--- title: "\"Инструкция по определению рибофлавина (витамина B2) в пищевых продуктах\"" number: "4398-87" issuer: "Министерство здравоохранения СССР" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/instruktsiya-4398-87" --- ## "Инструкция по определению рибофлавина (витамина B2) в пищевых продуктах" # "Инструкция по определению рибофлавина (витамина B2) в пищевых продуктах" (утв. Минздравом СССР 10.07.1987 N 4398-87) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32).
Утверждаю
Заместитель начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Минздрава СССР
**А.И.ЗАИЧЕНКО**
10 июля 1987 г. N 4398-87
**ИНСТРУКЦИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ РИБОФЛАВИНА (ВИТАМИНА B2)** *В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ* *Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.* *Для определения общего содержания рибофлавина в пищевых продуктах используют флюориметрический метод, разработанный в двух вариантах (прямой флюорометрии и люмифлавиновый), прошедший широкую апробацию в лабораториях научно-исследовательских и практических учреждений при разработке справочных "Таблиц химического состава пищевых продуктов". Метод одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению таблиц.* ## Принцип метода *Метод основан на свойстве свободного рибофлавина и продукта его фотолиза - люмифлавина - флюоресцировать при облучении их растворов светом с длиной волны 440 - 450 нм. В варианте прямой флюорометрии интенсивность флюоресценции измеряется до и после восстановления рибофлавина гидросернистокислым натрием. В люмифлавиновом варианте используется свойство рибофлавина при облучении в щелочной среде переходить в люмифлавин, интенсивность флюоресценции которого измеряют после извлечения его хлороформом.* ## Оборудование *Флюориметр ЭФ-3М или ФМ-Ц-2; потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; водяная баня.* *Для люмифлавинового варианта дополнительно нужны две настольные лампы по 100 ватт (желательно с отражателями, направляющими свет на облучаемые колбы), настольный вентилятор.* ## Посуда *Колбы мерные вместимостью 100, 500, 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 250 куб. см; колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 куб. см; бюретка на 100 куб. см; цилиндры мерные вместимостью 25 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; воронки делительные вместимостью 250 куб. см, воронки фильтровальные диаметром 3,5 см и 8 см.* ## Реактивы *1. Калий марганцевокислый, х.ч.* *2. Натрий гидроокись, х.ч.* *3. Натрий гидросернистокислый техн.* *4. Натрий уксуснокислый 3-водн., х.ч.* *5. Натрия сульфат безводный х.ч.* *6. Перекись водорода 30%, х.ч.* *7. Рибофлавин кристаллический (Гос. фармакопея СССР, X изд., ст. 585).* *8. Кислота соляная, х.ч.* *9. Кислота уксусная ледяная, х.ч.* *10. Хлороформ для наркоза.* *11. Ферментные препараты амилоризин П10х и пектаваморин П10х.* ## Приготовление реактивов *1. Стандартные растворы рибофлавина. Растворяют 0,0200 г рибофлавина, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой или пятиокисью фосфора в течение 10 дней, в мерной колбе вместимостью 1000 куб. см в 750 куб. см дистиллированной воды. Для лучшего растворения добавляют 1 куб. см ледяной уксусной кислоты и слегка подогревают. После полного растворения рибофлавина раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят объем водой до метки и тщательно перемешивают (раствор с массовой концентрацией рибофлавина 0,020 г/куб. см). Переносят в склянку темного стекла с притертой пробкой, добавляют 0,5 куб. см толуола и сохраняют в темноте и на холоде не более 2-х месяцев. В день проведения анализа 5 куб. см этого раствора, нагретого в темноте до комнатной температуры, помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем до метки водой, перемешивают (рабочий раствор с массовой концентрацией рибофлавина 1 мкг/куб. см).* 2. Раствор соляной кислоты 0,1 н. 3. Насыщенный раствор натрия уксуснокислого. 4. Раствор калия марганцевокислого 3%. 5. Раствор перекиси водорода 3%, готовят свежий еженедельно.
6. Раствор гидроокиси натрия 7 н.
## Ход определения Интервал определяемых концентраций рибофлавина составляет при прямой флюорометрии 0,5 - 2 мкг/куб. см; при использовании люмифлавинового варианта - 0,03 - 0,20 мкг/куб. см. Величину навески продукта и последующие разведения рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций. Навеску мелкоизмельченной средней пробы продукта помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, приливают около 150 куб. см 0,1 н раствора соляной кислоты и кипятят на водяной бане 40 минут. Затем охлаждают до комнатной температуры, доводят рН гидролизата до 4,5 (потенциометрически) с помощью насыщенного раствора уксуснокислого натрия, добавляют 100 мг амилоризина, 0,5 куб. см толуола и помещают в термостат на 14 - 16 часов при 37 °С. На следующий день гидролизат охлаждают, доводят объем в мерном цилиндре до 250 куб. см дистиллированной водой и фильтруют. Если исследуемый объект содержит много жира, то навеску перед гидролизом обрабатывают серным эфиром; возможно также обработать эфиром уже готовый гидролизат. При анализе объектов, содержащих много пектиновых веществ (яблоки, крыжовник, смородина, тыква, кабачки и продукты их переработки), вместо амилоризина используют пектаваморин. При необходимости прервать анализ на 1 - 2 дня перед доведением объема до 250 куб. см гидролизат кипятят 5 минут, охлаждают, доводят объем до 250 куб. см и фильтруют. До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в хорошо закрытой склянке. Одновременно аналогичным образом ставят контрольную пробу на содержание рибофлавина в ферментных препаратах, используя те же количества ферментных препаратов и реактивов. При анализе многих видов продуктов стадия гидролиза совпадает с аналогичной стадией анализа на содержание тиамина, что позволяет проводить определение рибофлавина и тиамина в одной навеске. ## Вариант прямой флюорометрии Метод прямой флюорометрии неприменим при анализе объектов с очень низким содержанием рибофлавина (некоторые овощи, плоды, ягоды), готовых блюд и кулинарных изделий, а также при исследовании зерновых продуктов (круп, муки, зерна, хлеба и т.д.). В этих случаях предпочтительным является люмифлавиновый вариант. В 4 флюорометрические пробирки наливают по 10 куб. см фильтрата испытуемого образца. В 2 пробирки с фильтратом добавляют по 1 куб. см дистиллированной воды, в 2 другие - по 1 куб. см (очень точно!) стандартного раствора, содержащего 1 мкг рибофлавина в 1 куб. см. В 5-ю пробирку наливают 10 куб. см фильтрата контрольной пробы к 1 куб. см воды. Во все пробирки добавляют по 1 куб. см ледяной уксусной кислоты и перемешивают содержимое. Затем вносят по 0,5 куб. см 3% раствора KMnO ; 4 смешивают и оставляют на 2 мин. Добавляют в каждую пробирку по 0,5 куб. см энергично 3% раствора H O и встряхивают для удаления избытка кислорода. 2 2 Измеряют флюоресценцию всех растворов на флюориметре со светофильтрами, имеющими максимум пропускания в области 350 - 480 нм (В - первичный) и 510 2 - 550 нм (В - вторичный). После этого добавляют в каждую пробирку 2 небольшими порциями (по 15 - 25 мг) порошкообразный гидросернистокислый натрий, перемешивают и в течение 5 - 10 сек. вновь измеряют флюоресценцию растворов. Повторяют эту операцию быстро еще раз, не допуская помутнения растворов за счет выделения свободной серы. Для расчетов используют средние показания двух параллельных пробирок до и после добавления гидросернистокислого натрия. В последнем случае берут наименьшие значения флюоресценции, полученные при повторном восстановлении рибофлавина гидросернистокислым натрием. Содержание рибофлавина в исследуемом образце в мг на 100 г (Х) вычисляют по следующей формуле: [(А - А ) - (С - С )] х V х n 1 1 Х = -----------------------------------, [(В - В ) - (А - А )] х V х а х 10 1 1 1 где: А - интенсивность флюоресценции исследуемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина; А - то же после восстановления рибофлавина гидросернистокислым 1 натрием; В - интенсивность флюоресценции исследуемого образца с добавлением стандартно раствора рибофлавина; В - то же после восстановления рибофлавина гидросернистокислым 1 натрием; С - интенсивность флюоресценции контрольного опыта; С - то же после добавления гидросернистокислого натрия; 1 V - объем гидролизата (куб. см); V - количество гидролизата, взятое для окисления перманганатом калия 1 (куб. см); n - количество добавленного рибофлавина (мкг); а - навеска образца (г); 10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта. ## Люмифлавиновый вариант К 100 мл фильтрата добавляют 2 куб. см 30% раствора серной кислоты из пипетки 3% раствора KMnO по каплям, постоянно перемешивая, до получения 4 малинового окрашивания. Через одну минуту избыток перманганата калия удаляют добавлением по каплям 3% раствора перекиси водорода. Количество куб. см израсходованных перманганата калия и перекиси водорода приплюсовывают к первоначально взятому на окисление объему фильтрата, чтобы определить конечный объем раствора. Например: на окисление 100 куб. см фильтрата израсходовано 1,8 куб. см KMnO и 0,2 куб. см H O . Конечный объем будет 100 куб. см + 2 куб. см 30% 4 2 2 серной кислоты + 1,8 куб. см + 0,2 куб. см = 104 куб. см. Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30 - 50 куб. см хлороформа и встряхивают 1 мин. После разделения слоев хлороформный слой отбрасывают, а водную фазу используют для дальнейшего определения. Одновременно аналогичным образом обрабатывают контрольную пробу, содержащую те же количества ферментных препаратов и реактивов, но без исследуемого образца. В 4 конические колбы с притертыми пробками наливают по 20 куб. см экстракта исследуемого образца. В 2 из них добавляют по 2 куб. см рабочего стандартного раствора рибофлавина, с массовой концентрацией 1 мкг в 1 куб. см. В 5-ю коническую колбу наливают 20 куб. см контрольной пробы. Во все колбы добавляют по 4 куб. см 7 н раствора едкого натра, закрывают пробками, перемешивают и облучают их 40 мин. светом двух настольных ламп по 100 ватт с расстояния 30 см. Температура окружающего воздуха не должна превышать 25 °С, для охлаждения используют настольный вентилятор. Немедленно после окончания облучения все растворы подкисляют 4 куб. см ледяной уксусной кислоты, добавляют по 20 куб. см хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают колбы в течение 2-х минут, избегая образования эмульсии. Оставляют все колбы на 10 - 15 минут для расслоения водной и хлороформной фаз. С помощью пипетки с резиновой грушей или небольшой делительной воронки отбирают по 10 - 12 куб. см хлороформного раствора, который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические пробирки. Измеряют флюоресценцию полученных таким образом хлороформных растворов на флюориметре, используя те же светофильтры, которые указаны в варианте прямой флюорометрии. Содержание рибофлавина (мг на 100 г продукта) вычисляют по формуле: (А - А ) х К х V х V 1 1 Х = ---------------------------, (А - А) х а х V х V х 10 2 2 3 где: А - среднее из показаний флюориметра для испытуемого образца без добавления стандартного раствора рибофлавина; А - то же для контрольного опыта на реактивы; 1 А - среднее из показаний флюориметра для исследуемого образца с 2 добавлением стандартного раствора рибофлавина; К - количество добавленного рибофлавина (мкг); V - общий объем гидролизата (куб. см); V - объем гидролизата после окисления (куб. см); 1 V - объем гидролизата, взятый на окисление (куб. см); 2 V - объем гидролизата, взятый на облучение (куб. см); 3 а - навеска продукта (г); 10 - коэффициент пересчета из мкг/г в мг/100 г продукта. Вычисления проводят до второго знака после запятой. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 10% от среднего арифметического значения. ---