Инструкции по проведению профилактических прививок против коклюша, дифтерии и столбняка, по выявлению и борьбе с носительством дифтерийных бактерий, по применению реакции Шика, по бактериологическому исследованию на дифтерию

(утв. Приказом Минздрава СССР от 26.06.1974 № 580)

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРОВЕДЕНИЮ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРИВИВОК ПРОТИВ КОКЛЮША, ДИФТЕРИИ И СТОЛБНЯКА

Полноценная профилактика коклюша, дифтерии и столбняка может быть достигнута только при условии своевременного и качественного проведения иммунизации детям, проводимой в соответствии с инструкцией.

Для иммунизации применяются следующие препараты:

I. Характеристика препаратов

Адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-вакцина) представляет гомогенную взвесь, состоящую из коклюшных микробов 1 фазы, убитых формалином или мертиолятом, очищенных и концентрированных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. В 1 миллилитре содержится 20 млрд. коклюшных микробных клеток, 30 флокулирующих единиц дифтерийного и 10 единиц связывания столбнячного анатоксина. Консервант-мертиолят в концентрации 0,01%.

АКДС-вакцина выпускается в жидком и сухом виде.

Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин (АДС-анатоксин) представляет смесь концентрированных и очищенных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. В 1 миллилитре содержится 60 флокулирующих единиц дифтерийного и 20 единиц связывания столбнячного анатоксинов.

Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов представляет смесь концентрированных и очищенных дифтерийного и столбнячного анатоксинов, адсорбированных на гидроокиси алюминия. В 1 миллилитре препарата содержится 10 Lf дифтерийного и 10 ЕС столбнячного анатоксинов.

Адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД-анатоксин) — очищенный, концентрированный, адсорбированный на гидроокиси алюминия. В 1 миллилитре препарата содержится 60 флокулирующих единиц дифтерийного анатоксина.

Адсорбированный столбнячный анатоксин (АС-анатоксин) — очищенный, концентрированный, адсорбированный на гидроокиси алюминия препарат. В 1 миллилитре содержится 20 единиц связывания столбнячного анатоксина.

Содержание гидроокиси алюминия во всех препаратах не превышает 2 мг в 1 миллилитре.

Все препараты хранят в сухом, темном месте при температуре от 4 град. до 10 град. выше нуля.

После замораживания вакцины и анатоксины к применению не пригодны.

II. Применение и дозировка

1. Адсорбированной коклюшно-дифтерийно-столбнячной (АКДС) вакциной прививают детей в возрасте с 5-6 месяцев, кроме детей, переболевших коклюшем.

Прививки АКДС-вакциной проводят по следующей схеме:

а) курс вакцинации АКДС-вакциной состоит из трех внутримышечных инъекций препарата (0,5 мл каждая) с интервалом 30-40 дней. Сокращение этих интервалов не допускается.

При необходимости удлинения интервалов после первой или второй вакцинации свыше 40 дней, следует проводить очередную вакцинацию в ближайший возможный срок, определяемый состоянием здоровья ребенка, но не превышающий 6 месяцев. В исключительных случаях удлинение интервалов допускается до 12 месяцев. Ребенок при вакцинации должен получить только три инъекции препарата.

Примечание: При развитии у ребенка необычной реакции на первую или вторую прививку в первые двое суток после введения АКДС-вакцины или поствакцинальных осложнений (температура 39 град. С и выше, аллергическая сыпь, ложный круп, судороги, шок и т.д.) дальнейшее применение этого препарата прекращается. Иммунизация может быть продолжена АДС-анатоксином, который вводится однократно. Если ребенок получил две прививки АКДС-вакциной, цикл вакцинации считается законченным.

б) Первую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят однократно, в дозе 0,5 мл через 1,5-2 года после законченной троекратной вакцинации.

в) Вторую ревакцинацию АКДС-вакциной проводят в возрасте 6 лет перед поступлением в школу, также однократно — в дозе 0,5 мл.

2. Адсорбированным дифтерийно — столбнячным анатоксином (АДС) прививают детей в возрасте до 6 лет, переболевших коклюшем или имеющих противопоказания к введению АКДС-вакцины.

Примечание: Дети старше 6 лет, ранее не привитые АКДС-вакциной, прививаются АДС-анатоксином.

Курс вакцинации АДС-анатоксином состоит из двух внутримышечных инъекций препарата (по 0,5 мл на каждую прививку) с интервалом 30-40 дней.

В отдельных случаях увеличение интервала между инъекциями допускается до 6-12 месяцев; ребенок при вакцинации получает только две инъекции препарата.

Первую ревакцинацию АДС-анатоксином проводят через 1,5-2 года, после законченной вакцинации, однократно, в дозе 0,5 мл.

Вторую ревакцинацию проводят в возрасте 6 лет однократно в дозе 0,5 мл.

Третью ревакцинацию проводят в возрасте 11 лет однократно 0,5 мл (независимо от ранее примененного препарата).

3. Адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин с уменьшенным содержанием антигенов применяют:

а) для ревакцинации детей с аллергической (измененной) реактивностью в дозе 0,5 миллилитра (5Lf дифтерийного и 5ЕС столбнячного анатоксинов) однократно, внутримышечно;

б) для ревакцинации детей 12 лет и старше по эпидпоказаниям, не имеющих документального подтверждения о прививках, в дозах 0,5 миллилитра (5Lf дифтерийного и 5ЕС столбнячного анатоксинов). Препарат вводят внутримышечно, двукратно с интервалом 30-40 дней.

Лицам, получившим ранее прививки против дифтерии, делают одну прививку в дозе 0,5 миллилитра.

Эпидемическими показаниями для проведения прививок следует считать повышенную заболеваемость дифтерией и наличие носителей токсигенных дифтерийных бактерий (школы-интернаты, школы и др. коллективы детей).

4. Адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД) применяют детям, переболевшим дифтерией, по эпидемическим показаниям и с положительной реакцией Шика.

Детей, переболевших дифтерией, в возрасте до 11 лет прививают однократно в дозе 0,5 мл адсорбированным дифтерийным анатоксином, но не ранее, чем через 6 месяцев после перенесенного заболевания, а далее проводят ревакцинации согласно данной инструкции, с теми же интервалами и дозами, с учетом возраста ребенка.

Детей в возрасте до 11 лет со слабо положительной реакцией Шика (+/- и +) прививают однократно, внутримышечно в дозе 0,5 мл; с интенсивно выраженной реакцией Шика (++ или +++) прививают двукратно с интервалом 30-40 дней, допускается удлинение интервала до 6-12 месяцев. Последующую плановую прививку проводят в сроки, предусмотренные настоящей инструкцией. Подростков (12-19 лет) независимо от интенсивности положительной реакции (+/-, +, ++, +++) с известным прививочным анамнезом прививают однократно в дозе 0,3 мл.

III. Клинические противопоказания к проведению прививок

Одним из наиболее ответственных разделов прививочной работы является отбор на прививки, цель которого состоит в определении возможности их проведения в сроки, определенные приказом Министра здравоохранения СССР № 322 от 25 апреля 1973 года.

Прививкам подлежат все здоровые дети, которые должны быть предварительно обследованы врачом (фельдшером на фельдшерско-акушерском пункте) с учетом данных их анамнеза (предшествующие заболевания, реакция на ранее сделанные прививки, аллергические реакции на лекарственные препараты, пищевые продукты и др.) и осмотрены с обязательной термометрией непосредственно перед прививкой. При необходимости производят анализ мочи и крови. Детей с хроническими заболеваниями, аллергическими состояниями и др., проживающих в сельской местности, перед проведением прививки обязательно осматривает врач. Родители детей, посещающих детские дошкольные учреждения и школы, должны быть оповещены о дне проведения прививок.

При отборе детей на прививку указанными препаратами необходимо строго соблюдать нижеприведенный перечень противопоказаний:

	Допустимость прививок
	АКДС-вакцина	АДС-анатоксины
1. Острые заболевания Не ранее месяца с момента выздоров-
(инфекционные и ления. неинфекционные), включая период реконвалесценции. Вирусный гепатит. Не ранее 12 месяцев после выздоровления.
Менингококковая инфекция. Не ранее 6 мес. после выздоровления.
Инфекционные заболевания Не ранее 6 мес. после выздоровления. с затяжным и хроническим течением (сепсис, дизентерия и др.).
Примечание: при контакте с инфекционными больными в семье, детском учреждении и т.д. прививки проводятся по окончании срока карантина. В очагах дифтерии по показаниям прививают АД-анатоксином.
2. Туберкулез: локальные После выздоровления по заключению формы (легочные и фтизиатра. внелегочные) в активной фазе; выраженная туберкулезная интоксикация с субфебрилитетом; вираж туберкулиновых проб, связанный с заражением туберкулезом.
Примечание: положительная туберкулиновая реакция у клинически здоровых детей не является противопоказанием к проведению профилактических прививок.
3. Хроническая пневмония. Противопоказана. Не ранее 12 мес. с момента ремиссии.
4. Заболевания сердечно — Противопоказаны. сосудистой системы:
декомпенсированные врожденные и приобретенные пороки сердца; подострый септический эндокардит; острая недостаточность кровообращения.
Пороки сердца в стадии Прививки допустимы по заключению компенсации. педиатра.
5. Ревматизм. Противопоказана. Не ранее 3 лет с момента клинико — лабораторной ремиссии.
6. Болезни почек: диффузный Противопоказана. Не ранее 3 лет с гломерулонефрит, момента клинико — пиелонефрит лабораторной ремиссии.
Хроническая почечная Противопоказаны. недостаточность, врожденные нефропатии. Токсические нефропатии Не ранее 6 месяцев после выздоровле-
(транзиторные). ния.
7. Болезни печени и Противопоказаны. поджелудочной железы:
цирроз печени, хронический гепатит; гепатоцеребральная дистрофия, острый и хронический панкреатит.
Заболевания желчевыводящих Не ранее 6 мес. после выздоровления путей. (при условии санации желчи).
8. Болезни крови: лейкозы; Противопоказаны. апластическая анемия; конституциональная дисгаммаглобулинемия. Геморрагические диатезы. Противопоказана. Не ранее 2 лет с момента полной клинико — гематологической ремиссии.
9. Злокачественные Противопоказаны. новообразования.
10. Коллагенозы: системная Противопоказаны. красная волчанка; дерматомиозит; узелковый периартериит, ревматоидный артрит и др.
11. Эндокринные заболевания: Противопоказаны.
диффузно — токсический зоб; гипер- и гипопаратиреоз; дисфункции коры надпочечников.
Сахарный диабет.
12. Аллергические Противопоказана. Не ранее 12 мес. заболевания: от начала ремиссии
бронхиальная астма
(астматический бронхит).
Тяжелые аллергические Противопоказаны. реакции на прививки и различные аллергены. Распространенные проявления Противопоказана. Не ранее 12 мес. экссудативного диатеза от выздоровления
(экзема, нейродермит). или ремиссии Локальные проявления Не ранее 6 мес. после исчезновения экссудативного диатеза. клинических проявлений.
Примечание: при всех перечисленных в данном абзаце заболеваниях прививки проводятся на фоне антигистаминной терапии.
13. Тяжелые формы рахита После выздоровления.
(II-III ст.), гипотрофии
(II-III ст.), авитаминозов.
14. Гемолитическая болезнь В возрасте после 1 года (при новорожденных. нормальных показателях общего
Недоношенность (вес развития и крови). менее 2 кг).
15. Нервные и психические Противопоказаны. заболевания:
гидроцефалия суб- и декомпенсированная.
Гидроцефалия В возрасте после 1 года. компенсированная, болезнь
Дауна, болезнь Литтля, родовая травма без остаточных явлений в виде судорог.
Эпилепсия с частыми Противопоказаны. припадками.
Прогрессирующие заболевания нервной системы.
Эпилепсия с эпизодическими Противопоказана. Не ранее 6 мес. припадками. после последнего припадка.
Последствия родовой травмы Противопоказана. В возрасте не или внутриутробного моложе 1 года. нарушения развития плода.
Инфекционные заболевания ЦНС Противопоказана. Не ранее 12 мес.
(в виде менингитов, по окончании энцефалитов, острого периода. полирадикулоневритов и т.д.) любой этиологии; полиомиелит; травмы черепа с резидуальными явлениями; фебрильные судороги; спазмофилия.
Примечание: прививки данного контингента детей проводятся после обследования и рекомендаций психоневролога.
16. Неспецифический язвенный Противопоказаны. колит.
17. Оперативные Не ранее 2 мес. после операции. вмешательства.
Примечание: В каждом отдельном случае соматического заболевания, не содержащегося в настоящем перечне, врач — специалист решает вопрос о показании к прививкам и выборе препарата.

Дети, страдающие расстройством слуха и зрения, перед прививкой подлежат обязательному осмотру специалистом.

Дети, временно освобожденные от прививок по медицинским противопоказаниям, должны быть взяты под особое наблюдение и учет и привиты после снятия этих противопоказаний.

Дети, получившие прививку против какой-либо инфекции, в том числе против бешенства, могут быть привиты против другой инфекции по истечении не менее двух месяцев. Прививки против полиомиелита могут проводиться или одновременно (в один день) с прививками против коклюша, дифтерии и столбняка или с интервалом в два месяца.

IV. Условия и техника проведения прививок

Категорически запрещается проводить прививки на дому. В городах прививки проводят в прививочных кабинетах при детских поликлиниках, на селе — в медицинских учреждениях, выделяя для этого определенные дни или часы. В часы приема больных прививки проводить не разрешается. В населенных пунктах, не имеющих медицинского учреждения, проведение прививок организуют в специально выделенном и подготовленном помещении. Детей, посещающих детские дошкольные учреждения и школы, прививают в медицинских кабинетах этих учреждений или в специально выделенных и подготовленных помещениях.

Прививки проводит специально подготовленный средний медицинский персонал под руководством и ответственностью врача. Медицинские работники с гнойничковыми и респираторными заболеваниями к проведению прививок не допускаются.

Шприцы, объемом один миллилитр, и иглы к ним, а также другой инструментарий для проведения прививок, должны использоваться только для этой цели.

Прививки вакциной БЦЖ нельзя проводить в одной комнате и одновременно с другими прививками. Как исключение, разрешается проводить прививки вакциной БЦЖ в том же помещении, но в разные дни, при этом для вакцинации БЦЖ должен быть выделен специальный инструментарий. Категорически запрещается применять для проведения других прививок шприцы, иглы и стерилизаторы, которые используют для проведения прививки вакциной БЦЖ.

Непосредственно перед проведением прививок врач (фельдшер на фельдшерско-акушерском пункте) осматривает прививаемого с обязательной термометрией и соответствующей записью в истории развития ребенка, а на фельдшерских пунктах в журналах приема или истории развития ребенка. Необходимо учитывать характер общей и местной реакции на предыдущую прививку.

Прививки АКДС, АДС, АД проводят с соблюдением следующих требований: перед вскрытием каждую ампулу тщательно просматривают. Препарат не подлежит применению в следующих случаях: при отсутствии на ампуле этикетки или неполных сведений на ней; при наличии трещин ампулы; при содержании посторонних включений; при наличии неразбивающихся хлопьев; при истекшем сроке годности; при неправильном хранении. Содержимое ампулы непосредственно перед введением обязательно хорошо перемешивают путем встряхивания до полного разбивания комочков и получения гомогенной взвеси. Ампулы протирают стерильной ватой, смоченной спиртом, до и после надреза напильником, открытую ампулу покрывают стерильной салфеткой и используют немедленно. Для каждого прививаемого должны использоваться отдельный стерильный шприц и игла в целях предотвращения передачи сывороточного гепатита и других инфекций от одного лица к другому. Шприцы и иглы стерилизуют в автоклавах при температуре 126+/-2 град. С (давление 1,5 атм) в течение 30 мин. или сухожаровых шкафах сухим горячим воздухом при температуре 160 град. в течение 1 часа или при 180 град. в течение 40 минут. При отсутствии возможности стерилизации в автоклавах и сухожаровых аппаратах ее осуществляют кипячением в дистиллированной воде в течение 40 минут от момента закипания.

Вакцину набирают в шприц из ампулы длинной иглой с широким просветом. Для инъекции используют обязательно другую иглу. Кожу на месте укола протирают ватой, смоченной 70% спиртом, а затем йодом. После введения препарата место укола смазывают йодом и слегка массируют стерильным тампоном. Адсорбированные препараты (АКДС-вакцину и анатоксины) вводят внутримышечно в ягодицу или в передненаружную часть бедра. Анатоксины (АДС и АД) разрешается вводить подкожно в подлопаточную область.

Учитывая, что после введения АКДС-вакцины и анатоксинов в редчайших случаях у особо чувствительных детей может развиться шок, за каждым привитым необходимо обеспечить медицинское наблюдение в течение часа после прививки, а помещение, где проводятся прививки, должно быть обеспечено средствами противошоковой терапии (адреналин, норадреналин, кордиамин, кофеин, гидрокортизон и пр.).

V. Реакции на введение препаратов

У детей после введения вакцины могут наблюдаться общие и местные реакции. Учет реакции проводят не позже, чем через 24 часа после прививки. Для уменьшения общих реакций рекомендуется после введения (не позже, чем через 1-2 часа) и на ночь давать аспирин в дозе, соответствующей возрасту ребенка. Дети, имевшие в анамнезе судороги, связанные с повышением температуры, должны находиться под врачебным наблюдением и при повышении температуры получать энергичную антипиретическую терапию.

При введении АКДС-вакцины общая реакция проявляется в недомогании, повышении температуры. Повышение температуры до 37,5 град. расценивается как слабая, до 38,5 град. — средняя, 38,6 град. и выше — сильная реакция. Число общих сильных реакций после инъекции АКДС-вакцины при правильном отборе детей не должно превышать 1%. Местные реакции выражаются в покраснении и небольшом уплотнении (0,5-2,0 см в диаметре) на месте введения вакцины, обычно местные реакции заканчиваются через 2-5 дней. Иногда образуется узелок, который рассасывается в течение 20-30 дней без какого-либо вмешательства.

В исключительно редких случаях прививки АКДС-вакциной сопровождаются необычными реакциями (шок, судороги, аллергические высыпания и т.д.). Ребенку, давшему необычную реакцию, повторные прививки указанной вакциной делать нельзя. Эти дети могут быть привиты после консультации с педиатрами дифтерийно-столбнячным анатоксином, содержащим в 0,5 мл 5Lf дифтерийного и 5ЕС столбнячного анатоксинов. Детям, давшим вышеперечисленные реакции на введение анатоксинов, прививки прекращают.

При наличии сильных общих реакций на введение препаратов (свыше 1%), а также необычных реакций или сильных местных реакций (инфильтраты больше 2 см у 4% и более к числу привитых) прививки данной серией препарата прекращают; вопрос о дальнейшем ее использовании должен решаться Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (121002 Москва, Г-2, Сивцев Вражек, 41. Тел. 241-39-22).

При шоке рекомендуется введение адреналина (1:1000), кофеина, кордиамина в дозе, соответствующей возрасту ребенка, а также энергичное согревание, горячее питье, грелки, ингаляция кислорода, гормональные препараты.

Все произведенные прививки обязательно регистрируют в карте учета прививок (форма 63) и в истории развития ребенка, в сельской местности в журнале (форма 63-село), где отмечают дату прививки, дозу и № серии вакцины, № бутыли и институт, изготовивший препарат, место введения вакцины и реакцию на прививку. Персонал прививочных кабинетов в городе, фельдшера — в сельской местности на следующий день после прививок выборочно на дому проверяют степень реакции. Родители должны быть предварительно оповещены о проведении прививок детям (дата, против какой инфекции) и о необходимости наблюдения за детьми после прививки.

О всех случаях особо сильных реакций должно быть срочно сообщено в местный здравотдел и Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича и институт, изготовивший препарат. Материалы расследования необычной реакции на прививку направляются в Министерство здравоохранения СССР и в Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича (121002, Москва Г-2, Сивцев Вражек, 41).

Инструкцию по проведению профилактических прививок против коклюша, дифтерии и столбняка, утвержденную Министерством здравоохранения СССР 22 августа 1967 г. № 686-67 считать утратившей силу.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ И БОРЬБЕ С НОСИТЕЛЬСТВОМ ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ

Достигнутое резкое снижение заболеваемости дифтерией обеспечено оптимальным уровнем коллективного антитоксического иммунитета. Распространенность и динамика носительства токсигенных штаммов дифтерийных микробов взаимосвязаны с состоянием и динамикой заболеваемости дифтерией. Носители токсигенных дифтерийных бактерий являются активными источниками инфекции, поэтому в целях максимального выявления их, ограничения циркуляции возбудителя дифтерии и наблюдения за распространенностью токсигенных дифтерийных микробов необходимо проводить следующие мероприятия по выявлению и учету бактерионосителей.

I. ПОКАЗАНИЯ К ОБСЛЕДОВАНИЮ НА НОСИТЕЛЬСТВО ДИФТЕРИЙНЫХ БАКТЕРИЙ

Обследованию на бактерионосительство подлежат следующие контингенты:

1. С целью диагностики:

а) больные дифтерией;

б) дети и взрослые с острыми воспалительными явлениями в носоглотке при подозрении на дифтерийную этиологию заболевания (однократно).

2. По эпидемическим показаниям:

а) реконвалесценты дифтерии (дети и взрослые) перед допуском их в детские коллективы (однократно);

б) дети и взрослые (по роду работы связанные с детьми), бывшие в общении с источником инфекции (больной дифтерией, подозрительный на дифтерию, носитель токсигенных дифтерийных бактерий) однократно.

3. Профилактическому обследованию:

• учащиеся школ-интернатов, профтехучилищ в начале учебного года с целью ограничения заноса инфекции, по заключению эпидемиолога (в зависимости от эпидемической ситуации) однократно.

II. МЕРОПРИЯТИЯ В ОТНОШЕНИИ ВЫЯВЛЕННЫХ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ (РЕБЕНКА ИЛИ ВЗРОСЛОГО)

О каждом вновь выявленном бактерионосителе (токсигенный, атоксигенный) в санитарно-эпидемиологическую станцию направляется экстренное извещение (форма 58).

Эпидемиологическое обследование в очаге токсигенного носителя проводится врачом-эпидемиологом или его помощником при получении сведений из лаборатории с заполнением карты эпидемиологического обследования очага (форма 171-б).

В санитарно-эпидемиологической станции бактерионоситель регистрируется в журнале инфекционных заболеваний. Сведения о бактерионосителе вносятся в домовую картотеку по месту жительства носителя и картотеку детского учреждения, если ребенок (взрослый) посещает (работает) таковое.

При эпидемиологическом обследовании очага важно установить, были ли контакты с больным дифтерией или подозрительным на дифтерию в предшествующие 2-4 недели и были ли выявлены бактерионосители в текущем календарном году.

1. Мероприятия в отношении выявленного носителя токсигенного дифтерийного микроба

Вопрос о допуске бактерионосителя в коллектив решается комиссионно с участием эпидемиолога, педиатра и отоларинголога.

Носители токсигенных дифтерийных микробов, допущенные в коллектив, подлежат:

а) еженедельному бактериологическому обследованию (с проверкой токсигенности выделенного штамма) до получения двух отрицательных результатов исследования мазков из зева и носа:

б) продолжению лечения носоглотки;

в) за коллективом, куда допущен носитель, устанавливается наблюдение эпидемиолога, периодически проводятся медицинские осмотры с целью выявления детей с острыми воспалительными процессами в носоглотке, лечение их и обследование на носительство дифтерийных бактерий. В период пребывания в коллективе носителей токсигенных бактерий вновь принимаются только дети правильно привитые.

2. Мероприятия в отношении выявленного носителя атоксигенного дифтерийного микроба

Бактерионосители атоксигенных дифтерийных микробов, имеющие острые или хронические патологические процессы в носоглотке, подлежат лечению, из коллектива не удаляются.

3. Мероприятия в отношении лиц, общавшихся с бактерионосителем

В окружении носителя токсигенного дифтерийного микроба дети и взрослые подлежат однократному бактериологическому обследованию (граница очага определяется при эпидемиологическом обследовании).

При получении положительного результата исследования вопрос о посещении коллектива решается комиссионно с участием эпидемиолога.

III. МЕРОПРИЯТИЯ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЬСТВА

В настоящее время нет специфических средств борьбы с бактерионосительством. Исходя из этого, в системе мероприятий наиболее эффективными являются те, которые направлены на предупреждение длительных форм носительства. В числе таких мероприятий следует считать выявление и лечение детей с хроническими патологическими процессами в носоглотке.

Работа по выявлению детей с хроническими заболеваниями носоглотки и их лечение проводится детской поликлиникой.

Характеристика носителей дифтерийных бактерий

В настоящее время принята классификация носителей по типу возбудителя и состоянию зева и носоглотки носителя, что имеет эпидемиологическое обоснование.

1. Бактерионосители токсигенных дифтерийных микробов:

а) с острым воспалительным процессом в носоглотке, когда исключен диагноз дифтерии на основании комплексного обследования (в т.ч. количественное определение антитоксина);

б) с хроническим патологическим состоянием носоглотки;

в) со здоровой носоглоткой.

2. Бактерионосители атоксигенных дифтерийных микробов:

а) с острым воспалительным процессом в носоглотке;

б) с хроническим воспалительным состоянием носоглотки;

в) со здоровой носоглоткой.

II. По длительности выделения микроба (классификация проф. А. И. Титовой).

1. Транзиторное бактерионосительство (однократное обнаружение дифтерийных палочек).

2. Кратковременное носительство (микробы выделяются в течение двух недель).

3. Носительство средней продолжительности (микробы выделяются в течение одного месяца).

4. Затяжное и рецидивирующее носительство (микробы выделяются более одного месяца).

Характеристика бактерионосителей по указанным основным признакам позволяет выявить их эпидемиологическое значение в зависимости от токсигенности выделенного возбудителя, длительности и интенсивности выделения микроба, степень которой, как показали исследования, зависит от состояния зева и носоглотки носителя.

Учет носителей дифтерийных бактерий

1. В целях наблюдения за распространенностью дифтерийного носительства среди различных контингентов населения, динамикой его по годам в отдельных населенных пунктах необходимо в лабораториях вести персональный учет (в лицах) всех обследуемых. Для обеспечения такого учета и получения однородных сведений о бактерионосителе в направлении, сопровождающем материал в лабораторию, должна быть указана (кроме паспортных данных) цель обследования (больной, переболевший дифтерией, общавшийся с источником инфекции, бактерионоситель, обследуется планово или с профилактической целью).

Необходимо указать также кратность обследования, учитывая, что первичным считается первое обследование по каждому из указанных выше показаний; все последующие обследования (текущие и контрольные) одного и того же лица регистрируются как повторные.

Обследования по вновь возникшему аналогичному или другому показанию в том же календарном году также считаются первичными, учитывая большую вероятность реинфекции в связи с капельным, т.е. наиболее легко осуществляемым, механизмом передачи возбудителя дифтерии. От четкого указания показаний к обследованию зависит последующий анализ частоты выявления бактерионосителей среди различных групп обследованных. Поступившие анализы регистрируются в лабораторном журнале с обязательной отметкой о кратности данного обследования (для учета обследуемых в лицах).

При проведении профилактических обследований в школах-интернатах, профтехучилищах или при обследовании коллективов по эпидпоказаниям, регистрация их может проводиться по спискам (без заполнения направления). В этих случаях число первично обследованных лиц (по спискам) учитывают при подведении итогов за месяц. В конце года суммируются результаты месячных отчетов раздельно по каждому из показаний и определяется средняя частота выявления бактерионосителей в процентах к общему числу обследованных лиц с учетом кратности обследования.

Сведения о числе выявленных в течение года носителей указываются в отчетной форме 85 СЭС (в том числе токсигенных штаммов).

2. Для учета и характеристики выявленных носителей дифтерийного микроба и наблюдения за распространенностью бактерионосительства в санэпидстанциях должна быть картотека бактерионосителей, для чего следует использовать «карты эпидобследования очага». Указанная карта в санитарно-эпидемиологических станциях заполняется на каждого вновь выявленного носителя токсигенных дифтерийных бактерий врачом-эпидемиологом или его помощником на основании сведений, полученных из детской поликлиники, детского учреждения, лаборатории и результатов эпидобследования очага. Для клинической и иммунологической характеристики выявленных бактерионосителей токсигенных штаммов микроба в карту вносят сведения о состоянии носоглотки, противодифтерийных прививках (даты, дозы). Учет носителей, выделяющих атоксигенные штаммы, ведется в журнале или списке.

Врач-эпидемиолог в течение текущего года использует карты носителей токсигенных дифтерийных микробов и списки носителей атоксигенных микробов, как основной первичный материал для количественной характеристики состояния бактерионосительства в данном населенном пункте. На начало нового года остаются карты носителей, продолжающих выделять токсигенные дифтерийные бактерии. Ежемесячная разработка карт позволит эпидемиологу следить за числом выявленных носителей токсигенных дифтерийных микробов в различных группах обследованных и их территориальным распределением.

Примечание. При отсутствии возможности определения токсигенности в местной лаборатории, выделенный штамм дифтерийного микроба направляется в лабораторию городской или областной санэпидстанции. До получения ответа из лаборатории выделенный штамм дифтерийного возбудителя рассматривается как токсигенный.

Методические материалы по борьбе с дифтерийным бактерионосительством, утвержденные Министерством здравоохранения СССР 16 июня 1963 г. считать утратившими силу.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ РЕАКЦИИ ШИКА

Реакция Шика является относительным показателем состояния иммунитета в отношении дифтерии и применяется для выявления восприимчивых к этой инфекции контингентов среди детского населения.

Реакция Шика ставится детям, привитым против дифтерии, получившим законченную вакцинацию и не менее одной ревакцинации, но не ранее, чем через 8-10 месяцев после последней ревакцинации. Лицам 12 лет и старше р. Шика может ставиться по эпидпоказаниям. Повторная постановка р. Шика возможна не ранее, чем через год.

I. Показания к применению реакции Шика

1. Контроль за качеством проведения прививок детям в возрасте от 4 до 11 лет, получившим вакцинацию и первичную ревакцинацию в тех случаях, когда качество прививок вызывает сомнение (нечеткое заполнение учетных форм и т.п.), а также детям указанного возраста, прибывшим в тот или иной населенный пункт без документов о проведенных прививках.

2. По эпидемическим показаниям в очагах инфекции при наличии больного или носителя токсигенных штаммов дифтерийных бактерий для выявления восприимчивых лиц как в семьях, так и в организованных коллективах.

3. Для выявления неиммунных к дифтерии детей старшего школьного возраста и подростков (12-19 лет), прибывших в городские учебные заведения (школы-интернаты, ГПТУ, техникумы и т.д.) из сельской местности и проживающих в общежитиях. Вопрос о необходимости постановки реакции Шика этим контингентам решается эпидемиологом областной санитарно-эпидемиологической станции и участковым (районным) педиатром.

4. В целях эпидемиологического надзора за состоянием иммунитета среди детей прививаемых возрастов в сельской местности, независимо от наличия или отсутствия заболеваемости дифтерией.

Оценка противодифтерийного иммунитета в этих целях проводится путем выборочного обследования детей в сельских школах, школах-интернатах и других коллективах, объединяющих детей школьного возраста. Общий объем выборки в одном учреждении не должен превышать 10-15% от общего числа учащихся и включать детей всех возрастных групп.

Дальнейшие мероприятия определяются результатами выборочного обследования:

а) если число неиммунных составит не более 5%, то дополнительных мероприятий не проводится;

б) при выявлении детей с положительной реакцией Шика в пределах 6-15% к числу обследованных, проводится сплошное обследование детей учреждения с последующей ревакцинацией неиммунных;

в) при выявлении 20% и более неиммунных проводится дополнительная однократная ревакцинация всех детей, не имеющих медицинских противопоказаний. В этом случае интенсивность реакции Шика не учитывается.

Во всех других случаях (п.п. 1, 2, 3, 4б) дети с положительной и сомнительной реакцией Шика подлежат дополнительным прививкам в зависимости от интенсивности реакции Шика. Детей с сомнительной (+/-) или слабо положительной (+) реакциями прививают однократно; при интенсивно выраженной реакции (++ или +++) проводят двукратные прививки по типу вакцинации. Подростков (12-19 лет) независимо от интенсивности положительной реакции (+/-, +, ++, +++) с известным прививочным анамнезом прививают однократно в дозе 0,3 мл.

Дополнительные прививки по показаниям реакции Шика следует проводить адсорбированным дифтерийным или дифтерийно-столбнячным анатоксинами.

Последующие плановые ревакцинации детям проводят в предусмотренные инструкцией сроки, но не ранее, чем через 3 года после иммунизации по данным реакции Шика.

Положительная реакция Шика может быть обусловлена недавно перенесенным острым заболеванием у правильно привитых детей и подростков. Однако в настоящее время известно, что по мере восстановления общего состояния здоровья восстанавливается и антитоксический иммунитет к дифтерии. Учитывая это, лицам, перенесшим острые инфекционные заболевания, реакцию Шика необходимо ставить не ранее, чем через 2 месяца после их полного выздоровления. Лица с отрицательной реакцией Шика не подлежат прививкам, в последующем им проводятся возрастные ревакцинации согласно инструкции.

Результаты реакции Шика заносят в карту учета профилактических прививок (ф. 63) с указанием даты, постановки и проверки реакции, серии токсина и наименование института, изготовившего токсин.

Нельзя ограничиваться только количественными данными, полученными в результате постановки реакции Шика, а следует систематически анализировать эти материалы. Оценку полученных данных необходимо проводить в процессе работы и по окончании постановки реакции Шика (на участке, в учреждении) по следующим основным показателям:

1. процентному отношению числа положительных реакций Шика к числу проверенных, в том числе у лиц, посещающих и не посещающих детские учреждения по их типам, в городских и сельских профессионально-технических училищах, техникумах; в отдельных возрастных группах детей и подростков и т.д.;

2. сопоставлению иммунологических (р. Шика) и эпидемиологических данных (заболеваемость, бактерионосительство, летальность) в каждом учреждении, населенном пункте;

3. сопоставление полученных результатов реакции Шика с количеством проведенных детям ревакцинаций и сроков, прошедших со дня последней прививки.

Допускать к постановке реакции Шика и учету ее результатов средний медицинский персонал, прошедший специальную подготовку.

II. Методика постановки реакции Шика

Для постановки реакции Шика применяют разведенный дифтерийный токсин.

Перед инъекцией ампулу с токсином просматривают. На каждой ампуле с токсином должна быть наклеена этикетка с точным названием института, изготовившего препарат, номером серии токсина, номером контроля, сроком годности, указанием количества токсина в ампуле и дозы.

Нельзя применять токсин:

а) в случае повреждения ампулы (трещины);

б) при отсутствии этикетки;

в) при наличии в ампуле хлопьев, помутнения токсина и другие;

г) с истекшим сроком годности;

д) в случае нарушения условий хранения.

Для постановки реакции Шика должны применяться только однограммовые туберкулиновые тщательно проверенные шприцы с точной градуировкой, не пропускающие жидкости между стенками шприца и его поршнем, с хорошо подобранными иглами для внутрикожной инъекции.

Перед раздачей шприцов лечебным учреждениям проводить их проверку в санитарно-эпидемиологических станциях или прививочных кабинетах поликлиники.

Методика проверки шприца следующая: шприц наполняют дистиллированной водой, закрепляют в вертикальном положении иглой вниз в штативе Бунзена (штатив для бюреток). Поршень устанавливают на последнем делении шкалы шприца. Конец иглы вкалывают в резиновую пробку. На поршень шприца накладывают на 15 секунд гирю весом 0,5 кг. Шприц считают годным, если в течение 15 сек., при нагрузке 0,5 кг не обнаруживается просасывания воды за поршень у конуса или спайки шприца.

Категорически воспрещается постановка реакции Шика в помещениях, где в этот день проводилась ревакцинация против туберкулеза (БЦЖ), а также употребление шприцов, игл и прочего инструментария, применяющегося при иммунизации против туберкулеза.

Реакция Шика производится с соблюдением следующих требований: каждую ампулу перед вскрытием просматривают с целью выявления брака (трещин, наличия в ампуле хлопьев и т.д.). Шейку годной ампулы предварительно обтирают спиртом и вскрывают. Вскрытую ампулу используют немедленно. Перенос вскрытой ампулы из одного помещения в другое не допускается.

Перед употреблением шприцы и иглы стерилизуют в автоклавах при температуре 126 +/- 2 град. С (давление 1,5 атм) в течение 30 мин. или сухожаровых шкафах сухим горячим воздухом при температуре 160 град. С в течение 1 часа, или при 180 град. С в течение 40 мин.

При отсутствии возможности стерилизации в автоклавах и сухожаровых аппаратах ее осуществляют кипячением в дистиллированной воде в течение 40 минут от момента закипания. В процессе работы перед каждой стерилизацией предварительно промывают шприцы и иглы кипяченой водой. После стерилизации собранный шприц промывают небольшим количеством токсина и перед постановкой реакции Шика через иглу пропускают одну-две капли токсина. Для каждой инъекции обязательно берут отдельный шприц и отдельную иглу.

Кожу на месте инъекции протирают ватой, смоченной 70 град. спиртом.

Токсин вводят внутрикожно в количестве 0,2 мл в среднюю часть ладонной поверхности, как правило, левого предплечья. Введение токсина производится медленно с известным напряжением, характерным для внутрикожного введения жидкости. Шприц держат под очень небольшим уклоном, почти параллельно поверхности кожи руки. Срез иглы должен целиком войти в кожу и просвечивать через эпидермис. На месте инъекции образуется беловатый, хорошо ограниченный пузырек (папула) около 1 см в диаметре, имеющий вдавление на месте волосяных мешочков, что делает его похожим на лимонную корочку.

Этот пузырек (папула) рассасывается через 10-15 мин. Если при введении токсина пузырек (папула) не образуется или он исчезает слишком быстро, то это указывает, что инъекция сделана неправильно. Токсин, введенный подкожно, может не вызвать реакции, вследствие чего будет учтен неправильный (отрицательный) результат реакции Шика. В этих случаях результаты р. Шика не учитывают и повторно реакцию Шика не ставят.

III. Учет результатов реакции Шика

Учет результатов реакции производится через 72 или 96 часов. В отдельных случаях допускается проверка результатов позже 96 часов. В этот период, как правило, можно увидеть угасающую положительную реакцию. В течение месяца, а у некоторых детей и более длительно происходит угасание положительной реакции Шика, которое характеризуется постепенным изменением окраски кожи от ярко-синюшной до желтовато-коричневой, часто сопровождающейся шелушением.

Реакция Шика оценивается следующим образом:

а) реакция Шика положительная, если на месте введения токсина появляется кожная реакция в виде красноты и инфильтрата. Степень реакции обозначается: «+», если краснота имеет в диаметре 1,0-1,5 см, «++», если диаметр красноты равен 1,5-3,0 см; «+++», если он больше 3,0 см;

б) реакция Шика сомнительная, если краснота и инфильтрат при введении токсина либо выражены неясно, либо при выраженной реакции размер инфильтрата не превышает 0,5 см в диаметре (обозначается «+/-»);

в) реакция Шика отрицательная, когда на месте введения токсина краснота и инфильтрат отсутствуют.

При вычислении процента положительных реакций (иммунной прослойки) сомнительные реакции учитываются отдельно.

Срок годности токсина, выпускаемого в настоящее время для реакции Шика, установлен в 2 года с момента его изготовления при условии правильного хранения (в темном, сухом, прохладном месте при температуре от +3 до +10 град. С).

По всем вопросам, связанным с применением токсина для реакции Шика (образование хлопьев и т.д.), надлежит обращаться в институт, его изготовивший, а при необычных реакциях на введение сообщать в Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича Министерства здравоохранения СССР (Москва, 121002, Сивцев Вражек, 41. Тел. 241-39-22) и в Министерство здравоохранения республики.

Противопоказаниями постановки р. Шика являются:

а) спазмофилия;

б) эпилепсия;

в) гнойничковые заболевания;

г) контакт с больным инфекционным гепатитом;

д) аллергические заболевания (астма, экзема и др.);

е) повышенная температура тела;

ж) сильная реакция на парентеральное введение лекарственных и вакцинных препаратов (по анамнестическим данным).

3. Все заболевания, являющиеся противопоказаниями к иммунизации АДС или АД-анатоксинами.

Инструкцию по применению реакции Шика, утвержденную Министерством здравоохранения СССР 22 августа 1967 г., считать утратившей силу.

ИНСТРУКЦИЯ ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ НА ДИФТЕРИЮ

Взятие материала

1. При проведении анализов на дифтерию необходимо во всех случаях исследовать слизь и пленки из зева и носа. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище), помимо пораженных участков, следует брать материал из зева и носа.

2. Взятие мазков должно производиться специально инструктированным опытным персоналом.

3. Для взятия мазков используются стерильные сухие ватные тампоны. При транспортировке на дальние расстояния применяют среды обогащения или при их отсутствии тампоны, смоченные 5% раствором глицерина (5% раствор глицерина готовится на физиологическом растворе, pH доводится до 7,6 с помощью 20%; раствора Na2HPO3).

4. Для взятия слизи из зева и носа обязательно пользуются отдельными тампонами. Мазок из зева лучше брать натощак или не ранее, чем через 2 часа после еды. При проведении курса лечения больных или санации носителей антибиотиками мазки следует брать не ранее чем через 3 дня после окончания лечения. Мазок из зева необходимо брать под контролем глаза с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка, слизистой щек и зубов. При наличии налетов материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном.

5. Тампоны необходимо отправлять в лабораторию немедленно после взятия материала. Пробирки от одного лица (зев, нос, кожа) скрепляют вместе. На каждой пробирке должен быть четко написан порядковый номер анализа в соответствии с прилагаемым списком.

6. На все взятые анализы прилагается сопроводительный документ, где указывается фамилия и адрес лиц, у которых взяты анализы, происхождение взятого материала (зев, нос), название учреждения, направляющего материал, цель обследования (диагностическое, по эпид. показаниям, профилактическое обследование и др.).

Ход исследования

Первый день

1. Предварительная бактериоскопия мазка с тампона от больных делается только по требованию врача, направляющего анализ. С этой целью материал берется двумя тампонами. Один из них используют для посева, а другим делают несколько мазков на предметном стекле, поворачивая тампон всеми его сторонами. Высохшие на воздухе мазки фиксируют трехкратным проведением через пламя и окрашивают одной из следующих красок: щелочной метиленовой синью Леффлера, уксуснокислой телуидиновой синью, уксуснокислым кристалл-виолетом или метил-виолетом.

2. Материал из зева, носа и прочих пораженных мест от обследованных лиц любой категории засевается отдельно.

3. Исследуемый материал при поступлении в лабораторию немедленно засевается на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред в чашку Петри, а в ряде случаев — вначале инкубируется на среде обогащения (см. параграф 6), после чего делается высев на плотную среду в чашку. При посеве материала непосредственно от лиц, подозрительных на заболевание дифтерией, бактерионосителей и контактировавших с ними лиц, одна проба засевается на 1/2 чашки. При профилактическом обследовании здоровых лиц на носительство одна проба засевается на 1/2-1/4 чашки.

4. Не следует производить посев на охлажденную среду. Необходимо засевать в среду, стоявшую при комнатной температуре или согретую в термостате.

5. При посеве тампоном материал втирается в среду со всех сторон тампона на небольшом участке площадью 2 x 1 кв. см, затем растирается этим же тампоном штрихами по всей площади среды, отведенной для посева.

6. Среды обогащения необходимо использовать при транспортировке материала на дальние расстояния (свыше 3-х часов), а также рекомендуется их применение при обследовании на носительство. Тампон погружается в среду обогащения немедленно после взятия материала и в таком виде доставляется в лабораторию. Необходимо избегать намокания пробок. Доставленная в лабораторию среда обогащения с погруженным в нее тампоном сразу же помещается в термостат. При использовании сред обогащения посевы инкубируются в течение 18-20 часов. Затем после отжимания тампона о стенки пробирки и его удаления производят посев материала петлей на 1/2-1/4 часть чашки Петри с плотной питательной средой.

Второй день

7. Просмотр выросших на чашках колоний производится с помощью лупы не раньше, чем через 20-24 часа. При отсутствии подозрительных колоний чашки просматриваются через 48 часов. При исследовании материала от лиц, подозрительных на заболевание дифтерией, из нескольких однотипных подозрительных колоний делаются препараты-мазки. Результаты бактериоскопии используются для выдачи предварительного ответа. Следует помнить, что в мазках из колоний, выросших на рекомендуемых Инструкцией плотных средах, дифтерийные палочки недостаточно типичны морфологически: они укорочены, зернистость выражена слабо, однако присущее дифтерийным бактериям расположение и полиморфизм сохраняются.

Для выделения чистых культур и изучения их свойств с каждого посева отбирается несколько изолированных однотипных подозрительных колоний; 1-2 из них используются для посева одновременно из каждой колонии на 3 среды: одна половина колонии засевается в виде хорошо растертой «бляшки» на поверхность среды для определения токсигенности, после чего петля не обжигается и погружается в столбик среды для определения цистиназы; после обжига петли вторая половина колонии засевается путем тщательного втирания в поверхность свернутой сыворотки или сывороточного агара в пробирку. В случае отсутствия среды для определения цистиназы отсев из колоний следует производить на среды Гисса с сахарозой и глюкозой. Из оставшихся отобранных колоний делается посев на среду для определения токсигенности еще в виде 2 «бляшек» (не более 5-6 колоний на одну «бляшку»). Это необходимо в связи с тем, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности дифтерийной палочки.

Третий день

8. Через 20-24 часа производится бактериоскопия мазка из культуры, выросшей на свернутой сыворотке или сывороточном агаре, и учитываются результаты посева на двух других средах. Микроскопия мазка не позволяет установить видовую принадлежность микроба, но дает возможность предположительно отнести его к роду коринебактерий. Представители этого рода являются палочками, располагающимися параллельно или под углом, с характерными утолщениями на концах, нередко с выраженными зернами волютина. Обнаружение в мазках чистых культур кокков, дрожжей, споровых палочек и т.д. позволяет прекратить дальнейшее изучение выделенной культуры.

9. При обнаружении палочек, морфологически соответствующих коринебактериям, положительной пробе на цистиназу и появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, выделенная культура бактерий идентифицируется как токсигенная дифтерийная палочка.

При наличии первых двух признаков, но отсутствии специфических линий преципитации культура идентифицируется как дифтерийная, но чашки с «бляшками» инкубируются еще в течение 24 часов, после чего решается вопрос о ее токсигенности.

При обнаружении в мазке чистой культуры коринебактерий, но отрицательной на цистиназу и при отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов инкубации в термостате выделенная культура идентифицируется как коринебактерии иного вида, а не С. diphtheriae.

10. Для идентификации коринебактерий и для установления культурально-биохимического типа выделенных дифтерийных бактерий проводится дальнейшее изучение их биохимических свойств. Культура, выросшая на свернутой сыворотке (при условии, что микроскопия подтвердила ее чистоту), засевается на среды Гисса с сахарозой, глюкозой и крахмалом и на среду для определения уреазы.

Кроме того, делается посев выделенной чистой культуры на свернутую сыворотку или сывороточный агар для постановки реакции агглютинации.

Четвертый день

11. Производится учет посевов на средах «пестрого ряда».

Расщепление сахарозы дифтерийными бактериями, типичными по другим признакам, — явление крайне редкое. В таких случаях следует прежде всего думать о загрязнении культуры кокками.

Для решения этого вопроса следует сделать рассев со среды с сахарозой на одну из рекомендуемых Инструкцией плотных сред в чашку Петри и повторно выделенную дифтерийную культуру снова посеять на среды «пестрого ряда».

При обнаружении положительной пробы на уреазу у цистиназо-позитивных коринебактерий следует думать также о загрязнении дифтерийной культуры прежде всего ложнодифтерийной палочкой Гофмана. Для разграничения этих двух видов необходимо сделать рассев культуры со свернутой сыворотки на одну из плотных сред в чашку Петри, повторно выделить культуры коринебактерий и определить их биохимические свойства.

12. В качестве одного из тестов для идентификации дифтерийной палочки может ставиться реакция агглютинации с политиповой дифтерийной сывороткой.

13. По требованию эпидемиолога по возможности определяется серологический тип выделенной дифтерийной культуры. Для этого культуру, выросшую на свернутой сыворотке или сывороточном агаре, агглютинируют набором типовых агглютинирующих дифтерийных сывороток.

Сроки выдачи и формулировка ответов

1. Предварительный ответ выдается при исследовании материала из зева и носа у лиц больных дифтерией, подозрительных на заболевание дифтерией и у контактировавших с ними лиц. Он может быть выдан немедленно, если по требованию лечащего врача проводилась бактериоскопия мазка с тампона. В этом случае ответы формулируются так. «При прямой бактериоскопии мазка с тампона обнаружены палочки, подозрительные на дифтерийные, исследование продолжается» или «При прямой бактериоскопии мазка с тампона, палочки, подозрительные на дифтерийные, не обнаружены, исследование продолжается».

Предварительный ответ при обследовании указанной категории лиц обязательно выдается бактериологом через 24-48 часов после посева материала на чашки (в случае применения сред обогащения этот срок может быть увеличен еще на 24 часа) на основании макроскопического и микроскопического изучения выросших колоний и формулируется так:

«В посевах материала из зева (носа) обнаружены бактерии, подозрительные на дифтерийные, исследование продолжается».

При отсутствии подозрительных колоний выданный отрицательный ответ является окончательным.

2. При обследовании на бактерионосительство с профилактической целью, а также при обследовании материала из мест редкой локализации дифтерии предварительный ответ не выдается. В этих случаях выдается только окончательный ответ, основанный на идентификации выделенных культур по всем свойствам.

3. Окончательный ответ при обследовании лиц всех категорий в случае обнаружения дифтерийных колоний в чашках Петри через 24 часа может быть выдан через 48 часов (культура токсигенная) или через 72 часа (культура нетоксигенная). В тех случаях, когда колонии в чашках появляются позднее, чем через 24 часа, ответ выдается соответственно позднее. При применении сред обогащения срок выдачи ответа отодвигается еще на 24 часа.

4. Формулировка окончательного ответа при положительном анализе: «Выделены токсигенные (или атоксигенные) дифтерийные палочки». При изучении культурально-биохимических признаков указывается принадлежность к типу гравис или митис, а при серотипировании культуры указывается ее серологический тип.

5. В тех случаях, когда в предварительном ответе указывается, что обнаружена дифтерийная палочка, а при последующем изучении выделен дифтероид или другая микрофлора, окончательный ответ формулируется так: «При дальнейшем исследовании обнаруженная палочка оказалась не принадлежащей к виду С. diphtheriae».

6. При необнаружении дифтерийных палочек на плотных питательных средах выдается отрицательный ответ.

7. Во всех случаях обнаружения дифтерийных микробов лаборатория обязана известить то учреждение, от которого послан анализ, и районного эпидемиолога.

8. При передаче ответа по телефону необходимо записывать дату передачи и фамилии лиц, передавших и принявших телефонограмму.

Методика определения токсигенности на плотных питательных средах

Токсигенность дифтерийного микроба определяется, как правило, в чистой культуре. Культуры, случайно загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии в этих случаях преципитатов в агаровом геле опыт следует повторить с выделенными из них чистыми культурами.

В недостаточно прозрачных и темно окрашенных средах плохо выявляются линии преципитации, поэтому окрашенные сорта агар-агара рекомендуется промывать в проточной воде в течение рабочего дня, а питательные основы фильтровать через тканевые <*> или ватно-марлевые фильтры.

---

<*> Лучшей тканью является полотно Бельтинга, которое изготовляет Ярославский комбинат «Красный Перекоп».

Следует строго следить за установлением оптимальной для токсинообразования дифтерийных микробов pH среды, равной 7,8. Необходимо помнить, что среды, предназначенные для теста токсигенности, отличаются особой чувствительностью к длительному термическому воздействию, поэтому питательная основа должна подвергаться лишь однократной термической обработке текучим паром в течение 30 минут и сохраняться при температуре от +4 град. C до +10 град. C.

Для работы применяются нормальные сыворотки животных без консерванта или консервированные хлороформом. Наличие сильной мути, большого количества гемолизированных эритроцитов делает сыворотки непригодными для теста токсигенности. Кроме того, непригодны сыворотки, содержащие дифтерийный антитоксин, что может быть выявлено только при испытании этих сывороток в лаборатории. Поэтому целесообразно осуществлять предварительную проверку вновь получаемых каждой лабораторией серий нормальной лошадиной сыворотки, вводя ее в состав среды.

Каждую серию готовой среды следует обязательно проверять путем посева на нее контрольного заведомо токсигенного штамма дифтерийной палочки. Пригодными для работы считаются те серии среды, при использовании которых у токсигенного штамма интенсивные преципитаты образуются в течение 20-24 часов после посева. Среда не может быть использована и подлежит замене в случае отсутствия преципитатов или при появлении их в более поздние сроки.

Предварительная проверка среды не исключает необходимости контроля каждого отдельного опыта.

В стерильные чашки Петри с совершенно ровным дном (диаметр 10 см) наливают расплавленную и охлажденную до 50 град. C готовую питательную среду (12 мл). На середину чашки после застывания среды помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченную антитоксической (диаферм или однозональной) противодифтерийной сывороткой, после чего подсушивают чашки в термостате 15-20 мин. при -37 град. C.

Приготовление бумажных полосок

Полоски фильтровальной бумаги размером 1,5 x 8 см завертывают в бумажные пакетики по 4 шт. и стерилизуют в автоклаве при температуре 120 град. C в течение 30 минут. По мере надобности бумажную полоску обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри и смачивают антитоксической противодифтерийной сывороткой, которую предварительно разводят физиологическим раствором до содержания 500 АЕ в 1 мл. Разведенный препарат можно хранить в холодильнике в течение 10 дней. На смачивание одной бумажной полоски идет 0,25 мл (100-120 АЕ) антитоксической противодифтерийной сыворотки.

Посев материала

Испытуемые культуры засевают в виде «бляшек» диаметром 1 см по обе стороны от полоски фильтровальной бумаги на расстоянии друг от друга и от края бумажки 0,5 см. Для посева берут материал петлей как из 2 отдельных колоний, так и из 5-6 колоний одновременно и засевают одной «бляшкой». На одну чашку засевают одновременно 10 «бляшек» (4 испытуемых, 6-контрольных). В случае необходимости экономии среды можно засевать 4 контрольных и 6 «опытных бляшек». Контролем служит заведомо токсигенный штамм, который засевается между испытуемыми культурами. Засеянные чашки помещают в термостат при температуре 37 град. C.

Учет результатов

Через 18-24 часа чашки просматривают с лупой в проходящем свете, на темном фоне. Через 48 часов преципитаты становятся компактнее и уже видны невооруженным глазом. Результаты учитываются ежедневно в течение 48 часов, а при применении бессывороточных сред — в течение 72 часов.

При использовании в составе среды антитоксической противодифтерийной сыворотки следует учитывать, что появление преципитатов в агаровом геле у дифтерийных культур возможно не только за счет взаимодействия токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и за счет взаимодействия бактериальных антител с соответствующими антигенами микробной клетки (неспецифические преципитаты).

Неспецифические преципитаты могут образовываться, как у токсигенных, так и у нетоксигенных дифтерийных культур. Эти преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, иногда видимые только в лупу, появляются чаще через 48-72 часа, но у некоторых штаммов — и на 1-e сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям контрольного (заведомо токсигенного штамма). В тех случаях, когда у контрольного штамма появляется несколько линий преципитации, специфическими следует считать наиболее четкие и наиболее рано появляющиеся преципитаты. Наблюдаются следующие варианты в образовании преципитатов:

1. Испытуемая дифтерийная культура, у которой образуются преципитаты, считается токсигенной, если эти линии преципитации сливаются с соответствующими специфическими линиями заведомо токсигенного штамма или идут на смыкание с ними (схема 1). <*>

2. Испытуемая дифтерийная культура считается нетоксигенной, если ее линии преципитации располагаются так, что концы их не могут слиться с концами специфических линий контрольного штамма:

а) линии испытуемого штамма идут на перекрест со специфическими линиями контрольного штамма (схема 3); <*>

б) линии преципитации испытуемого штамма перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма (схема 3); <*>

в) линии преципитации испытуемого штамма сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма (схема 2 и 3).<*>

Иногда отмечается появление множественных неспецифических линий преципитации.

В качестве контрольного штамма следует применять одно- или двухсуточную токсигенную культуру.

При изменении токсигенных свойств контрольных штаммов культуру проводят через кровяной агар и отбирают соответствующие колонии (по токсигенности).

Контрольный токсигенный штамм рекомендуется получать в НИИВСах, НИИЭМГах, в лабораториях городских и областных СЭС.

---

<*> Не приводятся.

Хранение штаммов в условиях лаборатории

Штаммы хранятся в лаборатории при температуре от +4 град. С до +10 град. С:

а) на свернутой сыворотке (пересев каждые 14 дней);

б) на 10% сывороточном агаре (пересев каждые 14 дней);

в) в 10% желатине, приготовленной на мартеновском бульоне, pH = 7,6 (пересев 1 раз в 3 месяца);

г) в мартеновском бульоне, pH = 7,6, под стерильным вазелиновым маслом (пересев 1 раз в 3 месяца);

д) на 0,1% полужидком агаре, приготовленном на мартеновском бульоне, pH = 7,6 (пересев 1 раз в 3 месяца).

Методика серологической идентификации и серотипирования

При серологическом изучении дифтерийных микробов в Советском Союзе пользуются классификацией, утвержденной 30 декабря 1960 г. МЗ СССР. Согласно этой классификации, дифтерийные штаммы подразделяются на 7 основных и 4 дополнительных серотипа, обозначенных арабскими цифрами.

Агглютинирующие сыворотки выпускаются: неадсорбированные политиповые для реакции агглютинации на стекле и неадсорбированные типовые для линейной реакции агглютинации.

Политиповые сыворотки выпускаются в виде 2 смесей, одна — охватывает основные серологические типы возбудителя, другая — редкие типы. Политиповая дифтерийная сыворотка применяется для дифференциации дифтерийных микробов от других представителей коринебактерий. Для работы сыворотку разводят до рабочего разведения 3% солевым раствором (pH = 7,6) <*>. Для реакции агглютинации на стекле используют суточную дифтерийную культуру, выросшую на свернутой сыворотке или 10% сывороточном агаре. Вначале ставят контроль в капле солевого раствора, спонтанно агглютинирующиеся культуры дальше не изучают. Культуру или ее взвесь тщательно растирают петлей и постепенно смешивают с каплей сыворотки. В случае некоторой негомогенности культуры, рекомендуется для постановки реакции агглютинации на стекле использовать густой смыв ее, профильтрованный через вату, накрученную на кончик пастеровской пипетки.

---

<*> К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 3 г NaCl и устанавливают pH = 7,6 путем прибавления 5% раствора Na2HPO4. Солевой раствор стерилизуют трехкратно текучим паром.

Положительная реакция характеризуется появлением агглютината (2-3 минуты). При оценке интенсивности агглютинации лучше пользоваться вогнутым зеркалом.

При необходимости определения серологического типа можно проводить ориентировочную реакцию на стекле с типовыми (1, 2, 3, 4, 6, 7, 9 типов) неадсорбированными сыворотками в разведении 1:25-1:50. Окончательно серологический тип определяется в линейной реакции агглютинации. Для этого взвесь испытуемой культуры в солевом растворе (густотой около 2 млрд.) набирают стерильной пастеровской пипеткой через ватный фильтр: 1-2 капли такой гомогенной взвеси закапывают в пробирки с разведенными (в объеме 0,5) до титра сыворотками, начиная с 1:100. Пробирки помещают в термостат до следующего дня. Результат реакции учитывают невооруженным глазом по характеру выпавшего агглютината и степени просветления надосадочной жидкости, без встряхивания. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, при которой наблюдается плотный осадок зонтиком и полное просветление жидкости над ним. При отчетливом осадке зонтиком и слегка опалесцирующей жидкости реакцию считают на 3 плюса. Два — одноплюсовый результат, когда полупрозрачная надосадочная жидкость и очень слабый рыхлый зонтик, более четко выявляемый при легком постукивании пальцем по пробирке. Отрицательный результат — жидкость в пробирке мутная с плотным осадком бляшкой. Так же выглядят контрольные пробирки солевого раствора с испытуемой культурой.

Культура относится к тому серологическому типу, с сывороткой которого положительная реакция наблюдалась в разведении, не меньшем чем половина титра сыворотки, указанного на этикетке.

В том случае, когда после вскрытия ампулы сыворотка не может быть сразу использована, ампулу с оставшейся сывороткой запаивают или сыворотку переливают в стерильную пробирку с соблюдением всех правил обращения со стерильным препаратом. Агглютинирующая сыворотка хранится в сухом месте при температуре от +4 град. до +10 град. В том случае, если для работы применяется высушенная сыворотка, ее следует перед употреблением растворить в стерильной дистиллированной воде из расчета 1 мл на 1 ампулу. Срок годности сухой сыворотки 3 года.

Для приготовления тампонов используются либо деревянные, либо металлические палочки из алюминиевой проволоки, на один из концов которых плотно накручивается слой гигроскопической ваты (примерно 120 мг ваты на тампон). Тампоны монтируют в пробирку с корковыми или ватными пробками.

Стерилизовать тампоны можно в сушильном шкафу при температуре 140-150 град. C в течение часа или в автоклаве при температуре 112 град. C в течение 30 минут.

Тампоны, смоченные в 5% глицерине, стерилизуются только в автоклаве.

Рецепты красок

1. <a id="p100345"></a>Щелочная метиленовая синь Леффлера:

    Дистиллированная вода               - 99 мл
    1% раствор едкого кали (КОН)        - 1 мл

Профильтрованный спиртовый
раствор метиленовой сини (3 г
метиленовой сини на 30 мл спирта)   - 30 мл
Окрашивать в течение 1-2 минут.

            2. <a id="p100346"></a>Уксуснокислая толуидиновая синь:

    Толуидиновая синь                   - 0,25-0,5 г
    Ледяная уксусная кислота            - 2 мл
    98 град. этиловый спирт             - 5 мл
    Дистиллированная вода               - до 100 мл

Окрашивать в течение 3-5 минут


          3. <a id="p100347"></a>Метил-виолет или кристалл-виолет:

Метил-виолет или                    - 0,25 г
кристалл-виолет
5% раствор уксусной кислоты         - 100 мл
Профильтровать
Окрашивать в течение 5-10 минут.

При приготовлении красок по любому из вышеуказанных методов следует помнить, что краски при длительном хранении в разведенном состоянии могут утрачивать свои свойства, поэтому их следует хранить не более месяца в темном месте во флаконах темного стекла.

МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

I. СРЕДЫ ОБОГАЩЕНИЯ

Полужидкая среда

В качестве питательной основы используется 0,1% мясо-пептонный агар или 0,1% агар на переваре Хоттингера, pH — 7,6. Можно также использовать сухой питательный агар Дагестанского института питательных сред. В последнем случае варится среда из расчета 0,3 г сухого питательного агара на 100 мл 1% пептонной воды, pH — 7,6.

Полужидкая среда разливается в пробирки по 5 мл и стерилизуется в автоклаве при температуре 120 град. С в течение 30 минут. Перед употреблением в каждую пробирку с соблюдением правил асептики добавляется 0,5 мл нормальной лошадиной или бычьей сыворотки, желательна предварительная инактивация сыворотки при температуре 56 град. С в течение 30 минут. Затем в каждую пробирку закапывают по 1 капле (0,05 мл) 2% раствора теллурита калия. Следует помнить, что тампоны, предназначенные для погружения в среду, должны быть укреплены на деревянных палочках, сделанных из сухого несмолистого дерева или из неокисляемого металла.

II. СРЕДЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ

В качестве питательной основы могут быть использованы: сухие питательные агары (лучше агар «Д») Дагестанского научно-исследовательского института питательных сред; мартеновский, мясо-пептонный агар и агар на переваре мяса по типу Хоттингера.

Для приготовления кровяного агара может быть использована дефибринированная гемолизированная кровь человека (донорская или плацентарная), кровь животных (крупного рогатого скота, барана, кролика и т.д.). Гемолиз достигается путем добавления небольшого количества дистиллированной воды или замораживанием и быстрым оттаиванием.

При отсутствии цельной крови можно использовать кровяные сгустки, остающиеся после отсасывания сыворотки для производства гамма-глобулина или для постановки серологических реакций Вассермана, Видаля, Райта и др. (при условии отрицательного результата этих реакций). Можно применять сгустки плацентарной крови, полученной непосредственно от рожениц.

Цитратная кровь, применяемая для переливания крови, не пригодна, т.к. содержащиеся в ней антисептики препятствуют росту дифтерийных микробов.

Для приготовления цистин-теллурит сывороточной среды лучше использовать лошадиную сыворотку, а при ее отсутствии — сыворотку крупного рогатого скота.

Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в составе среды применяют теллурит калия или хинозол.

Ввиду нестандартности питательных основ и ингредиентов, каждую новую серию следует предварительно проверить путем посева на нее взвеси чистой дифтерийной культуры. Показатели пригодности среды для работы: наличие через 24 часа пышного роста дифтерийных микробов, а на цистин-теллурит-сывороточной среде еще и образование четких коричневых ореолов вокруг изолированных колоний.

Перед рассевом необходимо производить подсушивание питательной среды путем помещения чашек в термостат или под фильтровальную бумагу.

а) Среда Клауберга II

К 100 мл расплавленного 3% питательного агара при pH = 7,6 (или 7,5 г сухого питательного агара, лучше агара «Д», на 100 мл дистиллированной воды или на бульоне Хоттингера) добавить 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл «лаковой» крови. Среду разливают по чашкам Петри слоем 3-4 мм. Чашки можно сохранять в холодильниках при температуре от +4 град. С до +10 град. С не более 3-4 суток.

Приготовление глицериновой смеси

К 40 мл дефибринированной крови донора или рогатого скота добавить 20 мл химически чистого стерильного глицерина (глицерин стерилизуют при температуре 110 град. С в течение 30 минут). Если используемая кровь нестерильна, то смесь рекомендуют выдерживать в холодильнике при температуре от +4 град. С до +10 град. С течение 3-6 недель.

Приготовление «лаковой» крови

К 34 мл стерильной дистиллированной воды добавить 16 мл дефибринированной крови (донора или рогатого скота).

Приготовление теллурита калия (K2TeO3)

Для приготовления теллуритовых сред может быть использован готовый 2% раствор теллурита калия в 40% растворе глицерина, выпускаемый Московским химфармзаводом им. Семашко.

В случае отсутствия готового раствора теллурита калия его готовят следующим образом. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 2 г теллурита калия. Раствор стерилизуют нагреванием в кипящей бане в течение 30 минут и сохраняют при комнатной температуре. В случае выпадения осадка раствор вновь прогревают в водяной бане до полного растворения осадка. При плохой растворимости порошкообразного теллурита готовят 1% раствор, но соответственно добавляют его к средам в двойном объеме. Порошкообразный теллурит калия необходимо хранить в банке темного стекла с притертой пробкой, учитывая его гигроскопичность.

б) Кровяной теллуритовый агар

К 100 мл 2% питательного агара при pH =7,6 (или 7,5 г сухого питательного агара или агара «Д» на 100 мл дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50 град. C, добавляют 10-15 мл гемолизированной крови и 2 мл 2% раствора теллурита калия. Тщательно смешивают и разливают в чашки Петри слоем 3-4 мм.

Гемолизированную кровь можно получить путем вымывания гемоглобина из сгустков крови. Сгустки сливают над пламенем горелки в стерильную колбу с бусами и после добавления стерильной дистиллированной воды в объеме, равном 1/2-1/3 объема сгустков, встряхивают в течение 20-30 минут. Смесь оставляют в холодильнике при температуре от + 4 град. C до +10 град. C на сутки, что способствует более полному вымыванию гемоглобина из сгустков. Полученную кровянистую жидкость отсасывают в пробирки и добавляют ее к расплавленному и охлажденному до 50 град. С питательному агару в количестве 10-15%.

В процессе сбора и обработки сгустков может быть нарушена их стерильность, но последующее добавление к среде теллурита калия обеспечивает угнетение роста посторонней микрофлоры в течение первых 2-х суток.

Для лучшего сохранения гемолизированной крови, полученной из сгустков, к ней добавляют 2% раствор теллурита калия из расчета 1,5 мл на каждые 14 мл крови. Смесь крови с теллуритом сохраняется в холодильнике в течение 2-х недель. Для приготовления среды на каждые 100 мл растопленного питательного агара добавляется 15,5 мл смеси.

Чашки с кровяно-теллуритовым агаром можно хранить в условиях холодильника не более 3-4 суток.

На кровяно-теллуритовых средах колонии дифтерийных палочек вырастают через 24-48 часов. Дифтерийные палочки типа гравис растут в виде суховатых серо-черных колоний с приподнятым центром и изрезанными краями; колонии дифтерийной палочки типа митис — более мелкие, блестящие, с ровными краями. Штаммы типа интермедиус растут в виде мелких черных выпуклых колоний.

в) Сухая хинозольная индикаторная среда Бучина

Поскольку среда не подлежит дальнейшей стерилизации, ее готовят с соблюдением всех правил асептики.

К 100 мл холодной воды (pH = 7,6; 7,8) добавляют 7-8 г (согласно прописи на этикетке) порошка сухой хинозольной среды, тщательно размешивают и нагревают на слабом огне до полного расплавления агара. Среду кипятят в течение 2-3 минут, не допуская пригорания агара, до образования крупнопузырчатой, быстро оседающей пены.

К охлажденной до 50 град. С среде добавляют 5 мл (лучше 10-15 мл) стерильной крови, размешивают и разливают по чашкам Петри слоем 3-4 мм. После застывания среду слегка подсушивают в термостате и она может быть использована в течение 3-4 суток при условии хранения при температуре от +4 град. С до +10 град. С. Приготовленная среда имеет темно-синий цвет. Колонии дифтерийных палочек вырастают через 24-48 часов, при этом восстанавливают индикатор и среда приобретает фиолетовый цвет на месте роста колоний дифтерийных микробов. Колонии дифтерийных палочек окрашиваются в синий цвет.

Для приготовления хинозольной индикаторной среды может быть использована стерильная дефибринированная кровь человека (донорская или плацентарная) или кровь животного (рогатого скота, кролика и т.д.).

г) Цистин-теллурит-сывороточная среда Тинсдаля модифицированная

К 100 мл 2% питательного агара при pH = 7,6 (или 5 г сухого питательного агара, лучше агара «Д» на 100 мл дистиллированной воды), расплавленного и охлажденного до 50 град. С добавляют последовательно следующие ингредиенты:

1) <a id="p100386"></a>1% раствор цистина на 0,1 N растворе

H2S04 (или HCl при отсутствии

       серной кислоты)                       - 12 мл
    2) 0,1 N раствор NaOH                    - 12 мл
    3) 2% раствор теллурита калия            - 1,8 мл
    4) 2,5% раствор гипосульфита натрия      - 1,8 мл

5) <a id="p100392"></a>Нормальная лошадиная или бычья

сыворотка (лучше лошадиная) — 20 мл

После добавления каждого ингредиента среду тщательно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем 3-4 мм.

Цистин не растворим в воде, поэтому его вводят в среду в виде 1% раствора на 0,1 № растворе H2S04 или HCl.

Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты.

Растворы кислоты и щелочи должны быть взаимно строго оттитрованы. Для работы могут быть использованы фиксаналы, выпускаемые предприятиями химической промышленности.

Все растворы можно приготовить впрок и хранить при комнатной температуре в темном месте в посуде с притертой пробкой. Выпадение хлопьев или помутнение раствора указывает на непригодность их для дальнейшего использования.

Раствор гипосульфита натрия (2,5%) готовят на стерильной дистиллированной воде. Раствор не стоек, поэтому его необходимо еженедельно обновлять и хранить в посуде из темного стекла.

При использовании сухих агаров в питательную основу можно вводить 0,5% пептона, при этом 1% раствор цистина добавляют в количестве 6 мл и соответственно щелочи — 6 мл. Остальные ингредиенты берут в указанных выше количествах.

Чашки с питательной средой можно хранить в условиях холодильника при температуре от +4 град. С до +10 град. С не более 3-4 суток.

Выросшие колонии дифтерийного микроба изучают в косопроходящем свете невооруженным глазом или с помощью лупы. При наличии в посевном материале дифтерийных палочек обычно через 24 часа (иногда через 48 часов) на поверхности питательной среды вырастают круглые, выпуклые, блестящие, черные или темно-коричневые колонии, окруженные темно-коричневым ореолом. Появление ореолов вокруг изолированных колоний является специфическим признаком дифтерийного микроба.

Выделению и изучению подлежат только отдельные изолированные колонии, окруженные четко выраженным коричневым ореолом, образующимся не позже, чем через 24-48 часов после посева.

III. СРЕДЫ ДЛЯ ПЕРВИЧНОГО ОТСЕВА КОЛОНИЙ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ДИФТЕРИЙНОГО МИКРОБА

Приготовление свернутой сыворотки

а) Для приготовления свернутой сыворотки используют специально выпускаемые стерильные нормальные лошадиные сыворотки или нативные сыворотки крупного рогатого скота без консервантов или консервированные хлороформом. Эти сыворотки можно использовать как в неразведенном виде (среда (Ру), так и разведенные (среда Леффлера). Для этого смешивают 3 части лошадиной сыворотки с 1 частью 1% сахарного мясо-пептонного бульона (pH — 7,6).

б) В тех случаях, когда лаборатория готовит сыворотку из крови, полученной на бойне, кровь стерильно берут венопункцией или собирают из бьющей струи при убое животного в стерильные сосуды (нельзя брать первых порций крови). До стерилизации в эти сосуды наливают небольшое количество (20-30 мл) физиологического раствора для смачивания им стенок сосуда перед взятием крови для того, чтобы сгусток не прилипал к ним. Для свертывания кровь помещают на полчаса в термостат, затем обводят сгусток стерильной стеклянной палочкой или пипеткой и переносят в холод на сутки для отстаивания сыворотки. Отделившуюся сыворотку отсасывают в стерильную бутыль и добавляют 0,5% хлороформа для ее консервирования и хранят при температуре от +4 град. С до +10 град. С.

Для свертывания сыворотку разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки укладывают рядами (скос должен начинаться со дна пробирки) в аппарат для свертывания, предварительно подогретый до 50 град. С. Для равномерного свертывания и предотвращения образования пузырей в сыворотке температуру в аппарате постепенно доводят до 80 град. С и держат в течение часа, затем пробирки со свернутой сывороткой вынимают из свертывателя.

Во избежание высыхания сыворотку охлаждают при комнатной температуре и хранят при температуре от +4 град. С до +10 град. С. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду. Каждая партия свернутой сыворотки проверяется на стерильность: несколько пробирок из этой партии помещают на сутки в термостат. В случае прорастания среды уничтожается вся партия свернутой сыворотки.

Сыворотка, полученная лабораторией на бойне, свертывается двукратно, как указано выше.

Пробирки со свернутой сывороткой могут храниться в лаборатории в условиях холодильника не дольше 2 недель.

Приготовление сывороточного агара

Эта среда применяется в тех же случаях, что и свернутая сыворотка. Сывороточный агар может быть приготовлен на любой питательной основе, применяемой для культивирования дифтерийных бактерий.

К 100 мл расплавленного и охлажденного до 50 град. С питательного агара (pH — 7,6) стерильно добавляют 10 мл лошадиной или бычьей сыворотки. После перемешивания среду разливают в стерильные пробирки по 3-4 мл, которые укладывают в наклонном положении для образования скоса. Контроль стерильности и хранение среды производится так же, как и свернутой сыворотки.

IV. СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТОКСИГЕННОСТИ

1. Приготовление мартеновского агара с мясной водой двойной концентрации

Приготовление мартеновского пептона

Свиные желудки, желательно парные, с упругими стенками, с большим количеством слизи и без катаральных явлений очищают от жира (желудки, пропитанные желчью отбрасывают), разрезают и измельчают в мясорубке. Полученный фарш из желудков помещают в бутыли емкостью 3-5 л и заливают подогретой до 40-50 град. С водопроводной водой из расчета на один литр воды 300-350 г измельченной массы. Температура должна быть 40 град. С. Туда же прибавляют 1% химически чистой соляной кислоты (уд. вес. 1,19). Массу хорошо перемешивают и ставят в термостат при температуре 37-40 град. С на 15 часов, не закрывая бутыль пробкой. В течение процесса переваривания бутыль встряхивают, вначале чаще (через 1-2 часа), затем реже. В хорошо переваренном пептоне на дне бутыли лежит небольшой слой тонкого осадка. Если осадок недостаточно мелкий, нужно продлить переваривание на несколько часов.

Полноту осаждения балластных белков можно проверить путем добавления к 5 мл профильтрованного пептона 1-2 капли 10% NaOH. Муть не должна появляться.

Действие фермента останавливают нагреванием в водяной бане, постепенно доводя температуру до 80 град. С, устанавливаемую по показанию термометра, погруженного в бутыль с переваром. Нагревание продолжают в течение 10 минут. Бутыли тщательно взбалтывают, закрывают пробкой и ставят в прохладное, сухое помещение для отстаивания при температуре не выше +12 град. С. Пептон годен к употреблению не ранее чем через 7 дней, когда плотно осядут взвешенные частицы.

Необходимо добавить 20 мл хлороформа на 1 л пептона для консервирования и закрыть бутыль резиновой пробкой. В таком виде пептон может храниться без стерилизации при комнатной температуре.

Приготовление мясной воды

Для приготовления мясной воды желательно пользоваться свежим не мороженным мясом средней упитанности нестарого животного. Обезжиренное, освобожденное от сухожилий мясо пропускают через мясорубку, заливают водой в пропорции 0,5 л воды на 0,5 кг фарша и оставляют на холоде при температуре от +4 град. С до +10 град. С в течение 16-20 часов, после чего настой кипятят на асбестовой сетке в течение 30 минут с момента закипания. Готовый настой фильтруют, стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 минут или, если нужно, сразу соединяют с пептоном.

Приготовление питательного агара

    Мартеновский пептон             -  0,5 л
    Мясная вода                     -  0,5 л
    Агар - агар                     - 15 г
    Уксуснокислый натрий            - 5 г
    Мальтоза                        - 3 г

15 г агара промывают в течение рабочего дня в проточной водопроводной воде, тщательно отжимают и переносят в 1 л мартеновского бульона (0,5 л мартеновского пептона и 0,5 л мясной воды). Устанавливают pH = 7,8-8,0 путем подщелачивания бульона 20% раствором NaOH по бумажке крезолрот, которая при этой реакции изменяет желтый цвет в малиново-розовый. Бульон кипятят в течение 10 минут, считая с момента закипания, затем добавляют 0,5% (5 г на 1 л) уксуснокислого натрия, 0,3% мальтозы (3 г на 1 л), проверяют pH и, если нужно, снова доводят до 7,8-8,0, кипятят в течение 15 минут дают отстояться в теплом месте 2-3 часа и фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром в течение 30 минут.

Перед разливкой в чашки Петри к растопленному и охлажденному до 50 град. С питательному агару добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или 30% сыворотки крупного рогатого скота.

Приготовление бумажек с крезоловым красным

0,1 г крезолрот растворяют в 100 мл 95% спирта и оставляют при температуре 37 град. С на 24 часа, часто встряхивая. На следующий день смачивают в этом растворе полоски фильтровальной бумаги и быстро высушивают. Ярко-желтый цвет бумажек в щелочной среде переходит в разные оттенки красного.

Приготовление мартен-цистин-агаровой среды с добавлением нормальной сыворотки (лошадиной или крупного рогатого скота)

К 100 мл растопленного и охлажденного до 50 град. С мартеновского агара прибавляют 0,3 мл 1% раствора цистина и 20 мл нормальной лошадиной сыворотки или 30 мл сыворотки крупного рогатого скота.

Приготовление мартен-цистин-агаровой среды без сыворотки

К 100 мл растопленного и охлажденного до 50 град. С мартеновского, содержащего мальтозу, агара добавляют 0,3 мл 1% раствора цистина и разливают в чашки по 12 мл.

2. Сухие питательные агары Дагестанского НИИ

а) Сухой питательный агар, выпускаемый для определения токсигенности дифтерийных микробов.

Для приготовления среды сухой порошок растворяют в воде из расчета 3 г на 100 мл, тщательно размешивают и на слабом огне при постоянном помешивании нагревают до полного расплавления агара, кипятят в течение 5-7 минут с закрытой ватной пробкой, фильтруют через тканевый или ватно-марлевый фильтр. Разливают в стерильные флаконы (70-80 мл) или пробирки (10 мл) и стерилизуют однократно текучим паром 30 минут. Перед разливкой в чашки Петри к растопленной и охлажденной до 50 град. С среде добавляют 20% нормальной лошадиной сыворотки или 30% сыворотки крупного рогатого скота.

б) Сухой питательный агар с добавлением мясной воды и нормальных сывороток животных

Рекомендуемый состав питательной среды:

    Сухой питательный агар                  -  4 г
    Мясная вода                             - 100 мл
    Сыворотка нормальная лошадиная          - 20 мл

или сыворотка крупного рогатого

    скота                                   - 30 мл
    1% раствор цистина в 0,1N H2S04         - 0,3 мл

Приготовление мясной воды см. стр. 46.

Приготовление питательной основы

Растворяют 40 г сухого питательного агара в 1 л мясной воды, приготовленной в соотношении 1:2. Доводят крепкой уксусной кислотой pH среды до 7,0. Добавляют 10 г осветляющего активированного угля (марки А) и кипятят в течение 10 минут. Вместо активированного угля можно использовать угольные таблетки (карболен). Таблетки карболена растирают в ступке и используют как активированный уголь, добавляя к среде в том же количестве. Устанавливают pH = 7,9. После стерилизации pH несколько снижается и становится равным 7,8. Объем среды доводят до первоначального дистиллированной водой. Затем фильтруют через полотно Бельтинга. Фильтровальное полотно предварительно промывают кипящей водой. Чтобы предотвратить застывание агара, сосуд со средой во время фильтрования необходимо помещать в горячую воду. Рекомендуется проводить фильтрацию в термостате при температуре 55 град. С или в нагретом автоклаве.

Питательную основу в количестве 70-80 мл разливают во флаконы или по 10 мл в пробирки. Затем однократно стерилизуют текучим паром в течение 30 минут и сохраняют в рефрижераторе. Приготовленная таким образом питательная основа после стерилизации может храниться во флаконах в течение 1-2 месяцев.

Приготовление питательной среды

К 100 мл растопленной и охлажденной до 50 град. С питательной основы прибавляют 0,3 мл 1% раствора цистина (сухой цистин в количестве 0,1 г добавляют к 10 мл 0,1 № раствора H2S04 и нагревают в водяной бане до его растворения) и 20 мл нормальной лошадиной сыворотки или 30 мл сыворотки крупного рогатого скота.

V. СРЕДЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

1. Среда Пизу для определения фермента цистиназы

К 90 мл расплавленного 1,5% мартеновского агара при pH = 7,6 добавляют 2 мл 1% раствора цистина, приготовленного на 0,1 № растворе H2S04 (0,1 № HCl), тщательно перемешивая, добавляют такой же объем 0,1 № раствора NaOH.

Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы, можно использовать фиксаналы, выпускаемые предприятиями химической промышленности. Среду стерилизуют при температуре 112 град. С в течение 30 минут.

К расплавленной и охлажденной до 50 град. C среде (агар с цистином при расплавлении не следует длительно кипятить) добавляют 1 мл 10% раствора уксуснокислого свинца. (Раствор уксуснокислого свинца приготавливают ex tempore, двукратно стерилизуют текучим паром), перемешивают и добавляют 9 мл лошадиной или бычьей сыворотки. Среду стерильно разливают по пробиркам столбиком высотой 2-3 см. Посев производят уколом.

При посеве уколом культуры дифтерийных палочек образуют почернение среды по ходу укола и вокруг него и характерное «облачко» темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности.

Ложнодифтерийные бактерии и дифтероиды, как правило, не вызывают никаких изменений среды или дают слабое почернение по ходу укола, никогда не сопровождающееся «облачком».

Результаты учитывают через 20-24 часа с момента посева.

2. Определение фермента уреазы

Пробу на уреазу можно ставить в 2 вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе.

а) Определение уреазы на бульоне с мочевиной

К 100 мл стерильного мясо-пептонного или хоттингеровского бульона (pH = 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6% спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают над огнем по 2-3 мл в стерильные пробирки и стерилизуют текучим паром в течение 10 минут.

Результаты учитывают через 20-24 часа после посева. Покраснение среды говорит о наличии у данного штамма фермента уреазы.

б) Определение уреазы по методу Заксе

Готовится 2 реактива: А и В

РЕАКТИВ А

    Мочевина                            - 2 г
    96 град. этиловый спирт             - 2 мл
    Дистиллированная вода               - 4 мл

РЕАКТИВ В

    0,2% раствор фенолрот              - 1 мл
    Однозамещенный фосфат калия        - 0,1 г

(КН2Р04)
Двузамещенный фосфат калия         - 0,1 г
(К2НР04)

    Хлористый натриЙ (NaCl)            - 0,5 г
    Дистиллированная вода              - 100 мл

Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре от +4 град. С до +10 град. С. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.

Для работы оба реактива смешиваются ex tempore из расчета 1 часть раствора А и 19 частей раствора В, смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл. В пробирку обильно вносят испытуемые культуры в количестве нескольких петель. Пробирки помещают в термостат на 30 минут. При положительной реакции, т.е. при наличии уреазы у бактерий, смесь краснеет. При отрицательной реакции изменения цвета реактива не происходит.

Для постановки пробы на уреазу по методу Заксе надо использовать выросшую на поверхности свернутой сыворотки культуру, но ни в коем случае не брать конденсационную воду, т.к. она имеет щелочную реакцию и может вызвать изменение цвета индикатора.

3. Среды для изучения сахаролитических ферментов

Для определения сахаролитической способности рекомендуется использовать среды на 1% пептонной воде.

К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г химически чистой поваренной соли, после чего добавляют 1 мл индикатора Андреде. Устанавливают pH = 7,2 и затем добавляют один из перечисленных углеводов (сахароза, глюкоза) в количестве 0,5 г, крахмал (растворимый) 0,2-0,5%.

Среды разливают в пробирки по 2-3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 минут или при 0,5 атм. 15-20 минут. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветны или имеют слегка желтоватый цвет.

При сбраживании того или иного углевода, т.е. при кислотообразовании, наблюдается восстановление обесцвеченного фуксина и среда приобретает малиновый цвет.

Результаты учитываются через 20-24 часа, а при отрицательном крахмальном признаке — через 48 часов.

Приготовление индикатора Андреде

Посуда должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой.

На 100 мл дистиллированной воды добавляют:

0,5 г кислого фуксина

16,4 мл 4% раствора NaOH.

Раствор на сутки ставят в термостат, периодически встряхивают, 2-е суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место.

Если обесцвечивание раствора не произошло, то фуксин для работы не пригоден.

Инструкцию по бактериологическому исследованию на дифтерию, утвержденную Министерством здравоохранения СССР 2 сентября 1967 г., не считать утратившей силу.

---