов, В.В. Борисова, Л.П. Каменева, Л.И. Ковалерчук, Г.А. Михальский, В.Д. Певнева, Л.И. Прянишникова.

В книге даны методы лабораторного исследования патологического материала с целью определения возбудителей вирусных, риккетсиозных и паразитарных болезней животных. Они изложены по единой схеме. Методы унифицированы и стандартизированы.

Для ветврачей и фельдшеров, лаборантов ветеринарных лабораторий.

ПРЕДИСЛОВИЕ

Успешное выполнение намеченной XXVII съездом КПСС широкой программы развития в нашей стране агропромышленного комплекса в немалой степени зависит от хорошей организации ветеринарного обслуживания животноводства, четко налаженной работы ветеринарных диагностических лабораторий. Проводимые в лабораториях исследования позволяют правильно организовать мероприятия по предупреждению инфекционных и инвазионных болезней, а в случаях возникновения заболевания своевременно поставить диагноз и принять целенаправленные меры по его быстрейшей ликвидации.

В работе ветеринарных лабораторий все большее применение находят современные методы исследований, одновременно идет совершенствование диагностики многих заболеваний, предлагаются новые более чувствительные и достоверные методы, позволяющие полнее и на ранних стадиях выявлять заболевших животных и тем самым способствовать быстрейшему оздоровлению хозяйств.

Специалисты лабораторий постоянно расширяют перечень показателей и болезней, на которые проводятся исследования.

За последнее время утверждено значительное количество инструктивных документов по проведению лабораторных исследований, что позволило более четко организовать работу специалистов, улучшить качество исследований, получать сопоставимые результаты.

Оснащение лабораторий современным оборудованием позволяет внедрять в работу более точные инструментальные методы.

В своей работе ветеринарные лаборатории не могут использовать всего многообразия предлагаемых методов исследования из-за того, что они или недостаточно апробированы, или из-за сложности используемого оборудования. Имеют место случаи, когда предлагаемые различными авторами методы при определении одних и тех же показателей дают несовпадающие результаты. Поэтому в настоящий справочник включены методы лабораторных исследований патологического материала, полученного от больных, убитых или павших сельскохозяйственных животных, апробированные Центральной ветеринарной лабораторией и утвержденные в разные годы бывшим Министерством сельского хозяйства СССР.

Книга содержит методические указания по диагностике вирусных, риккетсиозных, хламидиозных болезней, а также методические указания по лабораторной диагностике паразитарных болезней животных и пчел.

Методики излагаются по единой схеме: взятие и пересылка патологического материала, методы его обработки, микроскопические исследования, включая световую и люминесцентную микроскопию, выделение возбудителей на куриных эмбрионах и культурах клеток, заражение лабораторных животных, гистологические исследования, идентификация и дифференциация возбудителей с использованием различных методов, определение биологической активности вакцин и исследования на напряженность иммунитета.

Методы лабораторных исследований, представленные в справочнике, унифицированы и стандартизированы, что создает возможность для стандартизации аппаратов, приборов, инструментов, посуды, реактивов, биопрепаратов и другого специального имущества, определения объема подготовки специалистов и степень оснащения ветеринарных диагностических лабораторий. Таким образом, стандартизация методов исследования является способом наведения строгого порядка в ветеринарной лабораторной работе.

1. Общие положения

1.1. Нозематоз — инвазионная болезнь пчел, вызываемая микроспоридией Nosema apis. Болезнь характеризуется ослаблением пчелиных семей, снижением их продуктивности и гибелью. Наибольшего развития болезнь достигает в весенне-летний период.

1.2. Диагноз на нозематоз ставят на основании результатов микроскопического исследования с учетом эпизоотологических и клинических данных.

1.3. Для исследования в лабораторию направляют не менее 50 живых пчел, свежий подмор от 10 — 20% пчелиных семей или погибшую матку. В отдельных случаях при проявлении клинических признаков болезни и отсутствии гибели пчел можно направлять фекалии, 5 г меда, 0,5 г перги или пыльцевой обножки, смывы с листов вощины.

1.3.1. Фекалии у пчел собирают весной перед массовым облетом путем соскабливания их со стенок улья и рамок на бумагу.

От матки собирают фекалии отдельно, для этого ее помещают в маточную клетку на 1 — 11/2 ч.

1.3.2. Пробы меда отбирают из вскрытых ячеек, пергу — из сотов, пыльцевую обножку — из пылеуловителей улья чистым шпателем. Смывы делают с поверхности не менее чем 5 листов вощины. Отобранные пробы помещают в стеклянные банки с притертой пробкой и доставляют в лабораторию в тот же день.

2. Микроскопическое исследование

2.1 Исследование можно проводить групповое и индивидуальное.

При групповом исследовании у пчел отделяют брюшко, помещают в фарфоровую ступку с небольшим количеством песка (толченого стекла), тщательно растирают, затем добавляют дистиллированную воду из расчета 1 мл на брюшко и растирают до получения однородной массы. Суспензию можно готовить в гомогенизаторе. Каплю приготовленной суспензии помещают на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют под средним увеличением микроскопа в затемненном поле зрения, просматривая не менее 20 полей.

2.2. При индивидуальном исследовании у пчелы отделяют голову, пинцетом вытягивают за последний сегмент брюшка кишечник, который помещают в ступку целиком или среднюю кишку, растирают, добавляют 1 мл дистиллированной воды, растирают до получения однородной массы и исследуют так, как указано в п. 2.1.

Матку исследуют только индивидуально.

При микроскопии необходимо учитывать, что споры ноземы представляют преломляющие свет тела овальной формы.

Степень поражения пчел спорами ноземы оценивают в крестах: до 10 спор в препарате — один крест, от 11 до 100 — два, от 101 до 1000 — три и свыше 1000 — четыре креста. При обнаружении небольшого количества спор ноземы у матки степень инвазии оценивают в четыре креста.

2.3. Исследование окрашенных препаратов. Каплю суспензии наносят на предметное стекло, делают тонкий мазок, высушивают на воздухе, фиксируют спирт-эфиром (пополам) в течение 20 — 25 мин. Затем на мазок наносят 1 — 2 мл 10 — 30%-ной перекиси водорода и оставляют при комнатной температуре в течение 10 ч. Мазок промывают дистиллированной водой и красят изокармином при комнатной температуре в течение 10 ч или в термостате при 56 °C в течение 2 ч. Препарат исследуют под средним увеличением, а затем под иммерсионной системой микроскопа.

При микроскопии надо учитывать, что споры ноземы не окрашиваются и хорошо видны на фиолетовом фоне.

2.4. Пробу фекалий снимают скальпелем с бумаги, помещают на предметное стекло, добавляют 1 — 2 капли дистиллированной воды, тщательно размешивают препаровальной иглой до получения однородной массы, накрывают покровным стеклом и исследуют под средним увеличением микроскопа.

2.5. К пробе меда 2,1 г (1,5 мл) добавляют 5 мл дистиллированной воды, 10 мл этилового спирта, тщательно размешивают и центрифугируют при 2500 — 3000 об/мин в течение 5 — 10 мин, полученный осадок исследуют под средним увеличением микроскопа.

2.6. Пробу перги или пыльцевой обножки наносят на предметное стекло, добавляют 3 — 5 капель раствора Люголя или дистиллированной воды, тщательно размешивают и исследуют под средним увеличением микроскопа.

2.7. Смыв выливают в пробирку и центрифугируют при 2500 — 3000 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость сливают, а осадок исследуют под микроскопом.

2.8. Результат микроскопического исследования считают положительным при обнаружении спор ноземы.

3. Видовую принадлежность спор нозем пчел определяют в областной или республиканской ветеринарной лаборатории непрямым методом иммунофлуоресценции.

3.1. Из суспензии средней кишки пчел делают тонкий мазок, подсушивают при комнатной температуре, фиксируют спирт-эфиром (пополам) в течение 30 мин, затем на мазок наносят несколько капель цельной гипериммунной кроличьей сыворотки, которую готовит ВИЭВ (109472, Москва, Ж-472, Кузьминки). Препараты помещают во влажную камеру (чашка Петри с ватой, смоченной водой), ставят в термостат при 37 — 38 °C на 1 ч и после промывают физиологическим раствором pH 7,2 — 7,4 в течение 30 мин. На подсушенные препараты наносят 1 — 2 капли антивидной люминесцирующей сыворотки против глобулинов кролика, которую готовит ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (123098, Москва, ул. им. Н.Ф. Гамалеи, 18), выдерживают во влажной камере в термостате при 37 — 38 °C в течение 1 ч, затем мазки промывают физиологическим раствором pH 7,2 — 7,4 (дважды), споласкивают дистиллированной водой, подсушивают и исследуют под иммерсионной системой люминесцентного микроскопа.

3.2 Контроль ставят в следующем сочетании:

на мазок наносят несколько капель нормальной кроличьей сыворотки, а затем обрабатывают антивидовой люминесцирующей сывороткой. В этом случае реакция должна быть отрицательной.

3.3 Учет и оценка результатов реакции:

(++++) — яркая, сверкающая зеленая люминесценция спор;

(+++) — достаточно яркая зеленоватая люминесценция спор;

(++) — недостаточно яркая желтовато-зеленоватая люминесценция спор;

(+) — очень слабая люминесценция спор (отрицательная);

(-) — люминесценция отсутствует, видны лишь оболочки спор (отрицательная).

Положительными считаются реакции с оценкой четыре и три креста, сомнительной — два креста.

При положительной реакции выявлено присутствие N. apis. При сомнительной реакции делают перестановку и при получении повторного сомнительного результата снова запрашивают материал. При отрицательных реакциях N. apis отсутствует.

4. Срок исследования — 2 дня.

---