Инструкция по определению витамина C в пищевых продуктах
(утв. Минздравом СССР 10.07.1987 № 4387-87)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32).
Утверждаю
Заместитель начальника Главного
санитарно-эпидемиологического
управления Минздрава СССР
А. И. Заиченко
10 июля 1987 г. № 4387-87
ИНСТРУКЦИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ВИТАМИНА C В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Разработана в Институте питания АМН СССР лабораторией витаминизации пищевых продуктов.
Метод визуального титрования витамина С является наиболее простым, доступным и широко используется как в нашей стране, так и за рубежом для определения этого витамина в пищевых продуктах, не содержащих естественных пигментов, мешающих визуальному установлению конца титрования.
Метод прошел широкую апробацию в различных лабораториях научных и практических учреждений (лаборатории пищевых отделов СЭС, кафедр гигиены питания медицинских институтов, лабораторий различных отраслей пищевой промышленности), одобрен Минздравом СССР и рекомендован для практического использования Междуведомственной комиссией по составлению «Таблиц химического состава пищевых продуктов».
Принцип метода
Метод основан на способности аскорбиновой кислоты (АК) окисляясь количественно восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия. АК экстрагируют раствором метафосфорной кислоты и титруют 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия до установления светло-розовой окраски. Дегидроаскорбиновую кислоту в АК восстанавливают цистеином, для отделения АК от редуцирующих соединений, присутствующих в пищевых продуктах, подвергающихся тепловой обработке и длительно хранившихся, экстракты обрабатывают формальдегидом при определении pH.
Оборудование
Потенциометр; термостат водяной на 37 °С; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г, поверочной ценой деления не более 0,5 мг; весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 500 г, поверочной ценой деления не более 50 мг; гомогенизатор.
Посуда
Ступка с пестиком; воронки фильтровальные диаметром 5 — 7,5 см; колбы мерные вместимостью 100, 500 и 1000 куб. см; колбы конические вместимостью 50 и 100 куб. см; микробюретки на 2 куб. см с ценой деления 0,01 куб. см; пипетки градуированные на 1, 2, 5 и 10 куб. см; цилиндры мерные на 100 и 200 куб. см; стаканы на 50 и 100 куб. см.
Реактивы
1. Аскорбиновая кислота (Госфармакопея СССР, X изд., ст. 6).
2. 2,6-дихлорфенолиндофенолят натрия.
3. Калий фосфорнокислый двузамещенный.
10. Этилендиаминтетрауксусная кислота.
Приготовление реактивов
1. <a id="p100025"></a>Раствор метафосфорной кислоты 6% и 3%. Растирают в ступке 60 г HPO
3
и растворяют в 940 куб. см дистиллированной воды без нагревания. При
стоянии раствор HPO медленно гидролизуется до H PO , поэтому свежий
3 3 4
раствор готовят еженедельно. 3% раствор HPO готовят в день проведения
анализа из 6% раствора. 3
2. Стандартные растворы аскорбиновой кислоты (АК) с массовой концентрацией 1 мг/куб. см и 0,1 мг/куб. см. Растворяют 0,1000 г АК в мерной колбе на 100 куб. см в 3% растворе метафосфорной кислоты и доводят тем же раствором кислоты до метки (раствор с массовой концентрацией 1 мг/куб. см). Для приготовления раствора 0,1 мг/куб. см 10 куб. см раствора АК с концентрацией 1 мг/куб. см вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 3% раствором метафосфорной кислоты. Растворы неустойчивы, их приготовляют непосредственно перед применением.
3. Раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия 0,04%. Растворяют 0,2 г 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия в 300 куб. см горячей свежекипяченой (в течение 30 мин.) дистиллированной воды, фильтруют через складчатый фильтр в мерную колбу вместимостью 500 куб. см и промывают фильтр горячей водой. После охлаждения раствор доводят до метки охлажденной свежекипяченой дистиллированной водой. Срок годности раствора при хранении в холодильнике — не более 2 дней.
Установка титра раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия: в две конические колбы наливают по 9 куб. см 3% раствора метафосфорной кислоты и по 1 куб. см раствора АК с массовой долей 0,1 мг/куб. см и быстро титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до светло-розовой окраски, не исчезающей в течение 10 — 15 с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3% раствора метафосфорной кислоты (контроль на реактивы). Поправку к титру раствора вычисляют по формуле:
где:
0,10 — количество АК в 1,0 куб. см стандартного раствора, мг;
V — объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченный на титрование стандартного раствора АК, куб. см;
V — объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, затраченный на титрование 3% 1 раствора метафосфорной кислоты, куб. см.
4. Раствор L-цистеина HCl с массовой концентрацией 50 мг/куб. см. Раствор приготовляют в день применения.
5. Ацетатный буфер (рН — 4,0). Растворяют 49,8 г уксуснокислого натрия в 70 куб. см дистиллированной воды и, добавляя ледяную уксусную кислоту (около 100 куб. см), потенциометрически доводят рН до 4,0.
6. Раствор серной кислоты: к 50 куб. см дистиллированной воды осторожно добавляют 50 куб. см концентрированной серной кислоты.
7. Раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с массовой концентрацией 15%.
8. Раствор двузамещенного фосфорнокислого калия с массовой концентрацией 45%.
Ход определения
Интервал определяемых концентраций АК составляет 0,05 — 0,12 мг в объеме экстракта (от 1,0 до 10 куб. см), взятого на титрование. Величину навески продукта и последующее разведение рассчитывают исходя из интервала указанных концентраций.
Навеску исследуемого материала, взятую из средней пробы (1 - 50 г в зависимости от предполагаемого количества витамина С), помещают в фарфоровый стакан, в который налито 30 - 50 куб. см 6% HPO , и
3
гомогенизируют полученный гомогенат, включая мякоть, количественно переносят в мерную колбу или цилиндр вместимостью 100 - 200 куб. см, доводят до метки 3% HPO , перемешивают и фильтруют через фильтровальную
3
бумагу. При анализе сухих продуктов гомогенат после измельчения настаивают в течение 10 - 15 мин. При определении витамина С в жидких объектах необходимое количество материала отсеивают или отмеряют в мерную колбу
вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 3% HPO . 3
Экстрагирование проводят быстро, полученные экстракты сразу используют для анализа.
При экстрагировании АК из продуктов, расфасованных в металлическую тару, или из продуктов с высоким содержанием железа, навеску образца (1 - 25 г) гомогенизируют в 6% раствора HPO , переносят в цилиндр вместимостью
3
100 куб. см, этим же раствором кислоты и доводят объем до 50 куб. см, перемешивают. Через 10 мин. прибавляют 30 куб. см ацетатного буферного раствора и 10 куб. см раствора ЭДТА, доводят до метки 3% раствором HPO ,
3
перемешивают и фильтруют.
Определение АК
В две конические колбы вносят пипеткой от 1 до 10 куб. см экстракта, доводят объем 3% раствором HPO до 10 куб. см и титруют раствором 2,6-
3
дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение 10 - 15 с. Таким же образом титруют 10 куб. см 3% раствора HPO
3
(контроль на реактивы — V ). 0
При содержании в продукте редуцирующих соединений контрольное испытание
проводят следующим образом: в коническую колбу помещают такой же объем экстракта, как при определении АК, прибавляют равный ему объем ацетатного буфера и раствор формальдегида в объеме, равном половине объема буферного раствора, перемешивают, закрывают колбу пробкой, оставляют на 10 мин. и
титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (V ). 0
Массовую долю АК в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:
Т х (V - V ) х V х 100
0 1
Х = -----------------------, (1)
V х а
2
где:
Т — титр раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола;
V — объем 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на титрование испытуемого раствора (среднее из двух параллельных определений), куб. см;
V — объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, израсходованного на 0 титрование при контрольном испытании, куб. см;
V — общий объем экстракта, полученный при экстрагировании пробы, куб. 1 см;
V — объем экстракта, взятый на титрование, куб. см; 2
100 — пересчет на 100 г продукта.
Вычисление проводят до первого десятичного знака. За конечный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 5% от среднего арифметического значения.
Определение общего содержания витамина С (аскорбиновая кислота + дегидроаскорбиновая кислота) (АК + ДАК)
В коническую колбу наливают 2 - 20 куб. см экстракта (для проведения двух параллельных определений) (V ), доводят pH до 7,2 - 7,4
3
(потенциометрически) 45% раствором двузамещенного фосфорнокислого калия, добавляют раствор цистеина в таком количестве, чтобы его массовая концентрация приблизительно в 300 раз превышала предполагаемое содержание ДАК, и ставят колбу в термостат при температуре 37 °С на 30 мин. Массовую долю цистеина в мг, добавляемую к экстракту, рассчитывают
по формуле:
К х а х V х 300 К х а х V х 3
3 3
Х = ---------------- = --------------, (2)
100 х V V
1 1
где:
К — массовая концентрация АК в продукте, определенная по формуле (1), мг на 100 г продукта;
V — объем экстракта, взятый на восстановление ДАК в АК, куб. см; 3 остальные обозначения те же, что в формуле (1).
После термостатирования раствор быстро охлаждают до комнатной температуры, доводят потенциометрически рН раствора до 0 - 0,5 раствором серной кислоты и измеряют объем (V ). К части раствора (с примерной
4
массовой концентрацией АК 0,1 мг) (V ) прибавляют формальдегид до 2
получения массовой доли 3%, закрывают колбу пробкой и через 8 мин. титруют раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до слабо-розового окрашивания,
не исчезающего в течение 10 — 15 с.
Массовую долю витамина С в мг на 100 г продукта вычисляют по формуле:
Т х V х V х V х 100
1 4
Х = ---------------------, (3)
V х V х а
2 3
где:
V — объем раствора после доведения рН до 0 — 0,5, куб. см; 4
остальные обозначения те же, что в формулах (1) и (2).
Вычисление проводят до первого десятичного знака. За результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений. Расхождение между двумя параллельными определениями не должно превышать 8% от среднего арифметического значения.