Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю мидий в районах их выращивания, на обрабатывающих предприятиях и по очистке мидий от бактериального загрязнения

(утв. Минздравом СССР 31.12.1987, Минрыбхозом СССР 28.01.1987)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Методические указания по санитарно-микробиологическому... (от 24.03.1983)"]:::doc
  click n0 "https://bukva.ai/docs/123-5133a-12" "Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю черноморских мидий и устриц (утв. Минрыбхозом СССР 24.03.1983)"
  n1["Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю... (от 31.12.1987)"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/instruktsiya-po-sanitarno-mikrobiologicheskomu" "Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю мидий в районах их выращивания, на обрабатывающих предприятиях и по очистке мидий от бактериального загрязнения (утв. Минздраво"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

27 января 1987 года

ИНСТРУКЦИЯ ПО САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ КОНТРОЛЮ МИДИЙ В РАЙОНАХ ИХ ВЫРАЩИВАНИЯ, НА ОБРАБАТЫВАЮЩИХ ПРЕДПРИЯТИЯХ И ПО ОЧИСТКЕ МИДИЙ ОТ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

Инструкция предназначена для руководства при проведении санитарно-микробиологического контроля мидий в районах выращивания, на обрабатывающих предприятиях, а также фирменных предприятиях общественного питания системы Минрыбхоза СССР и распространяется на производственные, научно-исследовательские организации и учреждения санэпидслужбы.

Двустворчатые моллюски-мидии являются активными фильтраторами, в процессе своей жизнедеятельности накапливают в теле микроорганизмы из окружающей среды. Поэтому в мидиях, выращиваемых в подверженных антропогенному загрязнению районах, могут встречаться патогенные для человека бактерии и вирусы. Это обуславливает особые требования к районам культивирования мидий и к мидиям как сырью для пищевой продукции.

Основной задачей микробиологического контроля является выпуск доброкачественной продукции из мидий, повышение санитарной культуры при выращивании мидий, во время сбора урожая, транспортировки, хранения и технологической обработки, а также предупреждение возникновения пищевых отравлений.

Санитарно-микробиологический контроль мидий состоит из контроля непосредственно в марихозяйствах, занимающихся культивированием мидий, а также из профилактического и дополнительного контроля на обрабатывающих предприятиях, производящих продукцию из мидий.

В Инструкции приведены схемы контроля мидий, методы отбора проб, подготовки к анализу и микробиологических исследований, оценка результатов санитарно-микробиологических анализов и рекомендуемые микробиологические нормативы. Описаны циркуляционная и проточная системы очистки мидий от бактериального загрязнения, требования к качеству используемой для очистки мидий морской воды и ее обработка, дано используемое для очистки оборудование. В отдельном разделе приведены описания применяемых для микробиологических исследований сред и реактивов. В конце Инструкции дан список рекомендуемой литературы.

Инструкция составлена с учетом новых ГОСТов, стандартов СЭВ, методических указаний Минздрава СССР, отраслевых нормативных документов, данных отечественной и зарубежной статистики и на основании обобщения материала многолетних собственных исследований авторов Инструкции.

Инструкция разработана в АзЧерНИРО и Одо ИнБЮМ УССР при участии членов Методсовета бактериологов рыбной промышленности.

Инструкция вводится, в части контроля мидий, взамен «Методических указаний по санитарно-микробиологическому контролю черноморских мидий и устриц (в порядке производственного испытания)», утвержд. Минрыбхозом СССР 24 марта 1983 г.

1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРИ ВЫРАЩИВАНИИ МИДИЙ В МАРИХОЗЯЙСТВАХ

1.1. Схема микробиологического контроля мидий

В период выращивания мидий микробиологический контроль их осуществляется периодически: 1 раз в месяц в зимне-весенний период и 2 раза в месяц в летне-осенний период. Во время сбора урожая мидий контролируют 1 раз в декаду.

Схема и периодичность микробиологического контроля мидий в марихозяйствах представлены в табл. 1.1.

Таблица 1.1

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ ДЛЯ МИДИЙ

Примечание: Для накопления данных рекомендуется параллельно проводить определение бактерий группы кишечных палочек методом наиболее вероятного числа (НВЧ) в соответствии с «Методическими указаниями по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами № 2657».

Методики отбора проб мидий, подготовка их к анализу и методики проведения микробиологических анализов представлены в разделе 4 настоящей Инструкции.

1.2. Микробиологический контроль морской воды

Одновременно с микробиологическим контролем мидий проводят микробиологические исследования морской воды из районов выращивания мидий. Периодичность микробиологического контроля морской воды представлена в табл. 1.2.

Таблица 1.2

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ ДЛЯ МОРСКОЙ ВОДЫ В РАЙОНАХ ВЫРАЩИВАНИЯ МИДИЙ И ПЕРИОДИЧНОСТЬ КОНТРОЛЯ

Методики отбора проб морской воды, подготовки их к анализу и методики проведения микробиологических исследований изложены в разделе 4 настоящей Инструкции.

1.3. Оценка результатов контроля и рекомендации

Микробиологические критерии являются одними из важнейших при определении пригодности моллюсков в пищу. Мидии, выращиваемые в марихозяйствах, по бактериологическим показателям должны соответствовать требованиям, приведенным в табл. 1.1.

На каждый район выращивания мидий марихозяйство должно получить разрешение органов Государственного санитарного надзора.

В случае постоянной повышенной бактериальной обсемененности выращиваемых мидий, а также при наличии в них патогенной микрофлоры необходимо выявить источник загрязнения морской среды в районе размещения мидийных плантаций. Если источники загрязнения невозможно устранить, то мидийные плантации необходимо перенести в более чистые районы. При выявлении патогенных микроорганизмов вопрос об использовании мидий и дальнейшем их выращивании решают органы Государственного санитарного надзора.

Во время сбора урожая к качественному удостоверению на каждую отгружаемую партию мидий прилагаются результаты микробиологических анализов на основании периодического контроля в соответствии с табл. 1.1. На основании этих анализов дается заключение о направлении мидий на промпереработку (для выпуска кулинарной или консервированной продукции).

2. ОЧИСТКА МИДИЙ ОТ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

2.1. Требования к качеству мидий-сырца, поступающих на очистку

Мидии, поступающие на очистку (отсадку), по своим показателям должны соответствовать предъявляемым к ним требованиям согласно ТУ 15-04-354-84 «Мидии черноморские живые».

2.2. Требования к качеству морской воды, используемой для очистки мидий

2.2.1. Район водозабора морской воды, используемой для очистки мидий, не должен подвергаться загрязнению промышленными или хозяйственно-бытовыми сточными водами.

2.2.2 Для обеспечения эффективности последующей обработки морской воды

                                  **3**

она должна содержать не более 1 x 10 кл/куб. дм бактерий группы кишечных

                               **4**<br>

2.2.3. Морская вода, применяемая для очистки (отсадки) мидий, должна подвергаться обеззараживанию ультрафиолетовыми лучами в специальной установке.

По своим бактериологическим показателям морская вода после обеззараживания должна соответствовать требованиям ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая».

2.2.4. Очистку мидий проводят в морской воде соленостью 15 — 19 промилле в течение 24 — 48 ч. Соленость воды ниже 10 промилле и выше 20 промилле отрицательно влияет на общее физиологическое состояние мидий и исключает эффективность процесса очистки в целом.

2.2.5. Температура воды должна находиться в пределах 10 — 20 °C. При температуре воды выше 20 °C или при резких перепадах между ее значениями в районе выращивания и температурой воды в бассейнах для очистки у мидий возможен массовый вымет половых продуктов.

2.2.6. Уровень растворенного кислорода в морской воде, используемой для очистки мидий, не должен снижаться менее 5 мг/л.

2.3. Обработка морской воды, предназначенной для очистки мидий

2.3.1. Обеззараживание морской воды проводят с помощью облучения ультрафиолетовыми лучами с длиной волны в диапазоне 2000 — 2950 А°, которые обладают максимальным бактерицидным действием. При мутности морской воды выше 85 частей на миллион и цветности выше 20° (90 — 150 частей на миллион) она должна быть подвергнута предварительному отстаиванию или фильтрации для снижения этих показателей до указанного уровня.

2.3.2. Для облучения используют стандартные установки для обеззараживания морской воды, их количество и мощность зависят от объема воды, необходимых для процесса очистки мидий.

2.3.3. Контроль за величиной интенсивности ультрафиолетового излучения бактерицидных ламп осуществляется ежемесячно с помощью обычного бактерицидного ваттметра. Лампы, дающие излучение ниже 60% от первоначального уровня, подлежат замене.

2.4. Режим очистки мидий

2.4.1 Циркуляционная система очистки мидий

Циркуляционная система очистки состоит из водозабора, емкости-отстойника, стерилизующей установки для обработки морской воды (ультрафиолетового облучателя), аэратора, одного или нескольких бассейнов для выдерживания моллюсков и соединительных трубопроводов. Полная циркуляция морской воды между облучателем и бассейнами по замкнутому циклу осуществляется с помощью насосов. Скорость водообмена должна обеспечивать за 1 ч двух-, трехразовое прохождение всего объема циркулирующей в системе морской воды через облучатели.

2.4.1.1. Мидии перед помещением в бассейн тщательно промывают струей воды из шланга, затем их размещают непосредственно на решетчатом «ложном» дне, приподнятом на 15 — 20 см от дна бассейна, или в специальных контейнерах, садках и корзинах.

Толщина слоя мидий на «ложном» дне или на полках в контейнерах должна быть не более 15 см. При выдерживании мидий в многоярусных контейнерах толщина слоя воды над моллюсками должна быть не менее 15 см между секциями и не менее 30 см над верхним слоем мидий.

2.4.1.2. Бассейны заполняют морской водой, предварительно прошедшей через ультрафиолетовый облучатель. Воду, циркулирующую в системе, стерилизуют непрерывно в течение всего цикла очистки.

2.4.1.3. После первого 24-часового цикла очистки воду из бассейна полностью сливают в емкость-отстойник, мидии и дно бассейна промывают предварительно обеззараженной водой, направляемой сильной струей из шланга, для удаления ила, песка и выделений моллюсков.

2.4.1.4. Бассейны вновь заполняют обеззараженной водой и повторяют 24-часовой цикл очистки при циркуляции морской воды в системе с выключенной бактерицидной установкой. Таким образом, полный цикл очистки составит 48 часов.

2.4.1.5. Циркуляционная система очистки, особенно при высокой температуре морской воды, требует постоянной дополнительной аэрации водных масс.

Полностью воду в циркуляционной системе следует заменять в зимний период через 14 дней, летом — через 5 — 7 дней.

2.4.2 Проточная система очистки

Проточная система очистки состоит из водозабора, ультрафиолетового облучателя и емкости для мидий различных конструкций. Применение проточной системы имеет ряд преимуществ при очистке небольших партий моллюсков — оборудование более компактно, отпадает необходимость в дополнительной аэрации воды, а сам процесс протекает несколько быстрее.

2.4.2.1. Мидии тщательно промывают водой из шланга и размещают в емкостях для очистки.

2.4.2.2. Включают бактерицидную установку и регулируют скорость протока морской воды из расчета 2 — 3 л/мин. на 15 — 20 кг мидий.

2.4.2.3. Через 12 часов очистки проток воды прекращают, а воду из емкости сливают. Мидий и дно бассейна промывают сильной струей воды, смывая ил и выделения моллюсков.

2.5. Оборудование для очистки мидий

2.5.1 Установки для обеззараживания морской воды

Для обеззараживания воды от микроорганизмов используют серийно выпускаемые установки для обеззараживания морской воды модели ОВ-1п (бактерицидная лампа БУВ-60П или ДБ 60-1П), производительностью 3 куб. м/ч, или модели СВ-1ПРК (бактерицидной лампой РКС 2,5), производительной мощностью 50 — 70 куб. м/ч. Мощность и количество облучателей определяется объемом воды, поступающей в емкости для очистки мидий.

2.5.2 Бассейны (емкости) для выдерживания мидий

2.5.2.1. Количество и размеры бассейнов (емкостей) для выдерживания мидий определяются количеством очищаемых моллюсков. Независимо от конструкции они должны соответствовать следующим технологическим требованиям:

• обеспечивать равномерный проток воды через контейнеры, лотки или корзины с мидиями и их компактную укладку;

• предотвращать возникновение застойных зон и связанной с ними возможности вторичного загрязнения мидий.

2.5.2.2. Необходимый уровень циркуляции воды в бассейнах достигается при соотношении их длины и ширины от 1:10 до 1:4. При значительной длине лотков они устанавливаются с уклоном до 2% для стока воды.

2.5.2.3. Для очистки небольших партий мидий наиболее удобны бассейны размером 6 x 1 м, 5 x 1 м, позволяющие очищать до 1000 кг мидий за 24 — 36 ч при среднем уровне загрязнения.

2.5.3 Контейнеры, лотки, корзины для размещения мидий

Выдерживание мидий в бассейнах производят в специальных проволочных контейнерах, лотках или корзинах, изготовленных из любых некоррозирующих материалов — гальванизированной проволоки, пластмассы, древесины.

2.5.4 Требования к материалам для изготовления бассейнов и системы трубопроводов

2.5.4.1. Материалом для изготовления бассейнов и лотков служат некоррозирующие и нетоксичные материалы. Стенки бассейна могут быть цементированными или бетонными.

2.5.4.2. Наиболее приемлемым материалом для изготовления труб системы водоснабжения является пластмасса, применение которой одновременно снимает проблему коррозии и токсичности подаваемой к мидиям воды. Категорически запрещается использование меди или медных сплавов в узлах и деталях, контактирующих с морской водой в системе трубопроводов и в самих бассейнах.

2.6. Контроль за процессом очистки мидий

2.6.1. Время начала очистки, ее режим и количество мидий регистрируют в технологическом журнале, для чего каждому из бассейнов присваивают номер.

2.6.2. Эффективность очистки определяют на основании данных микробиологических исследований контрольных проб мидий, отбираемых еженедельно. Каждую пробу отбирают из разных мест очищаемой партии мидий. Отбор проб мидий, подготовку их к анализу и микробиологические исследования проводят согласно разделу 4 настоящей Инструкции.

2.6.3. Морская вода, используемая для очистки мидий, контролируется 1 раз в 10 дней. Пробы отбирают в стерильную посуду на выходе из облучателя. Микробиологические исследования морской воды проводят в соответствии с ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа». Вода должна отвечать требованиям ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая».

3. САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОИЗВОДСТВА ПРОДУКТОВ ИЗ МИДИЙ НА ОБРАБАТЫВАЮЩИХ ПРЕДПРИЯТИЯХ

3.1. Профилактический микробиологический контроль при производстве кулинарной продукции

Профилактический микробиологический контроль готовой кулинарной продукции из мидий проводится систематически бактериологическими лабораториями предприятий и периодически — лабораториями центральных проектно-конструкторских и технических бюро Всесоюзных рыбопромышленных объединений и учреждениями санэпидслужбы.

Кулинарные изделия из мидий являются скоропортящимися продуктами, качество их зависит от обсемененности мидий-сырца, вспомогательных материалов, от правильности проведения термической обработки и всего технологического процесса приготовления кулинарных изделий, их хранения и транспортировки.

Кулинарные изделия из мидий контролируют в соответствии с табл. 3.1.

Таблица 3.1

РЕКОМЕНДУЕМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ НОРМАТИВЫ ДЛЯ КУЛИНАРНОЙ ПРОДУКЦИИ ИЗ МИДИЙ И ПЕРИОДИЧНОСТЬ КОНТРОЛЯ

<*> Определение производится по усмотрению учреждений санэпидслужбы в порядке Государственного санитарного надзора.

3.2. Дополнительный микробиологический контроль при производстве кулинарной продукции

Дополнительный микробиологический контроль проводят в случае стойкой повышенной бактериальной обсемененности готовой продукции из мидий с целью обнаружения и устранения источников и причин обсеменения. При дополнительном контроле анализируют сырье и полуфабрикаты по ходу технологического процесса производства кулинарных продуктов из мидий в соответствии с табл. 3.2, а также исследуют компоненты (вспомогательные материалы), входящие в рецептуру изделий из мидий.

Таблица 3.2

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ СЫРЬЯ

Объем исследований при дополнительном контроле определяют зав. лабораторией и старший микробиолог.

3.3. Профилактический микробиологический контроль при производстве консервов

Профилактический микробиологический контроль при производстве консервов из мидий систематически проводится бактериологическими лабораториями рыбоконсервных предприятий и периодически — лабораториями центральных проектно-конструкторских бюро Всесоюзных рыбопромышленных объединений и учреждениями санэпидслужбы.

В основе профилактического контроля лежит определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов как показателя санитарного состояния и качества продуктов. Сырье и полуфабрикаты при приготовлении консервов из мидий контролируют в соответствии с табл. 3.3.

3.4. Дополнительный микробиологический контроль при производстве консервов

Дополнительный микробиологический контроль проводят по решению зав. лабораторией, старшего микробиолога или по требованию учреждений Государственного санитарного надзора в ряде случаев, предусмотренных «Инструкцией о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания № 1121-73», утвержд. Минздравом СССР 18 сентября 1973 г., и «Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому контролю на рыбоконсервных предприятиях», утвержд. Минрыбхозом СССР 30 июля 1976 г.

3.5. Санитарно-микробиологический контроль на обрабатывающих предприятиях

3.5.1. Важным условием выработки доброкачественной продукции из мидий является строгое соблюдение санитарного режима на обрабатывающих предприятиях, соблюдение правил личной и профессиональной гигиены работниками этих предприятий.

Уровень санитарной культуры и эффективность проведения санитарных мероприятий на производстве контролируется ежедневно визуально, а также путем проведения комплекса микробиологических анализов, включающих проверку санитарного состояния воды, воздуха, технологического оборудования, инвентаря, тары, рук и санодежды рабочего персонала (табл. 3.4).

Санитарно-микробиологический контроль должен отражать санитарное состояние производства и своевременно выявлять причины и источники загрязнения с целью их быстрого устранения и повышения санитарного уровня производства.

3.5.2. Вода на обрабатывающих предприятиях при производстве продукции из мидий употребляется в разнообразных технологических процессах и может служить источником вторичного инфицирования сырья, оборудования, инвентаря и рук работников, а также консервов в случае микроразгерметизации при охлаждении после стерилизации. Поэтому контроль воды, используемой в процессе обработки мидий, имеет большое значение.

Отбор проб воды для микробиологических исследований и анализ ее проводят согласно ГОСТу 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа» и ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая».

3.5.3. Воздух производственных помещений, загрязненный микроорганизмами, способствует увеличению бактериальной обсемененности продуктов. В воздухе помещений определяют количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Воздух обследуется седиментационным или аспирационным методом.

При седиментационном методе чашки Петри с питательным агаром оставляют открытыми в течение 20 мин. в различных местах обследуемого помещения, затем чашки закрывают и инкубируют при (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч, после чего подсчитывают выросшие колонии.

При обследовании воздуха аспирационным методом используется прибор Кротова (инструкция по эксплуатации прилагается к прибору).

3.5.4. Очистка, мойка и дезинфекция оборудования, инвентаря, тары производятся на обрабатывающих предприятиях в соответствии с «Санитарными правилами для береговых рыбообрабатывающих предприятий», утвержд. Минздравом СССР 24 декабря 1981 г., и «Инструкцией по санитарной обработке технологического оборудования на рыбообрабатывающих предприятиях и судах», утвержд. Минздравом СССР 27 марта 1984 г.

Контроль за изготовлением дезрастворов и содержанием в них активного хлора осуществляется лабораторией предприятия. Приготовление дезинфицирующих растворов и их хранение закрепляются за определенными специально проинструктированными лицами цеха.

Микробиологический контроль качества мойки и дезинфекции оборудования осуществляется перед началом работы путем исследования смывов. Взятие смывов производится с помощью увлажненных ватных тампонов, закрепленных на стержнях, или марлевых салфеток, заранее простерилизованных. Перед взятием смывов тампоны или салфетки смачивают стерильным 0,1-процентным водным раствором пептона или изотоническим раствором натрия хлорида. Материал для исследования получают путем смыва со 100 кв. см обследуемой поверхности с помощью шаблона (трафарета) площадью 25 кв. см. Чтобы взять смывы с площади в 100 кв. см, трафарет накладывают 4 раза в разные места контролируемого объекта. Ватным тампоном или салфеткой обтирают ограниченные шаблоном поверхности во взаимно-перпендикулярных направлениях. При взятии смывов с мелкого инвентаря одним тампоном протирают всю поверхность предмета. При обследовании трубопроводов и другого оборудования, где невозможно применить тампон, производится микробиологический анализ последних порций промывных вод, взятых после мойки оборудования.

Анализ смывов с консервных банок производят после мойки. В банки, в зависимости от объема, наливают 50 — 100 куб. см пептонной воды или изотонического раствора натрия хлорида, закрывают крышкой и тщательно встряхивают в течение 2 — 3 мин. Исследованию подвергают смывы без разведения.

Исследования смывов и промывных вод производят в соответствии с п. 4.2 и п. 4.3 настоящей Инструкции.

3.5.5. Чистоту рук и санодежды работников, занятых на ручных операциях приготовления кулинарной продукции и консервов, определяют посредством исследования смывов, взятых перед началом работы, на присутствие бактерий группы кишечных палочек. Взятие смывов с рук и санодежды осуществляется в следующем порядке. Увлажненным ватным тампоном или марлевой салфеткой обтирают ладонные поверхности обеих рук, затем другой стороной тампона протирают поперек тыльные поверхности пальцев, захватывая межпальцевые и подногтевые пространства. Смывы с санодежды берут тампоном с 4 участков площадью по 25 кв. см каждый (с нижней части каждого рукава и 2 участка с верхней и средней частей передних пол спецовки). Смывы анализируют в соответствии с п. 4.3.

3.5.6. Готовая кулинарная продукция может быть инфицирована патогенными коагулазоположительными стафилококками. Основными источниками такого обсеменения являются люди, больные ангиной, гнойничковыми заболеваниями кожи. С целью профилактики стафилококковых заболеваний необходимо ежедневно перед началом смены работникам санпоста проводить осмотр кожных покровов у лиц, имеющих контакт с кулинарной продукцией. Люди с выявленными заболеваниями к работе не допускаются.

3.5.7. Ответственность за выполнение санитарных правил несут директор предприятия, начальник производственного цеха. Контроль за соблюдением санитарных правил осуществляется лабораторией предприятия, учреждениями государственного и ведомственного санитарного надзора.

3.6. Оценка результатов контроля и рекомендации

3.6.1 Мидии-сырец, получающие на производстве кулинарных изделий, по

своим микробиологическим показателям должны соответствовать нормативам, приведенным в табл. 3.2. Общая бактериальная обсемененность мидий-сырца при направлении их для приготовления консервов не должна превышать величины 1 x 5 10 /г (табл. 3.3). В случае повышения этих показателей необходимо проводить очистку мидий от бактериального загрязнения согласно методике раздела 2 настоящей Инструкции.

3.6.2. Готовый продукт рассматривается как доброкачественный в микробиологическом отношении, если его бактериальная обсемененность не превышает установленных нормативов (табл. 3.1) при условии, что продукт отвечает требованиям по органолептическим и физико-химическим показателям НТД.

Повышенная бактериальная обсемененность, присутствие нежелательной микрофлоры указывает на неблагоприятное санитарное состояние на производстве.

3.6.3. При обнаружении повышенной бактериальной обсемененности готовой кулинарной продукции из мидий необходимо проведение повторного микробиологического анализа и проведение визуальной оценки санитарного состояния производства, проверка соблюдения режимов технологического процесса, а также режимов и сроков хранения, условий транспортировки, сроков реализации. Необходима проверка работы технологического оборудования, холодильных установок, вентиляции. В случае обнаружения повышенной бактериальной обсемененности продукции при повторном исследовании проводят дополнительные микробиологические исследования сырья и полуфабрикатов по ходу технологического процесса производства, а также исследования вспомогательных материалов. При выявлении источников инфицирования готового продукта принимают срочные меры по его устранению. Например, проводят повторную тщательную обработку оборудования моющими и дезинфицирующими средствами, дополнительную обработку вспомогательных материалов, дополнительное хлорирование воды и т.п.

3.6.4. В случае повышенной бактериальной обсемененности консервов перед стерилизацией проводят исследование в соответствии с требованиями «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания № 1121-73», утвержд. Минздравом СССР 18 сентября 1973 г., и выявляет причины повышенной бактериальной обсемененности.

3.6.5. Анализ готовых консервов проводят в соответствии с требованиями «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания № 1121-73», утвержд. Минздравом СССР 18 сентября 1973 г., и стандартов на консервы из мидий.

4. ОТБОР ПРОБ, ПОДГОТОВКА ИХ К АНАЛИЗУ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Отбор проб и подготовка к анализу

4.1.1. Отбор проб полуфабрикатов, готовой продукции из мидий, а также вспомогательных материалов и подготовку их к анализу проводят в соответствии с «Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому контролю на рыбоконсервных предприятиях», утвержд. Минрыбхозом СССР 30 июля 1976 г., СТ СЭВ 3013-81 «Пищевые и вкусовые продукты. Порядок отбора проб для микробиологических анализов» и СТ СЭВ 3014-81 «Пищевые и вкусовые продукты. Подготовка проб для микробиологических анализов».

4.1.2. Отбор проб должен производиться лицом, имеющим специальную подготовку и соответствующие полномочия и несущим ответственность за правильность отбора.

4.1.3. Перед отбором проб проверяют соответствие контролируемой партии прилагаемым документам и устанавливают органолептически (за исключением вкуса) выявляемые дефекты контролируемого продукта.

4.1.4. При одновременном отборе проб для микробиологического анализа и других испытаний, отбор проб начинают с предназначенных для микробиологического анализа.

4.1.5. Масса единиц продукции должна быть достаточной для анализа по комплексу определяемых микробиологических показателей.

4.1.6. Пробы отбирают способом, исключающим вторичную микробиологическую контаминацию продукта.

4.1.7. Посуда, инструменты и материалы, соприкасающиеся с продуктами за время отбора проб, должны быть простерилизованы.

4.1.8. Отбор проб мидий в период их выращивания производят из разных мест мидийного коллектора.

Пробы мидий-сырца отбирают стерильным пинцетом с разной глубины и из разных мест соприкосновения сырья с тарой. Пробу в количестве до 500 г помещают в стерильную посуду, упаковывают, не допуская повреждения упаковки. Пробы транспортируют не более 6 часов при температуре 4 — 5 °C.

4.1.9. Отбор проб морской воды из района выращивания мидий производят из поверхностного слоя над коллекторами и с глубины у окончания нижней подборы коллектора.

Пробы из поверхностного слоя морской воды отбирают в стерильную стеклянную посуду емкостью 500 куб. см, погружаемую на 15 см от поверхности. Отбор проб с глубины производят батометром с соблюдением правил стерильности.

Отобранные пробы транспортируют в лабораторию в сумках-холодильниках или термоконтейнерах, где поддерживается температура в пределах 4 — 5 °C с помощью водонепроницаемых мешков, летом наполненных льдом, а зимой — теплой водой.

Во время перевозки проб следует избегать различных толчков, опрокидывания и замачивания пробок. Исследование проб морской воды должно быть произведено не позднее 2 — 4 ч с момента отбора.

4.1.10. На пробы для микробиологического анализа составляется протокол отбора проб, в котором указывают цель микробиологического анализа, место, дату и время отбора проб, наименование продукта, результаты органолептического осмотра, фамилии, инициалы, официальные должности и подписи лиц, выполняющих отбор проб, а также добавочную информацию о способах хранения, транспортировки и т.п.

4.1.11 Подготовка к анализу проб мидий

В лаборатории мидий очищают от обрастаний и промывают под струей проточной воды. После этого наружную поверхность створок мидий облучают в боксе ультрафиолетовыми лучами ртутно-кварцевой лампы 15 — 20 мин. или протирают спиртом поверхность створок и фламбируют стерильным тампоном, смоченным спиртом. Затем профламбированным скальпелем разрезают мускул-замыкатель, раскрывают створки и извлекают мясо мидий вместе с межстворчатой жидкостью. Ткани мидий измельчают сначала профламбированными ножницами, а затем в стерильной фарфоровой ступке пестиком, добавляя для лучшего измельчения стерильный песок. Измельчать мясо мидий можно также в электрических гомогенизаторах типа размягчителя тканей РТ-1 Одесского завода. Полученный гомогенат используют непосредственно для микробиологических посевов и для приготовления разведений.

4.1.12. Из 10 г гомогената мидий или исследуемого продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений. Для приготовления исходного (первого) разведения 10 г исследуемого продукта вносят в колбу с 90 куб. см стерильного 0,1% водного раствора пептона или изотонического раствора натрия хлорида и тщательно перемешивают. Для приготовления следующих разведений берут ряд пробирок, в котором каждая пробирка должна содержать 9,0 куб. см стерильного 0,1% водного раствора пептона или такое же количество стерильного изотонического раствора натрия хлорида. В первую пробирку стерильной градуированной пипеткой вносят 1,0 куб. см исходного разведения, затем новой стерильной пипеткой после перемешивания содержимое первой пробирки в количестве 1,0 куб. см переносят в следующую пробирку, не прикасаясь к поверхности жидкости в этой пробирке и т.д.

В результате исследуемый продукт оказывается разведенным в 10, 100 и более раз в соответствии с количеством взятых пробирок. 1 куб. см взвеси в колбе содержит 0,1 г продукта (1-е разведение, исходное), в первой пробирке — 0,01 г продукта (2-е разведение) и т.д.

4.2. Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

(общее микробное число — ОМЧ)

4.2.1. Метод основан на высеве определенного количества продукта или его разведения в агаризированную среду, культивирование посевов в аэробных условиях при (30 +/- 1) °C в течение (72 +/- 3) ч, подсчете всех выросших видимых колоний и определении количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г (куб. см) продукта.

4.2.2. Следует выбирать разведения, при посеве которых на чашках Петри вырастает не менее 30 и не более 300 колоний.

Из 2 — 3-х последовательных разведений делают посев глубинным методом в 2 параллельные стерильные чашки Петри.

В каждую чашку добавляют не позднее чем через 15 мин. 15 — 20 куб. см расплавленной и охлажденной до 45 °C питательной среды. Среду немедленно равномерно перемешивают вращательными движениями и оставляют для застывания в горизонтальном положении.

4.2.3. После застывания питательной среды посевы инкубируют, поставив чашки дном вверх, при 30 °C в течение 72 часов. При необходимости предварительный учет производят через 48 ч.

4.2.4. Количество колоний подсчитывают на каждой из засеянных чашек. Счет колоний на чашках производят с помощью прибора для счета колоний бактерий или лупы. Для лучшей видимости считают колонии на темном фоне (под чашку кладут темную бумагу), чашки помещают дном вверх, каждую колонию отмечают на дне чашки чернилами или тушью.

4.2.5. В соответствии с СТ СЭВ 4247-83 «Метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посевом в агаризованную среду» и СТ СЭВ 3015-81 «Принципы культивирования микроорганизмов и способы обработки результатов при микробиологических испытаниях» количество микроорганизмов в 1 г продукта вычисляют умножением средней арифметической величины числа колоний во всех посевах одного разведения навески на величину этого разведения и делением полученного числа на количество посевного материала (массу, объем).

4.3. Определение бактерий группы кишечных палочек

4.3.1. Для приведения в соответствие показателя БГКП с принятой международной номенклатурой (coliformes — ФАО/ВОЗ и СЭВ), а также с действующим ГОСТ 2874-82 «Вода питьевая» к БГКП отнесены грамотрицательные, не образующие спор палочки, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа при температуре (36 +/- 1) °C, являющиеся цитохромоксидазаотрицательными.

4.3.2. Для определения БГКП требуемое количество продукта (1 г, 0,1 г или 0,01 г) вносят в пробирки с одной из следующих сред: среду Кесслера с лактозой и поплавком, лактозо-пептонную среду (ЛПС) с поплавком, элективную среду КОДА.

Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч.

4.3.3. Из газ-положительных пробирок со средой Кесслера, из пробирок со средой ЛПС с образовавшейся кислотой и газом (а также из пробирок с образовавшейся кислотой, но без газа или с наличием газа при слабом образовании кислоты) производят подтверждающий высев на плотную дифференциальную среду Эндо. Посевы инкубируют при температуре 37 °C в течение 18 — 24 ч.

При росте на среде КОДА последняя из сине-фиолетовой становится ярко-зеленой, зеленой или желтой во всей пробирке. При наличии признаков роста на среде КОДА дают заключение о несоответствии продукта нормативу на БГКП.

4.3.4. При наличии на среде Эндо темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых и бесцветных колоний их принадлежность к БГКП подтверждают постановкой цитохромоксидазного теста и микроскопированием окрашенных по Граму мазков. Бесцветные колонии могут также принадлежать патогенным представителям семейства энтеробактерий, поэтому рекомендуется такие колонии отсевать в пробирки с полужидким агаром (инкубация посевов 24 ч при 37 °C) и передавать санэпидстанции для идентификации.

4.3.5 Постановка цитохромоксидазного теста

Цитохромоксидазный тест является одним из тестов, позволяющих дифференцировать БГКП от вибрионов, аэромонад, псевдомонад и других цитохросоксидазаположительных бактерий.

При постановке цитохромоксидазного теста бактериологической петлей (нихромной или платиновой) наносят каплю смеси растворов (см. п. 6.10.4) на микробный газон или колонию. Через несколько минут при положительной реакции появляется голубое окрашивание, при отрицательной реакции цвет бактериальной массы не изменяется.

Модификация Ковача: указанной ранее смесью пропитывают фильтровальную бумагу, на которую наносят небольшими штрихами бактериальную массу. При положительном результате наблюдается посинение нанесенного мазка.

4.3.6 Окраска по Граму

Окраска по Граму производится в соответствии с ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

4.3.7 Окраска по Граму в модификации Хукера

Окраску по Граму в модификации Хукера производят в соответствии с СТ СЭВ 3834-82 «Метод определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов».

Метод наиболее предпочтителен.

4.3.8 Окраска по Граму и модификации Г.П. Калины

На предметное стекло, тщательно протертое спиртом, наносят с лицевой стороны стекла карандашом для стекла квадраты по числу мазков.

При исследовании роста на плотных средах наносят бактериологической петлей каплю дистиллированной воды, в нее вносят небольшое количество исследуемой культуры, затем одну каплю красителя А и все тщательно смешивают. Оставляют на несколько минут для подсыхания (не подогревать над горелкой), после чего фиксируют трехкратным проведением над пламенем горелки. Препарат промывают дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой и наливают краситель Б. Продолжительность второй окраски от 0,5 до 5 мин. Затем препарат промывают дистиллированной водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют. Растворы А и Б готовят по прописи, указанной в п. 6.10.5.

4.3.9. Для накопления данных рекомендуется параллельно проводить определение БГКП методом наиболее вероятного числа (НВЧ). Посев и расчет НВЧ проводят в соответствии с «Методическими указаниями по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами», утвержд. Минздравом СССР 31 декабря 1982 г., и по табл. 4.1 настоящей Инструкции.

ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ 3-Х ПРОБИРОК

4.3.10 Определение БГКП в морской воде титрационным методом

При исследовании морской воды из районов выращивания мидий рекомендуется титрационный метод определения БГКП, который позволяет получать более точные и стабильные результаты.

Объемы морской воды для посева в среду накопления ЛПС выбирают с таким расчетом, чтобы в больших объемах получить положительный результат, а в наименьших объемах — один или несколько отрицательных результатов. Например, 2 объема по 10 куб. см, 2 по 1,0 куб. см и 2 по 0,1 куб. см или 2 x 100 куб. см, 2 x 10 куб. см, 2 x 1,0 куб. см. Объемы 100 куб. см и 10 куб. см засевают соответственно в 10 куб. см и 1,0 куб. см объемов концентрированной ЛПС (все ингредиенты, кроме воды, увеличены в 10 раз), остальные объемы засевают в ЛПС нормальной концентрации. Дальнейший ход исследований производится как изложено в п. п. 4.3.2 - 4.3.8. Число БГКП в 1 куб. дм морской воды (коли-индекс) вычисляют по табл. 4.2. Для расчета выбирают 3 таких последовательных десятикратных разведения или объема воды, в которых получены положительные и отрицательные результаты.

Таблица 4.2

РАСЧЕТ ЧИСЛА БАКТЕРИЙ В 1 КУБ. ДМ ВОДЫ (ПО ХОСКИНСУ-МУРУ)

4.3.11 Определение БГКП в морской воде методом мембранных фильтров

БГКП в морской воде можно определять методом мембранных фильтров. Сущность метода заключается в концентрации бактерий из определенного объема анализируемой воды на мембранные фильтры, выращивании их на среде Эндо, дифференцирования выросших колоний и подсчета БГКП в 1 куб. дм морской воды.

При выборе объема воды для посева исходят из предполагаемой степени загрязнения исследуемой воды: при исследовании чистых вод фильтруют 50, 40 и 10 куб. см, при исследовании загрязненных вод фильтруют 10, 1,0 и 0,1 куб. см из расчета, чтобы на одном-двух фильтрах выросло не более 30 изолированных колоний. Выбирая объем воды, ориентируются на результаты предыдущих анализов воды в этих участках. При анализе воды неизвестной степени бактериального загрязнения засевают 4 десятикратных объема воды.

Выбранные объемы воды профильтровывают под вакуумом через мембранные фильтры с использованием фильтровального аппарата, простерилизованного фламбированием.

Фильтры с осевшими на них бактериями переносят на среду Эндо и инкубируют посевы в термостате 18 — 20 ч при температуре 37 °C.

Для учета результатов выбирают только такие фильтры каждой пробы воды, на которых получен рост изолированных колоний в оптимальном количестве (например, 5 — 20 темно-красных колоний).

Определяют цитохромоксидазную активность выросших колоний (см. п. 4.3.5), из цитохромоксидазаотрицательных темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых колоний, дающих отпечаток на обратной стороне фильтра, готовят мазки, окрашивая их по Граму (см. п. п. 4.3.6 - 4.3.8) и микроскопируют.

В сомнительных случаях по 2 — 3 колонии каждого типа пересевают в полужидкую среду с лактозой. Посевы инкубируют в течение 5 — 6 ч при температуре 37 °C. При наличии кислоты и газа через 5 ч дают положительный ответ, при отсутствии изменения среды — отрицательный, при наличии только кислоты посевы оставляют в термостате и окончательный учет производят через 24 ч.

Результат анализа выражают в виде индекса — количества БГКП в 1 куб. дм морской воды. Индекс определяют по формуле:

                             n x 1000

--------, y

где:

n — число БГКП на фильтре,

y — объем воды, профильтрованной через этот фильтр, в куб. см.

4.3.12 Определение фекальных кишечных палочек

При повышенной обсемененности исследуемого материала БГКП целесообразно определять фекальные кишечные палочки (ФКП), которые являются показателями свежего фекального загрязнения.

При определении ФКП лактозо-пептонная среда или среда Кесслера являются средами накопления. Из пробирок со средой накопления, в которых обнаружен рост, делают высевы по одной петле в пробирки со средой для определения фекальных кишечных палочек (ФКП-1) и с поплавками. Можно делать посевы и с секторов среды Эндо (по 1 — 2 колонии с каждого сектора).

После посева материала в пробирки со средой ФКП-1 между пробкой и стенкой пробирки помещают индикаторные бумажки на индол (см. п. 6.10.6).

Инкубация посевов при 43 °C в течение 24 ч. Учет результатов производят по пробиркам, в которых образовался газ и индол.

Индол можно определять и реактивом Ковача после инкубации посева (см. п. 6.10.7).

Фекальные кишечные палочки определяют также в лактозной среде с борной кислотой или с бриллиантовым зеленым в соответствии с ГОСТ 18963-73 «Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа».

4.4. Определение энтерококков

4.4.1. Общепринятым дополнительным показателем фекального загрязнения являются энтерококки. Энтерококки введены в ряде стран в стандартные методы исследования качества питьевой и морской воды. При проведении бактериологических исследований определяют всю группу энтерококков, хотя санитарное значение имеют преимущественно фекальные стрептококки (Streptococcus faecalis), являющиеся показателем свежего фекального загрязнения.

Для определения энтерококков в мидиях требуемое количество гомогената (1,0 г, 0,1 г или 0,01 г) вносят в пробирки со щелочно-полимиксиновой средой (ЩЭС).

4.4.3. Посевы инкубируют при температуре 37 °C в течение 24 ч. При отсутствии роста за этот период (помутнение среды, изменение цвета среды в зеленый или желтый) пробирки оставляют при 37 °C еще на 24 ч.

4.4.4. Из пробирок ЩЭС с наличием роста производят высев штрихом на плотную молочно-ингибиторную среду (МИС) с теллуритом калия или на МИС с трифенилтетразолхлоридом (ТТХ). МИС с теллуритом калия более предпочтительна.

4.4.5. Энтерококки образуют на среде МИС с теллуритом калия черные, мелкие сероватые, а иногда почти бесцветные колонии. Причем фекальные стрептококки образуют только черные крупные с металлическим блеском, выпуклые с ровными краями колонии, в отдельных случаях эти колонии могут быть окружены прозрачной зоной протеолиза. Протеолитический вариант фекальных стрептококков может вызывать пищевые токсикоинфекции.

На среде МИС с ТТХ энтерококки образуют темно-красные, розовые или бесцветные колонии с розовым центром, а фекальные стрептококки образуют только темно-красные со светлым ободком и ровными краями колонии, иногда с зоной протеолиза.

4.4.6. Из колоний, выросших на МИС, делают мазки, опрашивают их по Граму (см. п. п. 4.3.6 - 4.3.8) и микроскопируют.

При обнаружении грамположительных, полиморфных, вытянутых с заостренными концами диплококков, образующих короткие, а иногда и довольно длинные цепочки, можно считать наличие энтерококков подтвержденным.

4.4.7. Для накопления данных в качестве дополнительных исследований рекомендуется параллельно проводить определение энтерококков методом НВЧ: посев 3-х объемов последовательных разведений продукта в ЩЭС, исследования согласно п. п. 4.4.3 - 4.4.6, расчет НВЧ по табл. 4.1.

4.4.8 Определение энтерококков в морской воде титрационным методом

Исследуемые объемы воды, в зависимости от предполагаемой степени загрязнения, вносят: объемы 100 куб. см и 10 куб. см морской воды в равные объемы ЩЭС двойной концентрации, а остальные объемы и разведения — в пробирки со ЩЭС обычной концентрации. Дальнейшие определения проводят, как указано выше. Индексы энтерококков рассчитывают по табл. 4.2.

Метод рекомендуется как основной.

4.4.9 Определение энтерококков в морской воде методом мембранных фильтров

Объемы морской воды для посева выбирают с таким расчетом, чтобы не менее чем на 2-х фильтрах выросли изолированные колонии в количестве не более 30. При выборе объема воды для посева ориентируются на результаты предыдущих исследований. Например, 40 куб. см и 10 куб. см, и 1,0 куб. см и т.д.

Фильтры с посевами помещают на модифицированную среду Сланеца-Бертли или на среду Турчинского и инкубируют при 37 °C в течение 24 ч.

Для учета выбирают фильтры, на которых выросли изолированные колонии в количестве не более 30. На модифицированной среде Сланеца-Бертли подсчитывают колонии, характерные для энтерококков — выпуклые с ровными краями и различной окраски: темно-вишневые, малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным, нечетко оформленным центром. Как правило, все колонии, которые растут на этой среде, можно отнести к фекальным стрептококкам. Очень мелкие, плоские, на пределе видимости невооруженным глазом колонии не учитывают. При необходимости подтвердить наличие энтерококков по 2 — 3 колонии каждого типа окрашивают по Граму и микроскопируют (см. п. 4.4.5).

При работе со средой Турчинского выбирают фильтры, на которых выросло не более 20 — 30 колоний. Подсчитывают колонии белые, кремовые, розовые и малиновые, плоские и крупные. Если выросли колонии другого цвета — выпуклые, белые, мелкие, ярко окрашенные, то их принадлежность к энтерококкам можно подтвердить по отсутствию каталазной активности и характерной морфологии клеток при микроскопировании мазков, окрашенных по Граму.

Каталазные тесты выполняют путем нанесения бактериологической петлей капли 3% перекиси водорода на колонии или, что более точно, нанося культуру на предметное стекло и после подсыхания — каплю перекиси водорода. При образовании пузырьков газа — наличие активной каталазы — колонии не учитывают.

Подсчитанное число энтерококков суммируют, делят на объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых проводился учет, и умножают на 1000.

Метод мембранных фильтров рекомендуется как дополнительный.

4.5. Определение мезофильных анаэробных споровых микроорганизмов

4.5.1. К мезофильным анаэробным споровым микроорганизмам (преимущественно сульфитредуцирующим клостридиям) относятся мезофильные грамположительные палочки, образующие споры в анаэробных условиях и восстанавливающие сульфиты.

4.5.2. По 1 куб. см первого разведения исследуемого продукта засевают в 2 параллельные пробирки с предварительно регенерированной средой Китт-Тароцци (прогревание в течение 25 мин. на кипящей водяной бане и быстрое охлаждение до 40 °C), свежеприготовленную среду применяют без прогрева. После посева среду заливают стерильным вазелиновым маслом или голодным агаром (высота слоя 1 см). Можно использовать агаризованную среду Китт-Тароцци (0,15% агара). Одну из пробирок прогревают в водяной бане при 80 °C в течение 20 мин. для термоактивации спор и уничтожения вегетативных форм клеток. Затем посевы помещают в термостат и инкубируют при 37 °C в течение 24 — 48 ч.

4.5.3. Из посевов, в которых обнаружен рост, готовят мазки, окрашивают их по Граму и микроскопируют. Материал для приготовления препарата берут пастеровской пипеткой со дна пробирки. При микроскопировании отмечают наличие крупных грамположительных палочек с овальными спорами, расположенными центрально или субтерминально, или без спор.

4.5.4. Для подтверждения принадлежности выделенных микробов к анаэробам-сульфитвосстановителям со дна пробирок, в которых наблюдается рост, берут 1 — 2 капли культуры и вносят в стерильные чашки Петри, заливают расплавленным и охлажденным до 45 °C агаром Вильсона-Блера, тщательно перемешивают. Застывшую поверхность заливают голодным агаром — слой не менее 2 мм. Высевы инкубируют при 37 °C в течение 24 — 48 ч. Появление в агаре черных колоний или почернение среды вокруг колоний указывает на присутствие сульфитредуцирующих клостридий.

4.5.5. Одновременно производят посев в молоко или лакмусовое молоко. Через 6 — 8 ч при 46 °C в присутствии клостридий в молоке происходит образование губкообразного сгустка и отделение прозрачной сыворотки. Цвет сгустка в лакмусовом молоке красновато-сиреневый.

4.5.6 Определение сульфитредуцирующих клостридий в элективной среде Сидоренко — Пивоварова

Для экспрессного определения рекомендуется метод Г.И. Сидоренко и Ю.П. Пивоварова.

Посев исследуемого количества продукта производят в 9 куб. см сульфитполимиксиннеомициновой среды Сидоренко — Пивоварова (СПН). Среду СПН предварительно расплавляют на водяной бане, избегая разрушения антибиотиков, и во время посева поддерживают нагретой до 50 — 60 °C. Посевы инкубируют при 45 — 46 °C в течение 4 — 16 ч. Учет результатов ведут по почернению среды в пробирке или росту черных колоний.

Для определения сульфитредуцирующих клостридий в споровой форме исследуемое разведение продукта прогревают при 80 °C в течение 20 мин., после чего быстро охлаждают под струей холодной воды. Дальнейший ход анализа такой же, как и при посеве непастеризованной пробы.

Высокоэлективная среда СПН не требует дальнейших подтверждающих посевов.

4.6. Определение сальмонелл

4.6.1. Исследования на сальмонеллы проводят бактериологические лаборатории территориальных санэпидстанций на договорных началах в соответствии с инструкциями, утвержденными Минздравом СССР и «Методическими указаниями по определению сальмонелл в экспортной продукции (свежей, мороженой, соленой, копченой рыбе, филе, фарше, икре, кормовой муке и пр.», утвержд. Минрыбхозом СССР 7 апреля 1980 г.

4.6.2 Ускоренный метод определения сальмонелл (разработан МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана)

Наличие сальмонелл определяют, используя жидкие среды накопления с высевом на плотные элективные среды, выделением чистых культур, биохимической и серологической идентификацией.

4.6.2.1. Исследуемое количество гомогената продукта (25 куб. см) засевают в 100 куб. см магниевой среды накопления.

Исследуемое количество морской воды фильтруют через мембранные фильтры, которые вносят затем во флаконы с 25 куб. см магниевой среды.

Посевы инкубируют при 37 °C в течение 20 — 24 ч.

4.6.2.2. После инкубации посевов по 1 капле из каждой емкости высевают на 1 — 2 чашки с висмут-сульфитным агаром (ВСА). Посевы на ВСА инкубируют при 37 °C в течение 24 ч.

На ВСА сальмонеллы вырастают в виде черных колоний с металлическим блеском, просвечивающих с обратной стороны. Некоторые биовары сальмонелл, не продуцирующие сероводорода, могут вырастать в виде зеленых колоний. В ряде случаев развитие колоний сальмонелл замедленно и требует дополнительной суточной инкубации чашек с посевами. Для получения достоверных результатов необходимо отсеивать с ВСА возможно большее число колоний.

4.6.3. С ВСА производят высев на двуслойную универсальную комплексную среду (ДУКС-5). Посев производят штрихом по скошенной поверхности и уколом в толщу столбика. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. При росте сальмонелл происходят изменения в среде ДУКС: желтое или зеленое окрашивание столбика, малиновое окрашивание скошенной поверхности, образование газа и сероводорода (последнее не обязательно при посеве зеленых колоний).

4.6.4 Изучение серологических свойств сальмонелл

Изучение серологической структуры сальмонелл производят с помощью постановки реакции агглютинации на стекле с поливалентными и монорецепторными агглютинирующими адсорбированными сальмонеллезными сыворотками.

Сухие сыворотки перед употреблением растворяют согласно наставлению по применению, вкладываемому в каждый набор сывороток.

Для реакции агглютинации с О-сыворотками берут односуточную культуру в верхней части, с Н-сыворотками — с нижней части скошенного питательного агара, так как внизу находятся самые подвижные особи. Вначале при помощи поливалентной сальмонеллезной С-сыворотки устанавливают принадлежность исследуемой культуры к одной из серологических групп сальмонелл. Для определения серологического типа культуры используют Н-монорецепторные сыворотки первой и второй фаз.

4.7. Определение патогенных галофильных вибрионов

4.7.1. В последние годы в ряде стран мира в качестве возбудителя кишечных инфекций, протекающих по типу пищевой токсикоинфекции, стал широко фигурировать представитель группы галофильных вибрионов — Vibrio parahaemolyticus, мезофильный факультативный анаэроб, имеющий вид прямых или слегка изогнутых подвижных грамотрицательных палочек, не образующий спор и капсул, цитохромоксидазаположительный, не способный к размножению в отсутствие натрия хлорида и устойчивый к концентрации этой соли от 3 до 8%. Данный микроорганизм широко распространен в воде морей и океанов, вследствие чего часто обнаруживается на продуктах питания морского происхождения, с которыми связаны заболевания указанной этиологии.

Исследования на патогенные галофильные вибрионы проводят бактериологические лаборатории территориальных санэпидстанций на договорных началах и в порядке Государственного санитарного надзора в соответствии с методическими указаниями Минздрава СССР.

4.7.2. Для определения патогенных галофильных вибрионов 25 куб. см гомогената исследуемого продукта засевают в колбу с 100 куб. см 1% пептонной воды с 3% натрия хлорида. В исследуемое количество морской воды добавляют 10% основного раствора пептона для получения 1% пептонной воды. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 16 — 18 ч.

4.7.3. После инкубации независимо от наличия роста с поверхности среды накопления делают посев на одну из плотных элективных дифференциальных сред: агар с вторичными алкилсульфатами натрия, дифференциально-диагностический агар (ДДА), цветную среду Касаткина, ТСВ в модификации Московской горСЭС. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 16 — 24 ч.

4.7.4. Парагемолитические вибрионы образуют на средах, содержащих сахарозу и индикатор бромтимоловый синий, плоско-выпуклые полупрозрачные колонии, круглые с ровными краями, окрашенные в цвет среды (сине-зеленые) от 1 до 5 мм диаметром, а алгинолитические — желтые неправильной формы.

При наличии характерных колоний на следующем этапе определяют принадлежность их вибрионам.

4.7.5 Тесты окисления — ферментации глюкозы

Способность выделенных штаммов окислять и ферментировать глюкозу определяют на среде Хью-Лейфсона с 3% натрия хлорида. Каждый штамм засевают в две пробирки, после чего в одну из них вносят примерно 0,5 куб. см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. При окислении глюкозы окраска среды изменяется из зеленого в желтый цвет в пробирке без вазелинового масла, при ферментации — в пробирке с маслом.

Вибрионы окисляют и ферментируют глюкозу, псевдомонады — только окисляют.

4.7.6 Определение подвижности

Подвижность можно определить несколькими способами.

4.7.6.1. Колонии, отобранные с плотных элективно-дифференциальных сред, засевают в 1% пептонную воду с 3% натрия хлорида или на щелочной агар с 3% натрия хлорида. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. Затем готовят препарат «раздавленная капля». При микроскопировании наблюдается активное перемещение подвижных клеток в поле зрения.

4.7.6.2. Исследуемые штаммы засевают уколом в столбик 0,25% — 0,3% питательного агара. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. Подвижные штаммы образуют диффузное помутнение всего столбика, неподвижные и слабо подвижные вырастают только по ходу укола.

4.7.7 Цитохромоксидазный тест (см. п. 4.3.5).

4.7.8 Окраска по Граму (см. п. п. 4.3.6 - 4.3.8)

При наличии грамотрицательных, активно подвижных коротких прямых или слегка изогнутых палочек, обладающих цитохромоксидазной активностью, проводят дальнейшие исследования.

4.7.9 Определение степени галофилии

Способность выделенных штаммов к росту на пептонной воде с различным содержанием натрия хлорида является важным дифференциальным признаком при их идентификации. Для определения степени галофилии по одной капле 3 — 4 часовой культуры засевают в пробирки с 5 куб. см 1% пептонной воды, содержащей 0%, 8% и 10% натрия хлорида. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч. Рост определяют по помутнению среды.

Парагемолитические вибрионы не растут в среде без натрия хлорида и хорошо растут с 8% натрия хлорида, а алгинолитические — с 8% и 10% натрия хлорида. Иногда выделяют парагемолитические вибрионы, способные к росту в присутствии 10% натрия хлорида.

4.7.10 Ферментация углеводов и спиртов

Парагемолитические вибрионы обладают небольшим периодом генерации, что позволяет в короткий срок определять их биохимическую активность в отношении различных углеводов и спиртов. Из широкого набора углеводов и спиртов диагностическое значение имеют ферментация маннита, сахарозы, арабинозы, маннозы и инозита.

Ферментативную активность выделенных штаммов определяют на средах Гисса, содержащих 3% натрия хлорида. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. При посеве густой бактериальной суспензии результаты можно учитывать уже через 6 ч.

О ферментации судят по изменению цвета среды в пробирках, об образовании газа — по наличию пузырьков в толще полужидкой среды или в поплавках. Ферментация сопровождается подкислением среды и изменением ее цвета в желтый при использовании в качестве индикатора бромтимолового синего и ярко-розовый — с индикатором Андреде.

Для парагемолитических вибрионов характерна ферментация без газообразования глюкозы, маннита, маннозы, в 64% случаев арабинозы, для алгинолитических — глюкозы, маннита, маннозы, сахарозы.

По модификации Крымской противочумной станции можно ограничиться только определением маннозы, сахарозы и арабинозы (определение ферментативных групп по Хейбергу и Баруа). Парагемолитические вибрионы относятся к 7-ой группе (в ряде случаев к 5-ой группе) по Хейбергу — Баруа, алгинолитические — к 1-ой группе.

4.7.11 Определение протеолитической активности

Наличие протеолитической активности определяют посевом исследуемых штаммов в желатин. Посев производят уколом в столбик желатина. Инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. Затем пробирки с посевами и контрольную пробирку на некоторое время (20 — 30 мин.) помещают в холодильник. При положительном результате желатин гидролизуется и поэтому при выдерживании в холодильнике гель не образуется, в контрольной пробирке желатин затвердевает. Парагемолитические вибрионы обладают протеолитической активностью.

4.7.12 Образование индола

Выявление способности образовывать индол определяют на 1% пептонной воде с 0,03% триптофана и 3% натрия хлорида. Штаммы засевают в пробирки и под ватно-марлевые пробирки вставляют реактивные бумажки на индол. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. Наличие индола в среде можно определить также при помощи реактива Эрлиха или Ковача. Появление в среде красного кольца или красного окрашивания после вынесения одного из реактивов и инкубации при 37 °C в течение 1 ч свидетельствует о наличии индола.

Парагемолитические вибрионы дают позитивную индольную реакцию.

4.7.13 Реакция с метиловым красным (реакция Кларка)

Для определения интенсивности кислотообразования штаммы засевают в пробирки с 1 куб. см среды Кларка с 3% натрия хлорида. Инкубацию посевов производят при 37 °C в течение 18 — 24 ч, после чего в пробирки прибавляют 2 — 3 капли 0,04% раствора метилового красного (0,04 г метилового красного растворяют в 40 куб. см этилового спирта и 60 куб. см дистиллированной воды). Пробирки хорошо встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. При сильном кислотообразовании среда окрашивается в красный цвет, при слабом — в желтый.

Парагемолитические вибрионы в 84% случаев дают положительную реакцию.

4.7.14 Определение способности образовывать ацетилметилкарбинол (ацетоин) — реакция Фогес-Проскауэра

После учета результатов реакции Кларка в тех же пробирках можно определить продукцию ацетоина. В пробирки прибавляют 2 — 3 капли реактива Баррита (6% спиртового раствора альфа-нафтола) и 1 каплю 40% водного раствора едкого калия. Пробирки хорошо встряхивают и помещают на 1 ч в термостат. При положительной реакции наступает розовое или рубиново-красное окрашивание среды.

Парагемолитические вибрионы дают отрицательную реакцию в этом тесте, алгинолитические — положительную.

4.7.15 Определение декарбоксилазной активности

Декарбоксилазная активность выделенных штаммов является важнейшим дифференциальным признаком, позволяющим отличить парагемолитические вибрионы от сходных с ними по свойствам аэромонад.

Декарбоксилазную активность галофильных вибрионов определяют на модифицированной среде ДАГВ с аминокислотами. По 2 капли исследуемой суточной культуры, бульонной или агаровой, засевают в 3 пробирки с 2 куб. см среды ДАГВ. Одна служит контролем, две другие содержат аминокислоты: аргинин и лизин. После посевов в каждую пробирку для создания анаэробных условий вносят 0,5 куб. см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 24 ч. Штаммы, у которых отсутствуют декарбоксилазы указанных аминокислот, не расщепляют аминокислоты, но окисляют глюкозу, что приводит к изменению окраски в желтый цвет, который сохраняется в течение всего времени наблюдения как в опытах, так и в контрольных пробирках. При наличии декарбоксилаз после окисления глюкозы и перехода окраски среды в желтый цвет начинается подщелачивание среды за счет разложения аминокислот, и среда вновь приобретает темно-фиолетовую окраску.

Вибрионы дают лизин-декарбоксилазную положительную реакцию и аргинин-дигидролазную отрицательную реакцию.

4.7.16 Определение гемолитической активности.

Способность парагемолитических вибрионов гемолизировать эритроциты человека или кролика на кровяном агаре, содержащем 7% натрия хлорида, коррелирует с энтеропатогенными свойствами этих микроорганизмов.

Для определения гемолитической активности используют среду Багатсума или кровяной агар в модификации, предложенной Ю.И. Григорьевым с соавторами (1975 г.).

4.8. Определение коагулазоположительных стафилококков

Исследования на коагулазоположительные стафилококки проводят бактериологические лаборатории территориальных санэпидстанций на договорных началах в порядке Государственного санитарного надзора.

4.8.1. Исследуемое количество продукта (1 г) вносят в пробирку с 9 куб. см солевого рыбо-пептонного бульона (6,5% натрия хлорида). Инкубируют при 37 °C в течение 24 — 48 ч.

4.8.2. При появлении роста в пробирке делают мазок, окрашивают его по Граму и микроскопируют. Наличие грамположительных мелких кокков, расположенных гроздями, дает основание для дальнейших исследований на стафилококки.

4.8.3. Из среды обогащения производят посев на молочно-солевой агар (МСА) или желточно-солевой агар (ЖСА). Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч.

4.8.4. На МСА стафилококки растут в виде непрозрачных колоний белых, золотистых, кремовых, эмалево-белых, лимонно-желтых, имеющих форму правильных дисков от 2 до 4 мм в диаметре, слегка выпуклых. На ЖСА колонии стафилококков через 24 ч окружены зоной лецитиназной активности, некоторые коагулазоположительные стафилококки зону лецитиназной активности могут не образовывать.

Из колоний, выросших на МСА или ЖСА, готовят препараты, окрашивают их по Граму и микроскопируют. При наличии характерной для стафилококков микроскопической картины эти колонии отсевают на скошенный агар (не менее 5 — 7 колоний) для поставки реакции плазмокоагуляции. Посевы на скошенном агаре инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч.

4.8.5 Реакция плазмокоагуляции

Реакцию плазмокоагуляции ставят с односуточной культурой. Для этой реакции используют цитратную плазму (лучше кроличью). Сухая кроличья плазма производится по адресу: БССР, г. Минск, ул. Ногина, д. 3. Предприятие по производству бактериальных препаратов Белорусского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

Сухую кроличью плазму разводят изотоническим раствором натрия хлорида в пропорции 1:5 (1 куб. см плазмы + 4 куб. см, изотонического раствора натрия хлорида). В пробирку с 0,5 куб. см разведенной плазмы вносят петлю суточной культуры стафилококка, контрольную пробирку не инфицируют. Пробирки помещают в термостат при температуре 37 °C. Учет результатов плазмокоагуляции производят уже через 2 ч. Реакция считается положительной, если сгусток образовался в течение 24 ч.

Патогенные стафилококки коагулируют цитратную плазму крови человека и животных.

5. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Дополнительные микробиологические исследования рекомендуется проводить баклабораториям санэпидстанций и научно-исследовательских учреждений в порядке накопления данных по распространению и количеству таких потенциально патогенных микроорганизмов, как аэромонады, преимущественно анаэрогенные, и эдвардсиеллы. Наличие этих бактерий имеет также санитарно-показательное значение.

5.1. Определение аэромонад

Аэромонады (семейство Vibrionaceae род Aeromonas) в настоящее время в практических целях разделяют в соответствии с различной ферментацией ими углеводов на 2 основные группы: аэрогенные аэромонады, ферментирующие глюкозу с образованием газа, и анаэрогенные аэромонады, ферментирующие глюкозу без образования газа. Наибольшее значение как возбудители пищевых токсикоинфекций, так и при определении биологического загрязнения имеют анаэрогенные аэромонады. Методы обнаружения, количественного учета, упрощенной и ускоренной идентификации аэромонад разработаны в МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана Г.П. Калиной и Т.И. Графовой (1980 г.).

5.1.1. Исследования доводят путем посева десятикратных разведений гомогената продукта (начиная с 1,0 г) в два параллельных ряда со средой А-1 (объем засеваемого продукта не должен превышать 10% объема среды).

При анализе морской воды исследуемые объемы, в зависимости от степени предполагаемого обсеменения, вносят: объемы 100 куб. см и 10 куб. см соответственно в 10 куб. см и 1 куб. см концентрированной среды А-1 (все ингредиенты, кроме воды, увеличены в 10 раз), а остальные объемы и разведения — в среду А-1 нормальной концентрации. Инкубация посевов при 30 °C в течение 24 ч.

5.1.2. Из всех емкостей со средой А-1, независимо от наличия или отсутствия роста микробов, производят посев штрихом на сектора среды А-2 (не более 3 — 4-х секторов на одной чашке), среду А-1 после первичного высева инкубируют дополнительно 24 ч, после чего высев на среду А-2 производят повторно из емкостей, в которых при первом высеве отсутствовали следы роста. Посевы на среде А-2 инкубируют при 30 °C в течение 42 — 48 ч.

5.1.3. Аэромонады образуют на среде А-2 крупные красные колонии с узким бесцветным ободком, окруженные зоной помутнения за счет гидролиза желатина. Колонии псевдомонад более бледные, часто бесцветные, вибрионы и представители семейства энтеробактерий не развиваются на этой среде или дают рост очень мелких, иногда различимых только при помощи лупы, бесцветных колоний.

5.1.4. Межродовую и межвидовую дифференциацию штаммов, образующих на среде А-2 характерные для аэромонад колонии, проводят с помощью 9 тестов, используя 3 комплексные дифференциальные среды: среду А-3 для определения гидролиза желатина, цитохромоксидазного теста, продукции пигмента, а также проверки чистоты выделенной культуры; среду А-4 для определения оксидации и ферментации по Хью-Лейфсону, газообразования из глюкозы, подвижности; среду А-5 для определения ферментации ксилозы и маннита.

Колонии со среды А-2 засевают штрихом на сектор среды А-3 (не более 3 — 4 секторов на чашке), уколом до дна пробирки в среду А-4, штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик среды А-5. После инкубируют при 30 °C в течение 18 — 20 ч.

<...> А-3 отдельные колонии аэромонад выражены зоной помутнения (гидролиз желатина), хорошо заметной в отраженном свете. Через 2 — 4 дня хранения чашей при комнатной температуре может появиться желтоватый пигмент разной интенсивности. Колонии псевдомонад рано начинают продуцировать зеленый пигмент.

5.1.6 Цитохромоксидазные тесты (см. п. 4.3.5).

5.1.7 Окраска по Граму (см. п. п. 4.3.6 - 4.3.8).

Аэромонады — грамотрицательные клетки от палочковидных с заостренными концами до конковидных, прямые, иногда образуют нити, встречаются поодиночке, в парах или в цепочках.

5.1.8. В среде А-4 учитывают подвижность (по скошенному помутнению верхнего слоя), газообразование (пузырьки газа в обоих слоях), ферментацию глюкозы (желтая окраска нижнего пласта и оксадацию (желтая окраска верхнего слоя) по Хью-Лейфсону.

5.1.9. В среде А-5 учитывают ферментацию маннита, определяемую по изменению цвета столбика в желтый, отсутствие ферментации ксилозы — малиновый цвет скошенной поверхности.

5.1.10. Для дифференциации аэрогенных аэромонад от вибрионов определяют декарбоксилазную активность (см. п. 4.7.15).

Аэромонады дают отрицательную лизин-декарбоксилазную реакцию и положительную аргинин-дигидролазную реакцию.

5.1.11 Расчет индексов аэромонад производят по табл. 4.3.

5.2. Определение эдвардсиелл

Методика упрощенного и ускоренного определения эдвардсиелл разработана проф. Г.П. Калиной.

5.2.1. Исследования на эдвардсиеллы проводят в 2-х параллельных рядах путем посева в среду накопления десятикратных разведений продукта или морской воды. Посевы больших объемов морской воды производят в равные объемы среды накопления удвоенной концентрации. В качестве сред накопления для эдвардсиелл применяют среды ЕЕ и Эт-1. Посевы в средах накопления инкубируют при 37 °C в течение 18 — 24 ч.

5.2.2. При наличии помутнения и желтого окрашивания среды накопления производят высев на сектора среды Эт-2. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 22 — 24 ч (иногда необходима дополнительная инкубация 18 — 20 ч). Эдвардсиеллы образуют на Эт-2 небольшие росовые с точечным черным центром колонии. Такой же центр, но более сероватый, как бы покрытый слоем клеток, могут образовывать протеи. Важное условие для успешного результата — посев должен быть разреженный, чтобы росли изолированные колонии, в густом росте черный цвет не образовывается.

5.2.3 Цитохромоксидазный тест (см. п. 4.3.5).

5.2.4 Окраска по Граму (см. п. п. 4.3.6 - 4.3.9).

5.2.5. Определение продукции индола, сероводорода и лизин-дикарбоксилазы, отсутствие ферментации маннита и ксилозы, а также уреазной активности, ферментации глюкозы с образованием кислоты и газа.

Эти 7 признаков определяют в двуслойной среде Эт-3. Посев производят штрихом по поверхности и уколом в столбик. После посева между стенкой пробирки и пробкой вставляют реактивную бумажку на индол (см. п. 6.10.6). Инкубация посевов при 37 °C в течение 18 — 20 ч.

Эдвардсиеллы растут, изменяя цвет столбика в желтый или оранжевый (положительная лизин-дикарбоксилазная реакция), продуцируют газ в виде пузырьков в толще среды, образуют сероводород — черное кольцо на границе нижнего и верхнего слоя, изменяют цвет скошенной поверхности в малиновый и продуцируют индол (покраснение индикаторной бумажки).

5.2.6 Расчет индекса эдвардсиелл производят по табл. 4.2.

6. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И РЕАКТИВЫ

6.1. Среды для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

6.1.1 Пептонная вода (0,1% водный раствор пептона)

К 1 куб. дм дистиллированной воды добавляют 1,0 г пептона. После перемешивания среду кипятят, фильтруют и разливают в пробирки и флаконы в необходимых количествах. Стерилизуют при (120 +/- 1) °C 20 мин.

6.1.2 Изотонический раствор натрия хлорида.

Используют дистиллированную воду с pH 6,9 — 7,0. pH проверяют индикатором бромтимоловым синим, при добавлении которого цвет воды должен быть бутылочно-зеленым. В иных случаях воду не используют. В 1 куб. дм воды растворяют 8,5 г натрия хлорида (NaCl), разливают в пробирки или флаконы, стерилизуют при (120 +/-1) °C 20 мин.

6.1.3 Среда для определения мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

В 1 куб. дм дистиллированной воды растворяют 35,0 г сухого питательного агара производства Дагестанского НИИ питательных сред (ДагНИИПС), 2,5 г сухого экстракта кормовых дрожжей, 1,0 г глюкозы. Кипятят, фильтруют, устанавливают pH 7,0, разливают в пробирки по 15 — 20 куб. см или во флаконы, стерилизуют при (120 +/- 1) °C 20 мин.

6.2. Среды для определения бактерий группы кишечных палочек

6.2.1 Среда Кесслера

К 1 куб. дм дистиллированной воды прибавляют 10,0 г пептона и 50,0 куб. см желчи крупного рогатого скота, кипятят при перемешивании 20 — 30 мин. в водяной бане, фильтруют, растворяют 2,5 г лактозы, доводят объем до 1 куб. дм, устанавливают pH 7,4 — 7,6; добавляют 4 куб. см 1% водного раствора генцианвиолетта. Готовая среда имеет темно-фиолетовый цвет. Разливают в стерильные пробирки с поплавками или комочками ваты. Стерилизуют при (120 +/- 1) °C 15 мин.

Среду Кесслера можно также приготовить из сухого препарата Литовского филиала ВНИИМС по прописи на этикетке.

6.2.2 Лактозо-пептонная среда (ЛПС)

В 1 куб. дм дистиллированной воды растворяют при нагревании 10,0 г пептона и 5,0 г натрия хлорида, фильтруют через бумажный фильтр, добавляют 5,0 г лактозы и 0,2 куб. см 1,6% спиртового или щелочного раствора бромтимолового синего (БГС) до pH 7,4 — 7,6. Разливают по 5 — 7 куб. см в стерильные пробирки с поплавками или кусочками ваты, стерилизуют при (112 +/- 2) °C 15 мин.

6.2.3 Среда КОДА

Готовят из сухого препарата ДагНИИПС по прописи на этикетке.

6.2.4. Полужидкая среда с лактозой и индикатором ВР. Готовят из сухого препарата ДагНИИПС по прописи на этикетке.

6.2.5 Среда Эндо

Готовят из сухого препарата ДагНИИПС по прописи на этикетке.

6.2.6 Среда для определения фекальных кишечных палочек (ФКП-1)

В 100 куб. см дистиллированной воды растворяют при нагревании в водяной бане 1,0 г пептона, 0,1 кг лактозы, 0,1 г маннита, 0,1 г триптофана и 2,0 куб. см желчи, устанавливают pH 7,2 — 7,4, добавляют 1,33 куб. см 0,1% водного раствора бриллиантового зеленого. Стерилизуют при (112 +/- 1) °C 15 мин. Хранят в холодильнике.

6.3. Среды для определения энтерококков

6.3.1 Щелочно-полимиксиновая среда (ЩЭС) Г.П. Калины

    Раздельно  готовят  три  различных  порции.  А: мясо-пептонного бульона
(МПБ)  40,0  куб.  см,  натрия  хлорида  0,5  г,  глюкозы 1,0 г, дрожжевого
экстракта  2,0  куб.  см.  Б:  воды  дистиллированной  25,0 куб. см, натрия
карбоната  (Na CO )  0,53  г. В: воды дистиллированной 25,0 куб. см, натрия
              2  3
гидрофосфата  (Na HPO   x  2H O)  0,25  г.  Растворы  А,  Б,  В   раздельно

             **2   4       2**

стерилизуют  при  (112  +/-  1)  °C  15  мин. После стерилизации смешивают,
прибавляют  20000  ЕД полимиксина (200 ЕД на 1 куб. см среды) и 0,2 куб. см
1,6%  щелочного  раствора  бромтимолового синего, устанавливают pH 10,2 (по

фенолфталеину).

6.3.1.1 Дрожжевой экстракт по Г.П. Калина

1000 г прессованных (пекарских) дрожжей распределяют равномерно в 2,0 куб. дм дистиллированной воды, нагревают текучим паром 30 мин., отстаивают в холодильнике при +4 °C в течение 4 — 5 суток. Декантируют надосадочную жидкость, распределяют во флаконы по 100 куб. см, прибавляют по 1,25 куб. см 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового, вновь прогревают при 100 °C 30 мин., хранят в холодильнике. Сухих дрожжей на 1 куб. дм воды берут 160 г.

6.3.2 Молочно-ингибиторная среда (МИС) Г.П. Калины

Среда может быть использована в двух вариантах.

    Вариант  1:  К  85,0  куб.  см  стерильного растопленного 2-процентного
питательного  агара прибавляют 15,0 куб. см стерильного снятого молока, 1,0
куб.  см  2% водного раствора калия теллурита (K TeO  x H O) и 1,25 куб. см
                                                2   3    2
0,1%   водного  раствора  кристаллического  фиолетового.  Все  смешивают  и

Вариант 2: Основа та же, но вместо калия теллурита прибавляют 0,5 куб. см 10% водного раствора трифенилтетразолхлорида (ТТХ) и 20000 ЕД полимиксина.

6.3.3 Модифицированная среда Сланеца-Бертли

В 1 куб. дм расплавляют при нагревании 35,0 г сухого питательного агара ДагНИИПС, 4,0 г калия дигидрофосфата (KH PO ), устанавливают pH 7,0 — 7,1,

                                     **2  4**

разливают в сосуды, стерилизуют при (120 +/- 1) °C 20 мин. Перед употреблением в расплавленный и слегка остуженный агар добавляют из расчета на 100 куб. см среды: глюкозы 0,4 г, натрия азида (NaN ) 0,04 г, 1% водного 3 раствора ТТХ 1 куб. см, натрия лимоннокислого [(Na) C H O ] 2,0 г. 3 6 5 7 Разливают в чашки по 20 — 25 куб. см.

При работе со средой Сланеца-Бертли следует учитывать взрывоопасность и токсичность азида натрия. Поэтому исследования могут производиться только в тех лабораториях, где может быть обеспечено безопасное хранение препарата.

6.3.4 Среда Турчинского

    В  600  куб.  см  дистиллированной  воды растворяют сухого питательного

агара  ДагНИИПС  35  -  40  г,  калия  гидрофосфата  (K HPO )  5,0 г, калия

                                                       2   4

дигидрофосфата  (KH PO ) 5,0 г, натрий-аммония фосфата [(NaNH ) PO ]  5,0 г

                   2  4                                      4 3  4

желчи  400 куб. см, устанавливают pH 7,2 - 7,4, стерилизуют при (120 +/- 1)

Перед употреблением в расплавленный и слегка охлажденный агар добавляют из расчета на 100 куб. см среды: глюкозы 0,5 г, 1%, водного раствора ТТХ 1 куб. см, 1% раствора метиленового синего (хранить не более 14 дней) 0,6 куб. см, полимиксина 20000 ЕД, 0,1% спиртового раствора фурацилина 1,2 куб. см. Разливают в чашки по 20 — 25 куб. см. Хранят в холодильнике не более 3 суток.

6.4. Среды для определения мезофильных анаэробных споровых микроорганизмов

6.4.1 Среда Китт-Тароцци

Приготавливается в соответствии с ГОСТ 10444.1-84 «Консервы. Приготовление растворов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе», п. п. 4.13, 5.34, 5.36.

6.4.2 Среда Вильсона-Блера

Приготавливается по ГОСТ 10444.1-84, п. 5.28.

6.4.3 Молоко обезжиренное

Приготавливается по ГОСТ 10444.1-84, п. 4.16.

6.4.4 Лакмусовое молоко

Приготавливается по ГОСТ 10444.1-84, п. п. 4.14, 5.23.

6.4.5 Среда СПН (Сидоренко — Пивоварова).

    К  1  куб.  дм  питательного агара, приготовленного из сухого препарата
ДагНИИПС,  добавляют  10 г глюкозы, 50 куб. см 20% раствора натрия сульфита

(Ha SO ), 10 куб. см 8% раствора сульфата железа закисного (FeSO ), 2000000 2 3 4 ЕД полимиксина и 50000 ЕД неомицина. Среду разливают в пробирки по 9,0 куб. см. Хранят в холодильнике не более 3 — 5 дней.

6.5. Среды для определения сальмонелл

6.5.1 Магниевая среда в модификации МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана

    Среду  готовят из двух растворов. Раствор А: вода дистиллированной 89,0
куб.  см, пептона 0,42 г, натрия хлорида (NaCl) 0,7 г, калия дигидрофосфата

(KH PO ) 0,15 г, дрожжевого экстракта (см. п. 6.3.1.1) 2,0 куб. см. Раствор

   2  4
Б:  воды  дистиллированной  9,0 куб. см, хлористого магния кристаллического
(MgCl )  3,6 г. После растворения в водяной бане при кипячении в течение 10

 2

мин. растворы А и Б смешивают и прибавляют 0,5 куб. см водного раствора бриллиантового зеленого.

6.5.2 Висмут-сульфитный агар (ВСА)

Готовят из сухого препарата ДагНИИПС по прописи на этикетке. Среду разливают в стерильные чашки Петри за 2 — 3 сут. до применения и хранят в холодильнике.

6.5.3 Двуслойная универсальная комплексная среда Г.П. Калины (ДУКС-5)

    Нижний  слой:  питательный  бульон  100  куб.  см,  калий дигидрофосфат
(KH PO )  0,04  г,  калий  гидрофосфат  (K HPO )  0,1  г, натрий тиосульфат
   2  4                                   2   4
(Na S O   x 5H O) 0,68 г, глюкоза 0,1 г, агар-агар 0,6 г. После растворения
   2 2 3      2

при кипячении в водяной бане прибавляют 0,2 куб. см 1,6% щелочного раствора

0,8 куб. см  50% водного  раствора  мочевины,  выдержанного 2 - 3 сут.  при
комнатной   температуре    для   самостерилизации.  Хорошо  перемешивают  и

асептически разливают в пробирки по 2,0 куб. см, застуживают в вертикальном положении.

    Верхний  слой:  стерильный  2%  питательный  агар  100  куб.  см, калий
дигидрофосфат  (KH PO ) 0,04 г, калий гидрофосфат (K HPO ) 0,1 Г, соль Мора
                  2  4                              2   4
[FeSO (NH ) SO   x  6H O]  0,16  г,  лактоза  1,0  г, сахароза 1,0 г. После
     4   4 2  4       2
растворения  при  кипячении  в  водяной  бане  добавляют  0,3  куб. см 1,6%

щелочного раствора фенолового красного и 2,0 куб. см 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового. Разливают поверх нижнего слоя, скашивают, оставив столбик высотой до 1,0 см.

6.6. Среды для определения патогенных галофильных вибрионов

6.6.1 Основной раствор пептона

В 1 куб. дм растворяют 100 г пептона, 50 г натрия хлорида (NaCl), 5,0 г

калия   азотнокислого   (KNO )   и   25,0   г  натрия  углекислого (Na CO )
                            3                                         2  3
устанавливают  pH  8,2  -  8,4, фильтруют, стерилизуют при (120 +/- 1) °C в

течение 30 мин. Срок хранения 6 месяцев в холодильнике.

6.6.2. 1% пептонная вода, содержащая 0%, 8% и 10% натрия хлорида

Для получения 1% пептонной воды основной раствор пептона разводят в 10 раз (один объем основного раствора пептона на 9 объемов дистиллированной воды) и добавляют требуемое количество натрия хлорида. Доводят pH до 8,2 — 8,4 раствором едкого натрия (NaOH). Стерилизуются при (120 +/- 1) °C в течение 30 мин. Срок хранения 2 месяца в холодильнике.

6.6.3 Щелочной питательный агар с 3% натрия хлорида

Готовят из сухого препарата ДагНИИПС по прописи на этикетке с добавлением 3% натрия хлорида (NaCl).

6.6.4 Среда с вторичными алкилсульфатами натрия А.Е. Либинзон

К 100 куб. см расплавленного щелочного агара добавляют 3,0 г натрия хлорида, 1,5 г сахарозы, 0,8 куб. см жидкости «Прогресс» (20-процентный водный раствор вторичных алкилсульфатов натрия), 0,008 г бромтимолового синего (спирторастворимого), устанавливают pH 7,8. Стерилизуют при (112 +/- 1) °C 20 мин. Цвет среды синий. Жидкость «Прогресс» можно вносить в расплавленный агар перед разливом в чашки.

Жидкость «Прогресс» выпускает Новочеркасский завод синтетических препаратов.

6.6.5 Среда TCBS (модификация Московской горСЭС)

    В  1  куб.  дм дистиллированной воды растворяют 50,0 г сухого щелочного
питательного  агара,  20,0  г  сахарозы,  8,0  г желчи сухой, 10,0 г натрия
цитрата  (Na C H O   x 5H O), 1,0 г железа цитрата (FeC H O ), 6,0 г натрия
            3 2 5 7      2                             6 5 7

карбоната безводного (Na CO ), 10,0 г натрия серноватистокислого (Na S O ),

                        2  3                                        2 2 3
0,94  г  бромтимолового  синего, 0,04 г тимолового синего, устанавливают pH
8,0  -  8,2.  Смесь  доводят  до  кипения,  но  не  кипятят,  разливают без

стерилизации в чашки Петри. Цвет среды зеленый.

6.6.6 Дифференциально-диагностический агар (ДДА) в модификации

Ю.И. Григорьева с соавторами (1975 г.)

К 1 куб. дм расплавленного стерильного 2% щелочного агара, охлажденного

до  50  °C,  добавляют  натрия  хлорида  70,0  г, сахарозы 15,0 г, жидкости
"Прогресс"  2,0  куб.  см,  пенициллина  5000  ЕД, 1,6% спиртового раствора
бромтимолового  синего 10,0 куб. см, теллурита калия (K TeO  x H O) (1:1000
                                                       2   3    2
раствор)  7,5 куб. см; устанавливают pH 7,8 - 8,2. Среда имеет сине-зеленый
цвет.  Не стерилизуя, разливают в чашки Петри. Срок хранения в холодильнике

7 — 10 сут.

6.6.6.1 Приготовление раствора теллурита калия

    Теллурит калия (K TeO  x H O) выпускается промышленностью в виде сухого
                     2   3    2

порошка или 2% раствора во флаконах по 5 куб. см.

Берут 1,0 г сухого теллурита калия и растворяют в 1,0 куб. см стерильной дистиллированной воды в стерильных пробирках. Из пробирки берут 0,1 куб. см и растворяют в 9,9 куб. см изотонического раствора натрия хлорида до разведения 1:100. Берут 0,1 куб. см и разводят в 0,9 куб. см изотонического раствора натрия хлорида или к 5,0 куб. см 2% раствора добавляют дистиллированную воду до 100 куб. см и получают разведение 1:1000 (рабочее разведение). Срок хранения не более 48 ч.

6.6.7 Среда Касаткина

15,0 г агар-агара заливают небольшим количеством холодной дистиллированной воды и тщательно перемешивают до полного смачивания агара,

затем  к  смеси  добавляют воду до 1 куб. дм, 10,0 г пептона, 30,0 г натрия
хлорида,  1,0  г  карбоната  калия безводного (Ha CO ) и кипятят до полного
                                                 2  3

растворения агара, после чего в состав среды вводят 40,0 куб. см дрожжевого экстракта или 5,0 г сухого дрожжевого экстракта, 20,0 г сахарозы и 2,0 куб. см жидкости «Прогресс». Среду фильтруют, устанавливают pH 8,5 — 8,6. 0,04 г

бромтимолового  синего разводят в 96° спирте и добавляют по каплям в среду.
Среду  кипятят  2 - 3 мин. и без стерилизации разливают в чашки Петри. Цвет

сине-зеленый.

6.6.8 Среда Хью-Лейфсона

    В  1 куб.  дм растворяют 2,0 г пептона, 3,0 г агар-агара, 30,0 г натрия
хлорида  (NaCl),  0,3  г  калия  гидрофосфата  (K HPO ),  10,0  г  глюкозы,
                                                 2   4
устанавливают  pH  7,8  -  8,0,  добавляют  3,0 куб. см 1% водного раствора
бриллиантового  синего.  Разливают в пробирки по 3 - 4 куб. см. Стерилизуют

при (112 +/- 1) °C в течение 20 мин. Цвет среды бутылочно-зеленый.

6.6.9 Среда Гисса для определения ферментативной активности

Среды Гисса готовят по прописи на этикетке сухих сред ДагНИИПС, добавляя 2,5% натрия хлорида (NaCl). Или приготовляют следующим образом: к 1% пептонной воды с 3% натрия хлорида добавляют 1% испытываемого углевода или спирта и индикатор. В качестве индикатора может быть использован индикатор Андреде, 1-процентный раствор или 1,6-процентный спиртовый раствор бромтимолового синего из расчета 0,1 куб. см на 100 куб. см среды Гисса, pH 7,4.

6.6.10 Желатин питательный

В 100 куб. см питательного бульона (pH 8,0) вносят желатин: зимой 10,0 г, летом 20,0 г. Раствор оставляют для набухания на 1 — 2 ч, затем подогревают на водяной бане при 40 — 50 °C до полного растворения желатина, добавляют 3,0 г натрия хлорида (NaCl), устанавливают pH 7,0 — 7,4. При кислой и щелочной реакции желатин теряет способность застывать. Горячую среду фильтруют. Если среда мутная, то ее осветляют взбитым белком из свежих яиц. Среду разливают в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром 3 сут. по 30 мин. или при (112 +/- 1) °C 15 мин.

6.6.11 Среда Кларка

    В  100  куб.  см  дистиллированной воды растворяют при нагревании 0,5 г
пептона,  0,5  г  калия гидрофосфата (K HPO ), 3,0 г натрия хлорида (NaCl),
                                       2   4

0,5 глюкозы, устанавливают pH 7,5 — 7,8, разливают в стерильные пробирки по 1 — 1,5 куб. см и стерилизуют при (112 +/- 1) °C в течение 15 мин.

6.6.12 Среда ДАГВ с аминокислотами (модификация Ю.И. Григорьева с

соавторами, 1975 г.)

    В  1  куб.  дм  дистиллированной  воды растворяют 5,0 г пептона, 30,0 г
натрия  хлорида (NaCl), 0,5 г глюкозы или 1,0 куб. см 40% раствора глюкозы,
0,1  куб. см 5% раствора витамина B  и 1,0 куб. см 1,6% спиртового раствора

                               6

бромкрезолпурпура,  устанавливают  pH 6,7 - 6,8. Приготовленную среду делят
на  три  равных  объема.  В первый объем вносят 0,5 L-аргинина, во второй -
L-лизина,  третий - без  аминокислот  служит  контролем.  Среду разливают в
стерильные  пробирки  по  2,0  куб.  см  и стерилизуют при (112 +/- 1) °C в

течение 15 мин.

6.6.13 Среда Вагатсума

В 100 куб. см дистиллированной воды растворяют при нагревании 1,0 г бактопептона (Дифко), 0,3 г дрожжевого экстракта, 7,0 г натрия хлорида, 0,5

г  калия  гидрофосфата  (K HPO ),  1,5  г агар-агара, затем добавляют 1,0 г
                          2   4
маннита  и  5 куб. см крови человека, устанавливают pH 7,4 - 7,8, добавляют
индикатор  -  0,1  куб.  см  0,1% спиртового раствора кристалл-виолета.  Не
стерилизуя,   среду  разливают  в  чашки  Петри,  после  застывания  слегка

подсушивают.

6.6.14 Кровяной агар (модификация Ю.И. Григорьева с соавторами,

1975 г.)

К 1 куб. дм расплавленного стерильного щелочного 2% МПА добавляют 5,0 г калия гидрофосфата (K HPO ), 70,0 г натрия хлорида, 10,0 г маннита,

                   **2   4**<br>

кипятят  при  100  °C  в течение 60 мин. После охлаждения в горячей водяной
бане  до  40  -  50  °C  добавляют  100  куб.  см цельной свежей стерильной
цитратной  крови  человека  или  5%  свежеприготовленной взвеси эритроцитов
человека.  Перед  добавлением  в среду взвесь эритроцитов или цельную кровь
подогревают  в водяной бане до 40 °C. После перемешивания среду разливают в
стерильные  чашки  Петри и подсушивают в термостате при температуре 37 °C в

течение 40 — 60 мин.

Эритроциты, выделенные из свежей крови человека, промывают 3 раза в 100 куб. см 0,85% стерильного раствора натрия хлорида, центрифугируют, затем приготовленную взвесь эритроцитов восстанавливают до первоначального объема 0,85% стерильным раствором натрия хлорида.

6.7. Среды для определения коагулазоположительных стафилококков

6.7.1 Молочно-солевой агар (МСА)

К 1 куб. дм питательного бульона добавляют 65,0 г натрия хлорида (NaCl) и 20,0 г агар-агара, кипятят, фильтруют, устанавливают pH 7,4. Стерилизуют при (120 +/- 1) °C в течение 20 мин. Остужают до 45 — 50 °C и добавляют 10% стерильного обезжиренного молока, хорошо размешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Хранят в холодильнике не более 2 — 3 сут.

6.7.2 Желточно-солевой агар Г.Н. Чистовича (ЖСА)

Желток асептически извлекают из яйца и взбалтывают до получения равномерной эмульсии с 200 куб. см стерильного 0,85% раствора натрия хлорида; 100 куб. см желточной взвеси вносят в 300 куб. см расплавленного и остуженного до 60 °C питательного 2,5% агара с 6,5% натрия хлорида. Равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

6.8. Среды для определения аэромонад

6.8.1 Жидкая среда накопления А-1

В 100 куб. см морской воды при кипячении в водяной бане растворяют 0,02 г магния сульфата (MgSO ), 0,2 г крахмала растворимого, 1,0 г желатина, 0,1 4

г  калия гидрофосфата (K HPO ), устанавливают pH 7,2 - 7,4, стерилизуют при
                        2   4
(112  +/- 1) °C в течение 15 мин., после стерилизации добавляют 2,0 куб. см
0,01%  водного раствора кристаллического фиолетового, асептически разливают

в стерильные пробирки.

6.8.2 Плотная дифференциально-элективная среда А-2

В 100 куб. см морской воды растворяют при нагревании в водяной бане 2,0 г агар-агара, 0,02 г магния сульфата (MgSO ), калия дигидрофосфата (KH PO )

                                          4                           2  4
0,1  г, крахмала растворимого 0,5 г, желатина 5,0 г, устанавливают pH 7,4 -
7,6.  Стерилизуют  при  (112 +/- 1) °C в течение 15 мин. После стерилизации
прибавляют  2,0 куб. см 0,01% водного раствора кристаллического фиолетового
и  0,2  куб.  см  10%  водного  раствора трифенилтетразолхлорида (ТТХ), для

устранения роста псевдомонад прибавляют 40000 ЕД пенициллина. Разливают в 5

• 6 стерильных чашек Петри, после застывания заливают поверхность среды тонким слоем 2% голодного агара.

6.8.3 Комплексная дифференциальная среда А-3

    В  100 куб. см 2%  МПА  растворяют  при  кипячении в водяной бане 5,0 г
желатина.  Стерилизуют при (112 +/- 1) °C, после стерилизации добавляют 2,0
куб. см 0,01%  водного  раствора  кристаллического  фиолетового, смешивают,
разливают  в  стерильные  чашки  Петри,  после  застывания  среды  заливают

поверхность тонким слоем 2% голодного агара.

6.8.4 Комплексная дифференциальная среда А-4

    Среда   двуслойная.   Нижний  слой:  в  100  см  дистиллированной  воды
растворяют  при  кипячении в водяной бане 1,0 г пептона, 0,5 натрия хлорида

(NaCl), 0,4 г агар-агара, 0,2 г калия гидрофосфата (K HPO ), 0,5 г глюкозы,

                                                     2   4
0,2  куб.  см  1,6%  щелочного  раствора  бромтимолового  синего,  pH  7,2.
Разливают  в  пробирки  по  4  куб.  см,  стерилизуют  при  (112 +/- 1) °C,
застуживают  столбиком.  Верхний  слой: среда  того  же  состава, но с 0,2%

агара. После стерилизации при (112 +/- 1) °C в течение 15 мин. разливают по 4 — 5 куб. см поверх нижнего слоя, застуживают столбиком.

6.8.5 Комплексная дифференциальная среда А-5

    Среда  двуслойная.  Нижний  слой:  100  куб.  см  дистиллированной воды
растворяют  при  кипячении в водяной бане 2,0 г агар-агара,  1,0 г пептона,
0,5 г  натрия  хлорида  (NaCl),  0,04 г  калия гидрофосфата (K HPO ), 0,2 г
                                                              2   4
маннита, 0,2 куб. см  1,6%  щелочного раствора фенолового красного, pH 7,2.
Разливают  в  стерильные  пробирки  по  4 - 5  куб.  см,  стерилизуют   при

(112 +/- 1) °C 15 мин., застуживают столбиком. Верхний слой: состав тот же,

только вместо маннита добавляют 0,5 г ксилозы,  вместо  калия  гидрофосфата
(K HPO )  -  калий    дигидрофосфат    (KH PO ),   pH   6,8.    Стерилизуют
  2  4                                    2  4
при (112 +/- 1) °C 15 мин. После  стерилизации разливают асептически поверх
нижнего  слоя  по  4,0  куб.  см,   скашивают,   оставив  столбик   высотой

6.9. Среды для определения эдвардсиелл

6.9.1 Среда накопления ЕЕ в модификации Г.П. Калины

    В  100  куб.  дм воды дистиллированной растворяют 10,0 г пептона, 5,0 г
глюкозы,   8,0  г  натрия  гидрофосфата  (Na HPO   x  2H O),  2,0  г  калия
                                            2   3       2
дигидрофосфата  (KH PO ), 20,0 куб. см желчи бычьей или 3,0 г желчных солей
                   2  4

по Олькеницкому. Стерилизуют при (112 +/- 1) °C 15 мин. Затем добавляют 3,0 куб. см 0,5% водного раствора бриллиантового зеленого, разливают асептически в стерильные пробирки.

6.9.1.1 Приготовление желчных солей по И.С. Олькеницкому

    К  1,0  куб.  дм  желчи  добавляют  40,0  г  гидроокиси  натрия (NaOH),
перемешивают  и помещают в автоклав. Гидролиз проводят при (126 +/- 1) °C в
течение  3  ч  (можно  дважды  по  2 ч). К гидролизату для осаждения жирных
кислот  прибавляют  100 куб. см 20% раствора бария хлорида (BaCl  x 2H O) и
                                                                2     2
прогревают  в автоклаве 1 ч. На следующий день гидролиза сливают с осадка и

фильтруют. Затем при постоянном перемешивании добавляют 20% раствор соляной

кислоты  (HCl)  до  кислой  реакции  и  оставляют на 18 - 20 ч. После этого
сливают  надосадочную  жидкость,  осадок  промывают  водой и прибавляют при
нагревании  40%  раствор гидроокиси натрия до наступления щелочной реакции,
но  остерегаясь сильного перещелачивания. Полученные натриевые соли желчных
кислот  выливают  на противень и высушивают до порошкообразного состояния в
сушильном  шкафу  при  115  °C.  Хранят  желчные  соли  в банке с притертой

крышкой.

6.9.2 Среда 1-го этапа исследования (Эт-1) Г.П. Калины

    В  100 куб. см  стерильного  мясо-пептонного  бульона   растворяют  при
нагревании  0,2 г  глюкозы и 0,2 куб. см  5% спиртового  раствора розоловой

кислоты, кипятят в водяной бане 15 — 20 мин., добавляют 2500 ЕД полимиксина и разливают асептически в стерильные пробирки.

6.9.3 Среда 2-го этапа исследования (Эт-2) Г.П. Калины

    В  100 куб. см дистиллированной воды растворяют при кипячении в водяной
бане  2,5  г  агар-агара,  2,0 г  экстракта  кормовых  дрожжей (ЭКД), 1,0 г
маннита,  0,275  г  глюкозы,  0,25  г  желчных солей по Олькеницкому, 0,5 г
L-лизина  или  1,0  DL-лизина, 9,2 куб. см 5% спиртового раствора розоловой
кислоты.  Затем прибавляют раствор: 2,0 куб. см дистиллированной воды, 0,68
г  натрия  тиосульфата  (N S O   x  5H O)  и  0,08 г железо (III) - аммоний
                          2 2 3       2

цитрата [FeC H O (NH ) C H O ], устанавливают pH 6,9 — 7,1. Стерилизуют при 6 5 7 4 3 6 5 7 (112 +/- 1) °C 15 мин. Разливают в стерильные чашки Петри.

6.9.4 Среда 3-го этапа исследования (Эт-3) Г.П. Калины

    Среда  двуслойная.  Нижний  слой: в 100 куб. см мясо-пептонного бульона
растворяют  0,6 г агара, 0,1 г глюкозы, 0,5 г L-лизина или 1,0 г DL-лизина,
натрия  тиосульфата (Na S O   x 5H O) 0,03 г, калия дигидрофосфата (KH PO )
                       2 2 3      2                                   2  4
0,04  г,  калия  гидрофосфата  (K HPO )  0,1  г,  1,6%  щелочного  раствора
                                 2   4
фенолового  красного  0,5 куб. см, pH 7,0. После стерилизации при 112 +/- 1
°C  в  течение  15 мин.  прибавляют 50% водный раствор мочевины 2,0 куб. см
(раствор  самостерилизуется при инкубации в течение 24 - 48 ч при комнатной
температуре),  разливают  асептично в стерильные пробирки по 3 - 4 куб. см,

остуживают столбиком.

    Верхний  слой: 1,5% стерильного МПА 100 куб. см, маннита 1,0 г, ксилозы
1,0  г,  соли  Мора  [FeSO (NH ) SO   x  6H O]  0,03  г,  триптофана 0,1 г,
                          4   4 2  4       2
растворяют  при  кипячении  в  водяной  бане,  добавляют  индикаторы:  1,6%
щелочного  раствора фенолового красного 0,5 куб. см, 0,01% водного раствора
кристаллического  фиолетового  2,0  куб.  см,  разливают  асептично  поверх

нижнего слоя по 4 — 5 куб. см, скашивают, оставив столбик высотой 0,5 — 1,0 см.

6.10. Основные реактивы

1,6 г индикатора БТС растворяют в 20,0 куб. см 1% раствора гидроокиси натрия (NaOH), прибавляют 80,0 куб. см дистиллированной воды.

6.10.3. 1,6% щелочной раствор фенолового красного (ФК)

1,6 г индикатора ФК растворяют в 20,0 куб. см 1% раствора гидроокиси натрия (NaOH), прибавляют 80,0 куб. см дистиллированной воды.

6.10.4 Реактивы для цитохромоксидазного теста

1% водный раствор диметилпарафенилендиамина (пара-аминодиметилаланина хлорида или оксалата) смешивают с 1% спиртовым раствором альфа-нафтола в пропорции 3:1 непосредственно перед применением. Хранить реактивы обязательно раздельно в холодильнике. Смесью растворов можно пропитать фильтровальную бумагу. Пропитанную реактивом бумагу можно хранить в высушенном виде в темноте несколько недель.

6.10.5 Растворы для окраски по Грамму в модификации Г.П. Калины

Раствор А: 0,5% спиртовый раствор кристаллического фиолетового. Раствор: Б: в 100 куб. см 96° спирта этилового растворяют 0,5 г йодистого калия (KJ), прибавляют 0,25 г кристаллического йода и 0,125 г основного фуксина.

6.10.6 Реактивные бумажки для определения индола

    Листы   фильтровальной   бумаги  80  x  80  мм  пропитывают  раствором:
парадиметиламидобензальдегида  5,0  г,  амилового  или  изоамилового (можно
метилового)  спирта  50,0  куб. см, ортофосфорной кислоты (H PO ) 10,0 куб.
                                                            3  4
*см.*  После  подсушивания бумаги в сушильном шкафу при невысокой температуре

нарезать полосками до 5 мм шириной, хранить во флаконе с притертой пробкой.

6.10.7 Реактив Ковача для определения индола

Парадиметиламидобензальдегида 0,5 г, амилового (или изоамилового) спирта 75,0 куб. см, концентрированной соляной кислоты (HCl) 25,0 куб. см.

6.10.8 Реактив Эрлиха для определения индола

Аминобензальдегида 4,0 г, параметиламинобензальдегида 4,0 г, 96° этилового спирта 380 куб. см, концентрированной соляной кислоты (HCl) 8,0 куб. см.

6.10.9 Индикатор Андреде

Приготовляется в соответствии с ГОСТ 10444.1-84, п. 4.6.

Приложение

Форма журнала

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ МИДИЙ И МОРСКОЙ ВОДЫ В МАРИХОЗЯЙСТВАХ

  с ________________________ по ________________________ 19__ г.
         (число, месяц)              (число, месяц)

Продолжение

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1. Временные указания по микробиологическим нормативам для ряда особо скоропортящихся пищевых продуктов и методам их исследования № 2510-81. Утвержд. Минздравом СССР 30 декабря 1981 г.

2. Гигиена продуктов из рыбы, моллюсков и ракообразных. ВОЗ. Серия технических докладов № 550. Женева, 1975.

3. ГОСТ 2874-82. Вода питьевая.

4. ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа.

5. ГОСТ 10444.1-84. Консервы. Методы микробиологического анализа.

6. ГОСТ 7631-75. Рыба, продукты из рыбы, морских млекопитающих и беспозвоночных. Правила приемки. Методы органолептической оценки качества. Методы отбора проб для лабораторных исследований.

7. Григорьев Ю.И., Гоева О.Э., Пивоваров Ю.П., Шикалов Г.М. Пищевые отравления, вызываемые Vibrio parahaemolyticus и их диагностика. Методические рекомендации. М., 1975.

8. Дутова Е.Н., Гофтарш М.М., Призренова И.И., Сазонова А.С. Техническая микробиология рыбных продуктов. М., Пищевая промышленность, 1976.

9. Инструкция о порядке санитарно-технического контроля консервов на производственных предприятиях, оптовых базах, в розничной торговле и на предприятиях общественного питания № 1121-73. Утвержд. Минздравом СССР 18 апреля 1973 г.

10. Инструкция по санитарной обработке технологического оборудования на рыбообрабатывающих предприятиях и судах. Утвержд. Минздравом СССР 27 марта 1984 г.

11. Калина Г.П. Сальмонеллы в окружающей среде. М., Медицина, 1978.

12. Калина Г.П. Упрощенный и ускоренный метод идентификации бактерий рода Эдвардсиелла. Методические рекомендации. М., 1981.

13. Калина Г.П., Графова Т.И. Методы исследования объектов окружающей среды и патогенного материала на аэромонады. Методические рекомендации. М., 1980.

14. Методические указания по гигиеническому контролю загрязнения морской среды. Утвержд. Минздравом СССР 19 января 1981 г.

15. Методические указания по санитарно-бактериологическому контролю на предприятиях общественного питания и торговли пищевыми продуктами № 2657. Утвержд. Минздравом СССР 31 декабря 1982 г.

16. Методические указания по санитарно-микробиологическому контролю на рыбоконсервных предприятиях. Утвержд. Минрыбхозом СССР 30 июля 1976 г.

17. Методические указания по определению сальмонелл в экспортной рыбной продукции (свежей, мороженой, копченой рыбе, филе, фарше, икре, кормовой муке и пр.). Утвержд. Минрыбхозом СССР 7 апреля 1980 г.

18. Методы индикации бактерий и вирусов в объектах окружающей среды. Сборник научных трудов МНИИГ им. Ф.Ф. Эрисмана. М., 1982.

20. Санитарная микробиология. Под ред. Г.П. Калины и Г.Н. Чистовича. М., Медицина, 1969.

21. Санитарные правила для береговых рыбообрабатывающих предприятий. Утвержд. Минздравом СССР 24 декабря 1981 г.

22. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. М.О. Биргера. М., Медицина, 1982.

23. СТ СЭВ 3013-81. Пищевые и вкусовые продукты. Порядок отбора проб для микробиологических анализов.

24. СТ СЭВ 3014-81. Пищевые и вкусовые продукты. Подготовка проб для микробиологических анализов.

25. СТ СЭВ 3015-81. Пищевые и вкусовые продукты. Принципы культивирования микроорганизмов и способы обработки результатов при микробиологических испытаниях.

26. СТ СЭВ 4247-83. Пищевые продукты. Метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов посевом в агаризованную среду.