Инструкция по определению витамина A и бета-каротина в пищевых продуктах

(утв. Минздравом СССР 10.07.1987 № 4400-87)

10 июля 1987 г. № 4400-87

ИНСТРУКЦИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА A И \beta -КАРОТИНА В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.

Колориметрический метод определения витамина A с треххлористой сурьмой широко используется для определения содержания витамина A в пищевых продуктах как в нашей стране, так и за рубежом. Для определения содержания \beta -каротина (провитамина A) применяют спектрофотометрический метод после отделения его от каротиноидов на окиси алюминия или других адсорбентах.

Методы прошли широкую апробацию в различных лабораториях, отраслевых институтах пищевой промышленности и кафедр гигиены и питания медицинских институтов, одобрены Минздравом СССР и рекомендованы для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц «Химический состав пищевых продуктов».

Принцип метода определения витамина A. Метод основан на реакции витамина A с треххлористой сурьмой в хлороформе с образованием синей окраски, интенсивность которой прямо пропорциональна содержанию витамина A. Предварительно проводят щелочной гидролиз жира, экстракцию витамина A органическим растворителем и отделение его от других соединений с помощью адсорбционной хроматографии.

Принцип метода определения \beta -каротина. Метод основан на измерении интенсивности светопоглощения растворов \beta -каротина. Как соединения с сопряженными двойными связями каротиноиды имеют характерные спектры поглощения в видимой области. \beta -каротины экстрагируют органическим растворителем, отделяют от других каротиноидов с помощью адсорбционной хроматографии и измеряют поглощение его растворов на спектрофотометре при 450 — 452 нм.

При анализе молока, мяса, рыбы и блюд из них, приготовляемых без добавления растительных продуктов, возможно определение витамина A и \beta -каротина из одного экстракта после их разделения на одной колонке с окисью алюминия. При анализе продукта, состоящего из животного и растительного сырья, определение витамина A и \beta -каротина возможно из одного экстракта, но после выделения этих соединений на разных колонках.

Оборудование. Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; роторный испаритель; водяная баня с закрытым электрическим обогревом; фотоэлектроколориметр; спектрофотометр; гомогенизатор; шкаф сушильный.

Посуда. Ступка с пестиком; воронки фильтровальные 3; 5 — 7,5 см; воронки делительные вместимостью 250 — 500 куб. см; колбы мерные вместимостью 50 и 100 куб. см; колбы конические вместимостью 100 и 250 куб. см; колбы круглодонные вместимостью 50, 100, 250, 500 куб. см со шлифом 14,5 и 29 мм; холодильник обратный, водяной со шлифом 14,5 мм; хроматографическая колонка — стеклянная трубка длиной 9 — 11 см, внутренний диаметр 10 мл, в нижний конец колонки впаяна трубка с внутренним диаметром 5 — 6 мм, постепенно суживающаяся до 1,5 — 2,0 мм, колонка заканчивается отводом для создания разрежения и шлифом 14,5; пробирки со шлифом 14,5, градуированные на 5, 10, 15 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; микропипетки градуированные на 0,1 и 0,2 куб. см; цилиндры мерные на 50, 100, 200 куб. см; стаканы на 50, 100, 250 куб. см.

Реактивы. Ретинола ацетат (Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 578); аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, 10 изд., ст. 6); алюминия окись по Брокману II, нейтральная; калия гидроокись; натрий сернокислый безводный; сурьма треххлористая; фенолфталеин; ацетон; гексан; спирт этиловый ректификованный; уксусный ангидрид; хлороформ; эфир этиловый; бумага фильтровальная. При работе с эфиром, ацетоном, гексаном, хлороформом соблюдать правила техники безопасности с органическими растворителями.

Приготовление реактивов.

1. Стандартные растворы ретинола ацетата с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см и 58 МЕ/куб. см. Растворяют 0,1000 г ретинола ацетата в мерной колбе на 100 куб. см в хлороформе и доводят хлороформом до метки (раствор с массовой концентрацией 2900 МЕ/куб. см). Для приготовления раствора 58 МЕ/куб. см 1 куб. см раствора с концентрацией 2900 МЕ/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят до метки хлороформом. Соединения ретинола ацетата очень неустойчивы к кислороду воздуха и свету, поэтому растворы готовят сразу при вскрытии ампулы и в день построения калибровочного графика.

2. <a id="p100014"></a>Раствор  треххлористой сурьмы (реагент Карр-Прайса). Отвешивают 20 г

SbCl в конической колбе вместимостью 250 куб. см, в которую предварительно 3 отмерено 100 куб. см хлороформа (в случае большой навески после взвешивания

добавляют  необходимое  количество  хлороформа) и растворяют при слабом (не
выше  40  °C)  нагревании на водяной бане, периодически встряхивая. Раствор
охлаждают,  добавляют  2  -  3  куб.  см  уксусного ангидрида, колбу плотно
закрывают  и  оставляют  на  ночь для отстаивания. Затем прозрачный раствор
осторожно  сливают  в  темную склянку с плотно закрывающейся крышкой. SbCl

                                                                      3

токсична и коррозионна, необходимо защищать от попадания кожу, глаза, дыхательные пути.

3. Раствор гидроокиси калия 50%. 50 г KOH растворяют в 50 куб. см дистиллированной воды.

4. Окись алюминия. Для приготовления окиси алюминия определенной степени активности отвешивают в бюксе 6 г адсорбента и ставят в сушильный шкаф (t = 160 — 180 °C) на 60 — 90 мин. Затем окись алюминия дезактивируют, быстро добавляя воду микропипеткой с массовой долей 1% (0,06 куб. см) или 3% (0,18 куб. см). Бюкс закрывают крышкой и встряхивают до тех пор, пока масса не станет однородной. Подготавливают адсорбент и заполняют им колонку перед нанесением на нее исследуемого раствора.

5. Растворы ацетона в гексане 4; 4; 10, 15% (объем/объем).

6. Раствор фенолфталеина (спиртовый) с массовой концентрацией 1%.

Ход определения.

1. Щелочной гидролиз. Интервал определяемых массовых концентраций витамина A составляет 1,5 — 10 МЕ (0,4 — 3,0 мкг)/куб. см хлороформного экстракта, используемого для реакции с треххлористой сурьмой. Массу навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Масса навески продукта должна находиться в диапазоне 1 — 20 г с массовой концентрацией витамина A 2 — 20 мкг.

Массу образца помещают в круглодонную колбу вместимостью 100 или 250 куб. см, соединенную шлифом с обратным водяным холодильником, добавляют 40 — 60 куб. см этилового спирта 0,1 — 0,2 г аскорбиновой кислоты и 50% раствор KOH. Доля добавляемого раствора KOH зависит от вида продукта и от массовой доли и состава в нем жира. При анализе продукта с низкой массовой долей жира (менее 6%) и витамина A (мясо, рыба и готовые блюда из них) на 10 г массы образца добавляют 2 — 4 куб. мм раствора KOH. При более высокой массовой доли жира в этих продуктах на 10 г образца добавляют 6 — 10 куб. см раствора KOH. Для продуктов с более высокой массовой долей витамина A (яйцо, творог и готовые блюда из них) и жира > 10% на массу образца 5 — 7 г берут 5 — 7 куб. см щелочи. При анализе молока и молочных продуктов с низкой массовой долей жира и витамина A массу навески увеличивают до 20 г, щелочь добавляют 5 — 7 куб. см. Для продуктов с высокой массовой долей жира 30% и выше (сыры, масло сливочное и др.) на массу образца 3 — 5 г берут 4 — 8 куб. см щелочи.

После добавления щелочи смесь нагревают на водяной бане с обратным водяным холодильником при температуре кипения смеси в течение 30 мин. Затем смесь охлаждают и переливают в делительную воронку. В воронку добавляют воду, чтобы окончательная концентрация этилового спирта была около 30 — 35%. Признаком полного омыления служит то, что после добавления воды смесь остается прозрачной. При образовании мути увеличивают массовую долю щелочи при омылении.

2. Экстрагирование. Неомыляемый остаток экстрагируют этиловым эфиром 4 раза, сначала объемом эфира, равным объему добавленной воды, а затем объемами на 20% меньшими. Ополаскивают эфиром колбу после омыления. Объединенный эфирный экстракт отмывают от щелочи водой по фенолфталеину (при добавлении фенолфталеина промывная вода не должна окрашиваться). Экстракт фильтруют через слой безводного сернокислого натрия в круглодонную колбу роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно, чтобы над сернокислым натрием не образовывался слой раствора, сернокислый натрий промывают эфиром. Затем эфир отгоняют под вакуумом, и неомыляемый остаток растворяют в 5 куб. см гексана.

3. <a id="p100024"></a>Хроматография.  В суконный конец хроматографической колонки помещают

капроновую ткань, промытую гексаном. Затем непрерывной струей насыпают в колонку окись алюминия с массовой долей воды 3% (см. «Приготовление»

реактивов"),   уплотняя  ее  легким  постукиванием  по  колонке  стеклянной
палочкой.  На  верх  адсорбента  добавляют  слой безводного сульфата натрия
(0,5 - 1,0 см).  Подготовленную  колонку  промывают  10 куб. см  гексана  и
наносят   5 куб.  см   испытуемого  экстракта.   Затем   снова   пропускают
10 куб. см  гексана  (фракция 1).  При  анализе  продуктов,  не  содержащих
растительные продукты  (молочные,  мясные и  т.д.) после гексана пропускают
через  колонку  раствор  ацетона в гексане с массовой  долей 4%, до тех пор
пока  элюат не станет бесцветным  (фракция 2).  В этом случае фракцию 1 и 2
объединяют,  выпаривают  под  вакуумом  на  роторном  испарителе,   остаток

растворяют в гексане (5 — 10 куб. см) и в растворе определяют \beta -каротин (V ). 1

    При  анализе  образца,  содержащего  продукты животного и растительного
происхождения, после  гексана  через  колонку  пропускают раствор ацетона в
гексане  с  массовой  концентрацией  10%  (30  куб. см). Витамин A элюируют
последующим  пропусканием  через  колонку  30  куб.  см  раствора ацетона в
гексане  с массовой концентрацией 15% (фракция 3). Пропускают раствор через
колонку  при  небольшом  разрешении  (2,5  - 3,0 куб. см/ мин.). Фракцию 3,
содержащую  витамин  A,  выпаривают  в  роторном  испарителе под вакуумом и

растворяют остаток в хлороформе (2 — 6 куб. см) (V ). 2

4. Определение витамина A.

1. Проведение определения. Вносят 0,4 куб. см хлороформного раствора витамина A в кювету, помещают ее в кюветодержатель фотоэлектроколориметра, добавляют 4 куб. см раствора треххлористой сурьмы и быстро измеряют оптическую плотность, так как окраска неустойчива и начинает исчезать через 5 — 6 сек. Измерение проводят при длине волны 620 нм. После измерения наблюдают за окраской раствора: синяя окраска должна исчезнуть и после этого раствор не должен быть окрашенным или мутным. Помутнение возможно в случае попадания воды с испытуемым раствором или с раствором сурьмы. Наличие окраски раствора через 15 с после проведения реакции свидетельствует о недостаточно полном отделении витамина A от мешающих соединений. В том и другом случае анализ необходимо повторить, учтя вышеуказанные замечания.

2. Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора ретинола ацетата с массовой концентрацией 58 МЕ/ куб. см готовят разведения с массовой концентрацией 1,2 МЕ/ куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 50 куб. см и доводят объем до метки хлороформом); 2,9 МЕ/ куб. см (0,5 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см); 5,8 МЕ/ куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 10 куб. см и доводят объем хлороформом до 10 куб. см); 11,6 МЕ/куб. см (1 куб. см стандартного раствора помещают в градуированную пробирку на 5 куб. см и доводят объем хлороформом до 5 куб. см). Приготовленные растворы хорошо перемешивают. Из каждого разведения отбирают по 0,4 куб. см раствора и проводят колориметрическую реакцию так же, как при анализе испытуемых растворов. Для построения калибровочного графика по оси ординат откладывают полученные значения оптической плотности, а по оси абсцисс — соответствующие им количества витамина A в 1 куб. см раствора в МЕ.

   3. Расчет. Массовую долю витамина A в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

                            K x V  x 100
                                 2
      

X = ------------, (1) 3300 x a

где:

K — массовая концентрация витамина A в 1 куб. см испытуемого раствора, определяемая по стандартной кривой, МЕ;

V — общий объем раствора в хлороформе, куб. см; 2

100 — пересчет на 100 г продукта;

3300 — пересчет на МЕ в мг;

a — масса образца, г.

Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического значения.

5. Определение \beta -каротина.

1. Экстрагирование каротина из растительного материала (свежие и сухие овощи, плоды, ягоды).

Интервал определяемых концентраций \beta -каротина составляет 0,1 — 1 мкг/ куб. см раствора, оптическую плотность которого измеряют на спектрофотометре. Массу навески продукта (1 — 15 г с массовым содержанием \beta -каротина 0,01 — 0,05 мг) и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.

    Массу  исследуемого образца, взятую из средней пробы переносят в ступку
или  стакан  смесителя,  добавляют  0,1  -  0,2  г  аскорбиновой  кислоты и

растирают с небольшим количеством измельченного стекла или гомогенизируют в смеси ацетон-гексан (1:1). Затем смеси дают отстояться и сливают прозрачный

экстракт  в  делительную  воронку.  Экстракцию  повторяют  до тех пор, пока
раствор  не  станет бесцветным. Отмывают объединенный экстракт от ацетона 3

раза порциями воды, равными объему ацетона, использованного при экстракции. Экстракт фильтруют через слой сернокислого безводного натрия в круглодонную

колбу  от  роторного испарителя вместимостью 250 или 500 куб. см медленно и
промывают  слой  сернокислого  натрия на фильтре 2 раза небольшими порциями
гексана.  Выпаривают гексан на роторном испарителе до объема 4 - 5 куб. см,
если  раствор  интенсивно  окрашен,  его  не  выпаривают  и  измеряют объем

раствора (V ). 3

2. Хроматография \beta -каротина при анализе растительного сырья. В

хроматографическую  колонку  непрерывной  струей  насыпают окись алюминия с
массовой  долей  воды  1%,  уплотняя  ее  легким  постукиванием  по колонке
стеклянной   палочкой.   На   верх  адсорбента  добавляют  слой  безводного
сернокислого  натрия  высотой  0,5  -  1,0 см. Колонку промывают 10 куб. см

гексана и наносят 5 куб. см раствора \beta -каротина в гексане, полученного (раздел 2) при анализе продуктов из животного и растительного сырья или раздел 5.1 (в дальнейшем необходимо следить, чтобы верхний слой колонки был

всегда  покрыт  раствором).  Каротиноиды на высоте  колонки  (сверху  вниз)
располагаются  в  следующем  порядке:  хлорофилл,  ксантофиллы,  ликопин  и

каротины (бета и альфа). \alpha — и \beta -каротины из всех каротиноидов

обладают  на  окиси  алюминия  наименьшей  адсорбционной  способностью и их
элюируют, пропуская  10 куб. см гексана или пропуская после гексана раствор

ацетата в гексане с массовой концентрацией 1% до тех пор, пока вытекающий с колонки раствор не станет бесцветным. После элюции каротина с колонки измеряют объем элюата (V ). 1

3. Спектрофотометрическое определение \beta -каротина и расчет на спектрофотометре определяют оптическую плотность растворов \beta -каротина в гексане, полученных в разделах 3 и 5.2, при длине волны 450 — 45 нм и 1% рассчитывают содержание, используя коэффициент удельного поглощения E . 1 см

Массовую долю \beta -каротина в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

                          10 x Д x V  x 100
                                    1

X = -----------------, (2) 1% E x a 1 см

где:

10 — содержание каротина в 1 куб. см 1% раствора, мг;

Д — оптическая плотность испытуемого раствора, куб. см;

V — объем элюата, куб. см; 1

100 — пересчет на 100 г продукта; 1%

E = 2580; 1 см

a — навеска, г.

При анализе растительного материала массовую долю \beta -каротина в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:

                          10 x Д x V  x V  x 100
                                    1    3
                      X = ----------------------,                       (3)

                           1%
                          E     x 5 x a
                           1 см

где:

V — общий объем испытуемого раствора, куб. см; 3

5 — объем раствора, нанесенный на колонку, куб. см;

остальные обозначения, что и к формуле (2).

Полноту отделения \beta -каротина от ликопина проверяют путем снятия спектра при длинах волн 420 — 430 нм с интервалами 5 нм. Если полученные максимумы соответствуют максимуму поглощения для \beta -каротина в гексане (450 — 451, 475 нм), то, следовательно, \beta -каротин отделен от ликопина.

Вычисление проводят до третьего десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 15% от среднего арифметического.

---