Инструкция по унификации гистологических и гистохимических методов исследования биопсийного и секционного материала
(утв. Минздравом СССР 02.03.1976 № 10-8/7)
Утверждаю
Начальник Главного управления
лечебно-профилактической помощи
Министерства здравоохранения СССР
С. А. Сягаев
2 марта 1976 г. № 10-8/7
ИНСТРУКЦИЯ ПО УНИФИКАЦИИ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ И ГИСТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПСИЙНОГО И СЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА
Инструкция составлена проф. Г.Г. Автандиловым, докт. мед. наук И.А. Казанцевой, канд. биол. наук И.С. Кругловой при участии сотрудников патологоанатомических лабораторий Института морфологии человека АМН СССР и патоморфологических лабораторий научно-исследовательских институтов АМН СССР и МЗ СССР, кафедр патологической анатомии ЦОЛИУВ, 1-го МОЛМИ, 2-го МОЛМИ, Ленинградского ГИДУВа.
В связи с достижениями медицинской науки и практического здравоохранения значительно повысились требования к качеству и надежности результатов патологоанатомических исследований.
Увеличение количества диагностических биопсий и все более широкое распространение морфологического контроля за ходом лечебных мероприятий, связанное с внедрением в клиническую практику таких методов получения биопсийного материала, как эксфолиативные, пункционные и аспирационные биопсии, ставят перед патологоанатомической службой ряд новых задач, требующих расширения набора методов гистологического и гистохимического исследования, которые позволят патологоанатому обеспечить максимально точную диагностику заболеваний.
Таким образом, патологоанатом, по существу, стал клиническим патологом, непосредственно участвующим в диагностике заболевания и контроле за лечением больных.
Существенно изменился и характер исследуемого патологоанатомом секционного материала. Реанимационные мероприятия, искусственное кровообращение, гемодиализ, новые методы медикаментозного и лучевого лечения во многом изменили морфологию заболеваний. В связи с этим особое внимание должно быть обращено на повышение качества патологоанатомического исследования секционного материала для дальнейшего усовершенствования диагностической работы, сличения клинических и патологоанатомических диагнозов, статистической разработки структуры смертности населения, изучения патоморфоза заболеваний и их осложнений, а также причин и механизмов смерти. Между тем, отсутствие единых установок, определяющих набор рекомендуемых методик и объем исследуемого материала, создает затруднения для выполнения перечисленных задач, усложняет отчетность и упорядочение снабжения патологоанатомических отделений красителями и реактивами.
Из сказанного следует, что современная организация патологоанатомической службы должна обеспечить максимально возможную унификацию гистологических и гистохимических методик, выполняемых в различных лечебно-профилактических учреждениях страны, что обеспечит полную преемственность, исключит дублирование результатов исследования, а также улучшит консультативную помощь.
В целях унификации гистологических и гистохимических исследований, проводимых в патологоанатомических отделениях лечебно-профилактических учреждений страны, при наличии соответствующих условий, в дополнение к «Инструкции по исследованию биопсийного и цитологического материала» (1973), предлагается руководствоваться настоящей инструкцией с Приложениями I, II, III.
Приложение I. Перечень рекомендуемых унифицированных методик гистологического и гистохимического исследования биопсийного и секционного материала.
Приложение II. Описание рекомендуемых гистологических и гистохимических методик.
Приложение III. Рекомендуемый объем гистологического и гистохимического исследования биопсийного и секционного материала.
ПЕРЕЧЕНЬ
РЕКОМЕНДУЕМЫХ УНИФИЦИРОВАННЫХ МЕТОДИК ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО
И ГИСТОХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПСИЙНОГО
И СЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА
1. Окраска гематоксилин-эозином.
2. Окраска пикрофуксином (по Ван-Гизону).
3. Комбинированная окраска пикрофуксином и фукселином.
4. Окраска азановым методом по Гейденгайну.
5. Импрегнация соединительнотканной стромы: а) по Гомори или б) по Футу.
6. Комбинированное выявление нейтральных и кислых мукополисахаридов реактивом Шиффа и альциановым синим.
7. Окраска амилоида красным конго и метил-виолетом.
8. Выявление соединений железа (по Перлсу).
9. Окраска фибрина (по Вейгерту).
10. Выявление извести (по Косса).
11. Комбинированная окраска на кератин и слизь (по Крейбергу).
12. Окраска нервной ткани крезил-виолетом и тионином (по Нисслю).
13. Реакция на ДНК (по Фельгену).
14. Реакция на РНК (по Унна-Браше).
15. Окраска жиров суданом III — IV или суданом черным.
16. Выявление лейкоцитов в тканях (окраска альфа-нафтол-суданом по Гольдману).
17. Окраска бактерий, патогенных грибов и простейших:
а) окраска микобактерий туберкулеза и палочек лепры карболовым фуксином Циля;
б) окраска бактериальной флоры и патогенных грибов по Грам-Вейгерту;
в) окраска метиленовым синим Лефлера;
г) импрегнация Грам-отрицательных бактерий и спирохет по Левадити.
18. Методы окраски нервной ткани:
а) импрегнация ретикулиновой ткани мозга (по Снесареву);
б) выявление осевых цилиндров (по Бильшовскому);
в) выявление астроцитов (по Рамон-Кахалю);
г) выявление микроглии (по Мийягава в модификации Александровской);
д) выявление миелиновых оболочек (по Шпильмейеру).
19. Иммуногистохимические методы.
20. Методы выявления ферментов:
д) эстеразы, методом с использованием \alpha - \text{нафтилацетата} ;
е) \beta - \text{глюкуронидазы} методом последующего азосочетания;
з) аминопептидазы методом азосочетания;
к) глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы;
л) 6-фосфоглюконатдегидрогеназы;
И ГИСТОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДИК
В настоящем приложении приведено описание наиболее распространенных методов гистологического и гистохимического исследования, рекомендуемых для повседневной практической работы патологоанатомических отделений. Наряду с указанными методами в необходимых случаях целесообразно расширить их набор, руководствуясь соответствующими пособиями по гистологической и гистохимической технике.
I. Окраска гематоксилин-эозином
Из наиболее распространенных гематоксилиновых красителей рекомендуются следующие растворы:
а) гематоксилин Эрлиха — один из лучших красящих растворов, имеет следующий состав:
10% спиртовой раствор гематоксилина — 20 мл (на 96° спирте)
Спирт 96° - 80 мл Глицерин - 100 мл Вода дистиллированная - 100 мл Ледяная уксусная кислота - 10 мл Квасцы алюмокалиевые - 3 г
Раствор хранят на свету в широкогорлой банке, завязанной марлей до созревания (1 — 2 м-ца). Созревший раствор фильтруют и хранят в плотно закрытой посуде;
б) гематоксилин Карачи состоит из:
Воды дистиллированной - 400 мл Квасцов алюмокалиевых - 25 г Гематоксилина кристаллического - 0,5 г Глицерина - 100 мл
Йодноватистокислого калия ( \text{К}JO_{3} ) — 0,03 г
Смесь готовят при комнатной температуре и выдерживают в течение двух недель;
Способ приготовления: смешивают 100 мл 5% раствора алюмокалиевых квасцов (приготовленных на дистиллированной воде) с 5 мл 2% спиртового (на 96° спирте) раствора гематеина. Краситель используется сразу после приготовления;
г) гематоксилин Гейденгайна. Для его приготовления 1 г кристаллического гематоксилина растворяют в 10 мл спирта (абсолютный или 96°) и доливают дистиллированной водой до 100 мл. Краска должна зреть на свету в течение 3 — 5 недель. Красящий раствор при наличии осадка перед употреблением необходимо фильтровать.
Приготовление раствора эозина.
Из множества сортов эозина наибольшее распространение имеют эозин желтый (водорастворимый), голубоватый (растворимый в спирте) и эритрозин (растворимый только в спирте). Используются 0,25 — 0,5% водные или спиртовые растворы эозина. Последние готовятся на спирту различной крепости (40 — 70°). Иногда раствор эозина подкисляют уксусной кислотой (1 капля концентрированной уксусной кислоты на 100 мл раствора).
Фиксированный материал <*>. Срезы замороженные, целлоидиновые и парафиновые.
<*> В методиках, где фиксатор не указан, пригодна любая фиксация.
1. Срезы депарафинируют и доводят до воды.
2. На срез наливают несколько капель профильтрованного раствора гематоксилина, продолжительность окраски 0,5 — 5 мин в зависимости от качества и зрелости гематоксилина. Целлоидиновые и замороженные срезы помещают в чашечку с раствором красителя.
3. Слив краситель в склянку, препарат помещают в большую чашку с водопроводной водой, на 3 — 10 мин (до посинения среза). Целлоидиновые и замороженные срезы переносят иголочкой или лопаточкой в сосуд с водопроводной водой.
4. Срезы докрашивают эозином. Для этого на срез наливают несколько капель красителя на 0,2 — 3 мин. Замороженные и целлоидиновые срезы переносят в раствор эозина.
5. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости, начиная с 70°, просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: ядра клеток окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, цитоплазма — в розовый.
II. Окраска пикрофуксином по способу Ван-Гизона
Для окраски используют железный гематоксилин Вейгерта и пикрофуксин.
Приготовление растворов красителей:
Пикрофуксин. Для получения красителя смешивают 10 мл насыщенного при комнатной температуре водного раствора пикриновой кислоты с 1 мл кислого фуксина.
Железный гематоксилин Вейгерта. Краситель состоит из двух растворов:
Первый — 1% раствор гематоксилина в 96° спирте.
Второй имеет следующий состав:
50% водный раствор хлорного железа ( FeCl_{3} \cdot 6H_{2}O ) — 4 мл (официнальный раствор)
Концентрированная соляная кислота — 1 мл (удельный вес — 1,15 — 1,19)
Перед употреблением оба раствора смешивают в равных количествах.
Смесь должна быть темно-фиолетового цвета, а затем — темно-вишневого.
Если свежеприготовленный краситель сразу начинает буреть и приобретает зеленоватый оттенок, то он непригоден, т.к. будет окрашивать ядра не в черный, а в бурый или зеленоватый цвет. Выпадение хлопьевидного осадка также указывает на непригодность его к употреблению.
Фиксированный материал. Парафиновые и целлоидиновые срезы.
1. Перекрасить срезы в свежеприготовленном гематоксилине Вейгерта (3 — 5 мин).
2. Хорошо сполоснуть в двух порциях водопроводной воды.
3. Окрасить в пикрофуксине в течение 2 — 3 мин.
4. Быстро сполоснуть в воде (5 — 15 с).
5. Провести срезы через 96° спирт, повторно наливая и выдерживая в нем от 1 до 3 мин.
6. Просветлить срезы в карбол-ксилоле, обработать ксилолом и заключить в бальзам.
Из всей группы просветляющих веществ анилиновое масло, как извлекающее пикриновую кислоту, в данном случае непригодно.
Качество окраски препаратов необходимо контролировать под микроскопом, для чего срез повторно извлекают из пикрофуксина и быстро прополаскивают в воде. При сильном перекрашивании срезов железным гематоксилином их дифференцируют 1%-ным солянокислым спиртом в течение 30 — 60 с.
Результат: ядра окрашиваются в черный цвет, соединительная ткань — в ярко-красный, мышечные и эластические волокна — в желтый, нервная — в желтовато-серый.
III. Комбинированная окраска пикрофуксином и фукселином
Фукселин. В 200 мл дистиллированной воды растворить 2 г основного фуксина и 4 г резорцина. Смесь нагреть до кипения и добавить к ней 25 мл официнального раствора полуторахлористого железа (или 25 г сухого вещества). Раствор кипятят еще в течение 5 мин, непрерывно помешивая, затем охлаждают и фильтруют. Образовавшийся на фильтре осадок подсушивают на воздухе и вместе с фильтром помещают в тот же сосуд, где кипятилась краска, т.к. на стенках сосуда после высыхания остается немного осадка. Сюда же вливают 200 мл 96° спирта и, осторожно помешивая, нагревают на водяной бане. После растворения краски фильтр удаляют, жидкость охлаждают и фильтруют. В фильтрат добавляют 96° спирта так, чтобы общий объем составлял 200 мл, и прибавляют 4 мл концентрированной соляной кислоты (уд. вес — 1,16 — 1,19).
Приготовление пикрофуксина см. выше (пропись II).
Фиксированный материал, парафиновые срезы.
1. Срезы депарафинируют и доводят до воды.
2. Окрашивают в растворе фукселина в течение 40 мин при 37 °C (в термостате).
3. Промывают в дистиллированной воде.
4. Помещают в 96° спирт для отмывания красителя и вновь промывают в дистиллированной воде.
5. Окрашивают гематоксилином (Вейгерт, Караци) в течение 20 мин.
6. Помещают срезы в большой сосуд с водопроводной водой на 10 мин.
7. Переносят в сосуд с дистиллированной водой на 5 мин.
8. Окрашивают пикрофуксином в течение 2 — 5 мин.
9. Промывают в дистиллированной воде в течение 30 с.
10. Обезвоживают в 96° и абсолютном спиртах.
11. Просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: ядра в зависимости от гематоксилина окрашиваются в черный (гематоксилин Вейгерта) или сине-фиолетовый цвет (гематоксилин Караци), эластические волокна — в темно-синий, соединительная ткань — в ярко-красный, мышечная — в желтый.
IV. Азокарминовый метод Гейденгайна
Приготовление раствора азокармина. 0,1 г азокармина (или 0,5 — 1% водный раствор азокармина В) растворяют в 100 мл дистиллированной воды и нагревают до кипения, затем охлаждают и фильтруют через рыхлый фильтр. На 100 мл профильтрованного раствора добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.
Фиксация: Ценкер, Ценкер-формол и формалин. Важным условием хорошего качества окраски является промывка кусочков после фиксации в проточной воде в течение 24 — 48 ч.
1. Депарафинированные срезы промывают в дистиллированной воде 3 — 5 мин.
2. Окрашивают в азокармине (в хорошо закрывающейся посуде) в термостате при температуре 50 — 60 °C в течение 1 — 2 ч. Можно пользоваться подогретым красящим раствором, тогда продолжительность окрашивания в термостате сокращается до 20 — 25 мин.
3. Затем стаканчик с препаратами охлаждают до комнатной температуры (5 — 10 мин).
4. Споласкивают срезы в дистиллированной воде.
5. Дифференцируют в анилиновом спирте (1 мл анилинового масла на 1000 мл 90 — 96° спирта), до тех пор пока отчетливо выявятся ядра, при этом темно-красный цвет обесцвечивается, принимая более светлые красные тона (10 — 30 мин). Для ускорения дифференцировки к анилиновому спирту можно добавить немного дистиллированной воды. Дифференцировку ведут под микроскопом.
6. Обрабатывают в течение 0,5 — 1 мин в 1% уксуснокислом спирте (96°).
7. Срезы промывают в дистиллированной воде (0,5 мин).
8. Переносят в 5% водный раствор фосфорновольфрамовой кислоты (для протравления соединительной ткани) на 1 — 3 ч (необходимо работать только стеклянными иголками).
9. Быстро споласкивают в дистиллированной воде.
10. Окрашивают в смеси анилинового синего с оранжем g от 1 до 3 ч.
Анилиновый синий (водорастворимый) - 0,5 г Оранж g - 2 г Дистиллированная вода - 100 мл Уксусная кислота (ледяная) - 8 мл
Смесь кипятят, охлаждают и фильтруют. Для окрашивания пользуются растворами, разведенными в 2 — 3 раза дистиллированной водой.
11. Быстро споласкивают в воде.
12. Дифференцируют в 96° спирте (под контролем микроскопа) до четкого выявления волокнистой синей основы.
13. Абсолютный спирт, ксилол, бальзам.
Результат: коллагеновые и ретикулярные волокна окрашиваются в синий цвет, мышечная ткань — в оранжевый или красный, эритроциты и ядра клеток — в красный, слизь — в синий, нейроглия — в красноватый цвет.
V. Импрегнация соединительнотканной стромы
Метод импрегнации серебром требует химически чистых и неразложившихся реактивов. Кристаллическое азотнокислое серебро по цвету должно быть совершенно белым (розоватое или серое непригодно). Вся стеклянная посуда — безукоризненно чистой (посуда моется в смеси двухромовокислого калия и серной кислоты, затем тщательно промывается в проточной воде от 1 до 3 дней и затем в дистиллированной воде). Для приготовления растворов серебра следует пользоваться только свежей дистиллированной водой. При неудачах используют бидистиллированную воду. В качестве инструментов применяют только стеклянные иглы и крючки. Не допускается загрязнение растворов одной и той же иглой. Одновременно можно серебрить небольшое количество срезов.
Приготовление раствора аммиачного серебра. На каждые 5 мл 10% раствора азотнокислого серебра ( AgNO_{3} ) прибавляют 4 — 5 капель (не более) 40% водного раствора NH_{4}OH . Образуется темно-бурый осадок гидрата окиси серебра. Его растворяют 25% нашатырным спиртом, приливая вначале 6 — 8 капель, затем осторожно добавляя по одной капле, каждый раз хорошо взбалтывая и ожидая 20 — 40 с, прежде чем прибавить следующую каплю. Переливать нашатырный спирт нельзя. Лучше не стремиться к полному растворению осадка и оставлять незначительную его часть в виде отдельных мелких крупинок. На 5 мл 10% азотнокислого серебра потребуется приблизительно от 15 до 25 капель 25% NH_{4}OH в зависимости от калибра пипетки. Процедуру растворения ведут в градуированном цилиндре. Затем раствор аммиачного серебра разводят дистиллированной водой, добавляя ее до 20 мл, и фильтруют. Реактив используют только в свежеприготовленном и профильтрованном виде.
Фиксация формалином, Карнуа, парафиновые срезы.
1. Депарафинированные срезы помещают в 0,5 — 1% раствор перманганата калия на 1 — 2 мин.
2. Промывают в водопроводной воде в течение 5 мин.
3. Обесцвечивают в 1 — 3% растворе метабисульфита калия (1 мин).
4. Промывают в водопроводной воде 5 — 10 мин.
5. Помещают в 2% раствор железоаммиачных квасцов (фиолетовые кристаллы, раствор каждый раз должен быть свежим) на 1 мин.
6. Промывают в водопроводной воде 3 — 5 мин.
7. Споласкивают в 2-х порциях водопроводной воды по 2 мин.
8. Помещают в раствор аммиачного серебра на 1 мин.
9. Быстро споласкивают в дистиллированной воде (5 — 10 с).
Время ополаскивания очень важно, т.к. при слишком быстром споласкивании импрегнация будет очень интенсивной, при продолжительном — неполной.
10. Помещают срезы в раствор 10% формалина (на водопроводной воде) на 5 мин.
11. Промывают в водопроводной воде в течение 5 мин.
12. Переносят в 0,1 — 0,2% раствор хлорного золота ( AuCl_{3} ) на 10 мин.
13. Споласкивают в дистиллированной воде.
14. Помещают в 1 — 3% раствор метабисульфита калия на 1 мин.
15. Обрабатывают 1% раствором гипосульфита в течение 1 мин (не дольше).
16. Промывают в водопроводной воде (10 мин и более).
17. Проводят срезы через спирты, ксилол и заключают в бальзам.
Фиксация 15 — 20% раствором формалина, промывание кусочков после фиксации в проточной воде в течение 24 — 48 ч и несколько часов в дистиллированной. Замороженные срезы.
1. Замороженные срезы собирают в дистиллированную воду и переносят в 0,25% водный раствор марганцовокислого калия на 5 — 10 мин.
2. Споласкивают в водопроводной воде.
3. Помещают в 5% раствор щавелевой кислоты на 15 — 30 мин до побеления срезов.
4. Промывают в большом количестве дистиллированной воды (20 — 30 мин).
5. Переносят в 2% раствор азотнокислого серебра на 48 ч (держать в темноте).
6. Быстро (3 — 5 с) споласкивают в дистиллированной воде.
7. Переносят в раствор аммиачного серебра на 15 — 30 мин (срезы в этом растворе приобретают коричневый цвет).
8. Споласкивают в дистиллированной воде (по одному срезу) в течение 5 — 15 с. Слишком быстрое споласкивание может привести к выпадению осадка при последующей обработке в формалине.
9. Срезы помещают в 5% раствор формалина на 15 — 30 мин.
10. Промывают в водопроводной воде (10 мин и более).
11. Переносят в 0,5 — 1% раствор хлорного золота ( AuCl_{3} ) на 5 — 10 мин. Вместо хлорного золота можно использовать раствор золотохлористоводородной кислоты ( HAuCl_{4} \cdot 4H_{2}O ).
12. Промывают в водопроводной воде 10 — 15 мин.
13. Обрабатывают 5% водным раствором гипосульфита (1 — 3 мин). Результаты обработки контролируются под микроскопом.
14. Затем срезы тщательно промывают в водопроводной воде (от нескольких часов до суток).
15. Ядра клеток докрашивают квасцовым кармином или гематоксилином.
16. Проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол, заключают в бальзам или в полистирол.
В результате импрегнации ретикулярные волокна окрашиваются в черный цвет, коллагеновые — в фиолетовый, коричневый и серовато-черный.
VI. Комбинированное выявление нейтральных и кислых
мукополисахаридов реактивом Шиффа и альциановым синим
Метод представляет собой сочетание двух методик выявления мукопротеидов и нейтральных мукополисахаридов (метод Шифф-иодная кислота по Мак Манусу) и кислых мукополисахаридов с применением альцианового синего.
Йодная кислота. Приготовление растворов. Растворить 0,4 г йодной кислоты ( HJO_{4} \cdot 2H_{2}O ) в 35 мл этилового спирта и добавить 5 мл 0,2 М ацетата натрия (27,2 г гидратированной соли в 1000 мл) и 10 мл дистиллированной воды. Полученный раствор хранить в темноте при температуре 22 °C.
Если раствор приобретает коричневую окраску, то он непригоден. Реактив Шиффа (фуксинсернистая кислота). Растворить 1 г основного фуксина (хлористоводородного парарозоанилина) в 200 мл кипящей дистиллированной воды. Встряхивать в течение 5 мин и охладить раствор точно до 50 °C. Профильтровать и добавить к фильтрату 20 мл 1 № раствора соляной кислоты. Охладить до 25° и добавить 1 г метабисульфита натрия ( Na_{2}S_{2}O_{5} ) или калия. Оставить раствор в темноте на 14 — 24 ч. Добавить 2 г активированного угля и встряхивать в течение 1 мин. Профильтровать, фильтрат хранить в темноте при 0 — 4 °C. Реактив должен быть прозрачным или слегка желтоватого цвета. Если раствор покраснел, то он непригоден к употреблению.
Фиксированный и нефиксированный материал. Срезы парафиновые и замороженные.
2. Окрашивают в течение 5 — 10 мин в свежепрофильтрованном 0,1% растворе альцианового синего в 3% уксусной кислоте.
3. Промывают в дистиллированной воде.
4. Окисляют в 0,5% водном растворе йодной кислоты (2 — 5 мин).
5. Обрабатывают реактивом Шиффа в течение 10 — 15 мин.
6. Промывают в проточной воде.
7. Докрашивают ядра гематоксилином.
8. Хорошо промывают дистиллированной водой.
9. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: мукопротеиды и нейтральные мукополисахариды окрашиваются в пурпурно-красный цвет, гликопротеиды — в бледно-красный или розовый, кислые мукополисахариды — в синий-зеленый цвет, ядра — в синий.
VII. Окраска амилоида красным конго и метил-виолетом
Для выявления амилоида существует ряд специальных методов, из которых наиболее распространенными являются метод с использованием конго красного (конгорот) и метилового фиолетового (метил-виолет).
Метод с применением конго красного
Все виды материала. Лучше всего свежезамороженные срезы тканей, быстро фиксированных в смеси уксусная кислота — этиловый спирт.
1. Срезы окрашивают 1% водным раствором конго красного в течение 1 — 6 ч.
2. Обрабатывают 1% раствором KJ в течение 60 с.
3. Дифференцируют в 70° спирте, до тех пор пока останутся окрашенными только места отложения амилоида.
5. Дополнительно окрашивают ядра квасцовым гематеином Майера (см. пропись 1) в течение 1,5 — 3 мин.
6. Несколько секунд дифференцирует в 1% подкисленном спирте.
7. Погружают срезы в разбавленный буфер (pH 7 — 8) и держат до появления синеватой окраски.
8. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в соответствующую синтетическую смолу.
Результат: амилоид окрашивается в оранжево-красный цвет, ядра — в синий.
Метод с использованием метилового фиолетового.
Фиксация формалином или спиртом. Срезы парафиновые и замороженные. Перед окраской материал промывают в проточной воде в течение нескольких часов.
Методика окраски замороженных срезов
1. Срезы переносят на 1 — 2 мин в 1% раствор генцианового фиолетового (или метилового фиолетового).
2. Споласкивают в воде и дифференцируют в 1 — 2% уксусной кислоте, пока срез станет бледно-фиолетовым (0,5 — 2 мин).
3. Хорошо промывают в водопроводной воде (несколько минут) и контролируют под микроскопом.
4. Извлекают срезы на предметное стекло и заключают в 40 — 50% водный раствор уксуснокислого калия (на дистиллированной воде). Можно заключить в глицерин, но при этом метахроматическое окрашивание быстро исчезает.
Методика окраски парафиновых срезов
1. Парафиновые срезы прямо из воды (не приклеивая их на предметное стекло) на шпателе переносят в 1% водный раствор генцианового фиолетового (или метилового фиолетового) на 15 — 20 мин.
2. Быстро промывают в водопроводной воде (в большой чашке, сменяя ее 2 — 3 раза).
3. Переносят в 2 — 3% раствор уксусной кислоты и держат в нем до тех пор, пока срезы не примут красновато-фиолетовый тон (10 — 15 мин). Дифференцировку лучше вести под контролем микроскопа.
4. Промывают в водопроводной воде 3 — 5 мин. Дольше держать не следует, т.к. метахромазия может исчезнуть.
5. Затем срезы извлекают из воды, наклеивают на обезжиренные предметные стекла и высушивают в термостате при 37 °C в течение 2 — 3 ч и более.
6. Высушенные срезы депарафинируют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: амилоид — красновато-коричневого цвета, другие ткани — синие.
VIII. Выявление соединений железа (по Перлсу)
При проведении реакции необходимо соблюдать следующие условия. Используется только дистиллированная вода, свободная от соединений железа, на ней готовятся все необходимые реактивы. Стеклянная посуда должна быть тщательно вымыта, сполоснута дистиллированной водой и спиртом.
Во время работы пользуются только стеклянными иголками, металлические предметы недопустимы.
Фиксация 96° или абсолютным спиртом, 10% нейтральным формалином (не более 1 — 2 дней). Срезы парафиновые, замороженные, целлоидиновые.
1. Из дистиллированной воды срезы переносят в свежеприготовленную смесь, состоящую из 1 — 2 капель 2% раствора желтой кровяной соли и 1 мл 1% соляной кислоты на 15 — 20 мин.
2. Промывают в дистиллированной воде 5 — 10 мин.
3. Докрашивают ядра квасцовым кармином 10 — 20 мин.
4. Споласкивают в воде и проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: соединения окисного железа окрашиваются в темно-синий цвет, ядра — в красный.
IX. Окраска фибрина (по Вейгерту)
Литиевый кармин Орта. К 100 мл насыщенного водного раствора лития (1,52% при температуре 20 °C) добавляют 2,5 г кармина, кипятят 5 — 10 мин и по охлаждении фильтруют через рыхлую фильтровальную бумагу.
Анилиновая вода. 5 — 10 мл светлого химически чистого анилина энергично взбалтывают со 100 мл дистиллированной воды и фильтруют через смоченный водой фильтр (анилин и его пары ядовиты, обращаться с осторожностью).
Анилиновый генциановый фиолетовый. К 100 мл анилиновой воды прибавляют 11 мл насыщенного раствора генцианового фиолетового, приготовленного на 96° спирте.
Фиксация 96° или абсолютным спиртом, формалином, сулемой. Срезы парафиновые, хуже замороженные и целлоидиновые.
1. Срезы окрашивают литиевым кармином Орта 5 — 10 мин.
2. Переносят в 1% раствор солянокислого спирта (70°) на 5 мин и более для фиксации литиевого кармина (если поместить срезы из кармина в воду, то краситель полностью вымывается).
3. Промывают в водопроводной воде 1 — 3 мин.
4. Окрашивают анилиновым генциновым фиолетовым в течение 5 — 10 мин. Краску наливают с фильтра прямо на срез при условии, что она свежая и хорошего качества. В противном случае краску наливают на фильтровальную бумагу, которую накладывают на срез так, чтобы края ее не заходили за пределы предметного стекла. Когда окрашивание закончено, краску сливают, а фильтровальную бумагу осторожно при ополаскивании в воде снимают со среза.
5. Споласкивают в водопроводной воде 15 — 30 с.
6. Затем срезы обрабатывают в течение 2 — 3 мин слабым раствором Люголя:
Кристаллический йод - 1 г Йодистый калий - 2 г Дистиллированная вода - 300 мл
7. Сливают раствор Люголя и быстро промокают срез сложенной в несколько слоев фильтровальной бумагой.
8. Дифференцируют анилин — ксилолом (1:1), до тех пор пока не отойдет синяя краска и срез из темно-синего не станет красным (3 — 5 мин). Во время дифференцировки предметное стекло все время покачивают.
9. Тщательно удаляют анилин-ксилол несколькими порциями ксилола, применяя его многократно и промокая срез фильтровальной бумагой.
Результат: фибрин окрашивается в сине-фиолетовый или голубой цвет.
X. Выявление извести (по Косса)
Фиксация абсолютным спиртом. Срезы парафиновые, замороженные, целлоидиновые.
1. Срезы доводят до дистиллированной воды.
2. Переносят в 3 — 5% раствор азотнокислого серебра (можно пользоваться и более слабыми растворами) на 10 — 60 мин. Реакцию ведут на свету.
3. Промывают в дистиллированной воде и переносят в 5% раствор гипосульфита на 1 — 2 мин.
4. Основательно промывают в водопроводной воде, обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
После промывки в воде ядра клеток можно докрасить квасцовым кармином.
Результат: известковые отложения окрашиваются в черный цвет.
XI. Комбинированная окраска на кератин
и слизь (по Крейбергу)
Приготовление растворов красителей
Целестин голубой. Растворить 5 г железистых квасцов в 100 мл дистиллированной воды. Оставить на ночь. Добавить 0,5 г целестина голубого и кипятить в течение 3 мин. Остудить, профильтровать и добавить 14 мл глицерина. Раствор хранится в течение нескольких месяцев.
Альциановый синий. Смешать равные объемы 1% водного раствора альцианового синего и 1% раствора уксусной кислоты и добавить 20 мг тимола. Раствор перед употреблением фильтровать.
Спиртовой сафранин. Готовят насыщенный раствор сафранина в абсолютном спирте. Перед употреблением его разводят равными объемами воды и фильтруют.
Фиксация формалином. Срезы парафиновые.
2. Окрашивают ядра целестином голубым в течение 5 мин.
3. Промывают в дистиллированной воде.
4. Помещают срезы на 5 мин в квасцовый гематоксилин Майера (см. пропись 1) и снова промывают в водопроводной воде в течение 10 мин.
5. Быстро дифференцируют в 0,5% растворе соляной кислоты.
6. Хорошо промывают в водопроводной воде.
7. Окрашивают 1% водным раствором эритрозина 5 мин.
9. Быстро дифференцируют в 96° спирте, абсолютном спирте и вновь быстро промывают в воде.
10. Окрашивают альциановым синим в течение 5 мин.
11. Промывают в воде (срез не должен иметь розового оттенка, различимого простым глазом).
12. Быстро обезвоживают в 96° спирте.
13. Окрашивают спиртовым раствором сафранина в течение 5 мин.
14. Споласкивают в 2-х порциях абсолютного спирта.
15. Просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: ядра клеток окрашиваются в темно-синий цвет, кислые мукополисахариды — в синий, соединительная ткань — от желтого до оранжевого, кератин — в темно-красный, другие элементы — в различные оттенки красного цвета.
XII. Окраска нервной ткани крезил-виолетом
и тионином (по Нисслю)
Для выполнения этой методики используются следующие красители: толуидиновый синий, тионин и крезиловый фиолетовый в водных растворах (на дистиллированной воде), первые два в разведении 1:1000, последний 0,5%. Срок созревания красителей до 3-х месяцев.
Используются кусочки ткани не толще 0,3 — 0,4 см, лучшая фиксация 96° спиртом. Помимо фиксации кусочки выдерживаются в спирте в течение недели (для обезжиривания). При этом спирт меняют через каждые 2 — 3 - 4 дня, до тех пор, пока отработанный спирт не даст отрицательной пробы на жир (т.е. при смешивании с водой не будет образования мути). Помимо чистого спирта хорошие результаты дает фиксация в смеси спирта с формалином (10% формалин на 96° спирте) в течение 1 — 2 дней, затем обезжиривание в чистом 96° спирте. Возможна фиксация в 10 — 15% формалине (1 — 2 дня), затем промывание в проточной воде (24 ч), обезжиривание и обезвоживание в 96° спирте.
Срезы тонкие целлоидиновые и парафиновые. Перед окраской целлоидиновые срезы рекомендуется выдерживать 1 — 2 дня в 96° спирте в термостате при температуре 37 — 40 °C.
1. Срезы доводят до воды и ведут окрашивание при осторожном нагревании над пламенем спиртовки (отфильтрованный краситель капают на предметное стекло до появления пузырьков, при этом срезы должны быть сильно перекрашены). Целлоидиновые срезы подогревают в расправленном виде в краске на часовом стекле. После подогревания для достижения большей закрашенности срезы иногда оставляют в красителе (0,5 ч или на ночь). Иногда срезы подвергают холодному окрашиванию, оставляя их в красителе на ночь, если недостаточно, то на 2 дня. Можно вести окрашивание в термостате при температуре 37 — 40 °C.
2. Споласкивают срезы в водопроводной воде 1 — 2 мин.
3. Дифференцируют в чистом 96° спирте или в специальных дифференцирующих смесях: анилиновый спирт (1 часть анилинового масла + 9 частей 96° спирта), 1 — 3% метиловый на 96° этиловом спирте. При загрязнении дифференцирующей смеси красителем ее сменяют. В зависимости от степени закрашивания и качества красителя дифференцировка длится от нескольких минут до нескольких часов. Последнюю ведут под контролем микроскопа, до тех пор пока отчетливо не выступят детали нервной клетки. Для ускорения дифференцировки срезы можно обработать теплым (при температуре до 50 °C) 50% спиртом, а затем доводить ее до конца 96° спиртом. Препараты должны быть отдифференцированы и заключены в один и тот же день. Оставлять их на ночь в спирте нельзя.
5. Срез промокают фильтровальной бумагой, сложенной в 3 — 4 слоя, и просветляют в кайепутовом (или эвкалиптовом) масле или озонированном скипидаре. Можно обойтись и без просветляющих средств, если во время дифференцировки после 96° спирта использовать еще и абсолютный. Затем срез подсушивают фильтровальной бумагой и просветляют ксилолом.
6. Срез основательно промывают в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: тигроидная зернистость окрашивается в инсивно-синий, лиловый или фиолетовый цвет, ядра ганглиозных клеток — в слегка синеватый цвет, ядрышки — в темно-синий.
Примечание. При окраске препараты могут иногда приобретать зеленый цвет, это связано с повышенной влажностью воздуха в помещении, либо с увлажнением среза при дыхании, либо при повторном употреблении недостаточно сухой фильтровальной бумаги. В таких случаях нужно работать около настольной лампы, тщательно обрабатывая срез абсолютным спиртом. Препараты, окрашенные по методу Ниссля, следует хранить в темноте, т.к. на свету они выцветают.
XIII. Реакция Фельгена для выявления ДНК
Реактив Шиффа. (Приготовление фуксинсернистой кислоты см. пропись 6). 1 № раствор соляной кислоты на дистиллированной воде. Для соляной кислоты понятия нормальный и молярный растворы совпадают. Исходя из молекулярного веса HCl для приготовления молярного раствора следует взять ее в чистом виде в количестве 36,5 г. Известно, что максимальный уд. вес HCl составляет 1,19 и содержит чистой кислоты 37,3% (по справочнику). Следовательно, для приготовления исходного раствора HCl нужно определить, в каком количестве концентрированной HCl содержатся 36,5 г. Пользуясь пропорцией, находим, что в 97,8 г концентрированной HCl содержится 36,5 г чистой кислоты. Переводя весовую меру в объемную, получаем (97,8:1,19) — 82 мл. Следовательно, для приготовления нормального раствора соляной кислоты нужно взять 82 мл концентрированной соляной кислоты уд. веса 1,19 и долить ее до 1 л дистиллированной водой.
Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл 10% раствора бисульфита натрия и 10 мл нормального раствора соляной кислоты. Сернистая вода готовится каждый раз свежая и должна обладать характерным запахом SO_{2} .
Фиксация в жидкости Карнуа, Ценкера, Рего, Орта, Ценкер — формоле, 10 — 15% нейтральном формалине. Срезы тонкие, парафиновые, замороженные и целлоидиновые.
1. Срезы депарафинируют и доводят до воды. Замороженные срезы предварительно выдерживают в течение 24 ч в 96° спирте для удаления липоидного альдегида (плазмаля).
2. Проводят гидролиз в 1 № HCl на водяной бане или в термостате при температуре 60 °C в течение 3 — 8 мин. По некоторым прописям используют 5 № раствор HCl для гидролиза в течение 1 ч при температуре 25 °C. Для прекращения гидролиза препараты опускают в холодную воду, а затем быстро споласкивают в холодном растворе HCl.
3. Проводят окрашивание срезов, поместив их в закрытый сосуд с фуксинсернистой кислотой на 1 — 2 ч. Окрашивание ведут в темноте.
4. Тщательно промывают срезы в 3-х порциях сернистой воды по 2 мин в каждой.
5. Промывают в дистиллированной воде 5 — 10 мин.
6. Обезвоживают в спиртах, ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: ядра окрашиваются в красно-фиолетовый цвет. Для проверки результатов проводят контроль. Часть срезов, не подвергая гидролизу, после кратковременного пребывания в холодном нормальном растворе соляной кислоты, помещают в раствор фуксинсернистой кислоты на 1 — 2 ч. Содержимое ядер в этом случае не окрашивается.
XIV. Реакция на РНК (по Унна-Браше)
Фиксация абсолютным спиртом, жидкостью Карнуа, смесью абсолютного спирта с ледяной уксусной кислотой (1:1), 10 — 15% раствором нейтрального формалина. Срезы парафиновые и целлоидиновые.
1. Срезы промывают в дистиллированной воде 3 — 10 мин и помещают в смесь метилового зеленого с пиронином на срок от 15 — 20 мин до 1 — 2 ч.
Спирт 96° - 2,5 мл Глицерин - 20 мл 0,5% водный раствор карболовой кислоты - 100 мл
2. Быстро споласкивают в дистиллированной воде.
3. Быстро споласкивают в 96° этиловом спирте.
4. Дифференцируют и обезвоживают в нормальном бутиловом спирте 0,5 — 1,5 ч. Для получения сравнимых результатов сроки обработки в бутиловом спирте должны быть всегда одинаковыми.
5. Промывают в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: ядра окрашиваются в зеленый или сине-зеленый цвет, цитоплазма приобретает различные оттенки розового и красного цвета, ядрышки окрашиваются в красный цвет.
Рекомендуется проводить контроль. Для этого часть срезов обрабатывают рибонуклеазой или раствором 5% трихлоруксусной кислоты. Клеточные структуры, содержащие РНК и принимающие красный цвет после обработки рибонуклеазой, не окрашиваются.
XV. Окраска жиров суданом III, IV и суданом черным «B»
Судан III, IV. 0,3 г сухого красителя растворяют в 100 мл 70° спирта и осторожно кипятят в конической колбе на песочной или водяной бане в течение нескольких минут, затем охлаждают, фильтруют и хранят в закрытой посуде. Для повышения красящих свойств раствор выдерживают в течение нескольких дней в термостате при температуре 37 °C.
Судан черный «B». 0,1 — 0,2 г сухого красителя растворяют в 100 мл 70° спирта, нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют.
Фиксация формалином. Хорошие результаты дает свежефиксированный материал. Сразы замороженные, толщиной 10 — 15 мкм.
1. Срезы споласкивают в 50 — 70° спирте в течение 0,5 — 1 мин.
2. Помещают в свежеотфильтрованный красящий раствор на 5 — 25 мин для суданов III, IV и на 20 — 30 мин для судана черного.
3. Споласкивают в 50 — 70° спирте 0,5 — 1 мин.
4. Промывают в проточной воде 10 — 30 мин.
5. Докрашивают ядра квасцовым гематоксилином (Бемера, Делафильда, Караци) от 0,5 до 3 мин для суданов III, IV и кармином в течение 5 мин для судана черного «B».
6. Вновь промывают в дистиллированной воде и заключают в глицерин-желатину или в глицерин.
Результат: жировые включения окрашиваются суданом III, IV в красный цвет, суданом черный — в черный.
Примечание. Судан III, IV используется для выявления нейтральных жиров, холестерина, фосфатидов и цереброзидов, судан черный «B» — для обнаружения фосфолипидов.
XVI. Выявление лейкоцитов в тканях
(окраска альфа-нафтол-суданом по Гольдману)
Судан III или IV - 0,5 - 0,6 г Спирт 96° чистый - 70 мл Вода дистиллированная - 50 мл Альфа-нафтол - 1,2 г
Смесь кипятят в течение 3 — 5 мин в колбе на небольшом огне. Дольше кипятить нельзя, т.к. краска может разложиться. Красящий раствор представляет собой опалесцирующую или мутную жидкость от карминового до оранжево-красного цвета. Перед употреблением небольшое количество краски желательно подогреть (до начала кипения), охладить и профильтровать.
Фиксация 10 — 20% формалином, срезы замороженные.
1. Срезы споласкивают в 50 — 70° спирте от 0,5 до 1 мин.
2. Переносят в свежеотфильтрованный раствор красителя на 20 — 60 мин.
3. Вновь прополаскивают 1 — 2 мин в 50 — 70° спирте для дифференцировки и предупреждения осадков судана.
4. Промывают в водопроводной воде и контролируют качество дифференцировки под микроскопом, если нужно вновь продолжают обработку в 50 — 70° спирте, добиваясь чистого фона с резко выделяющимися лейкоцитами.
5. Подкрашивают срезы квасцовым гематоксилином. В случае необходимости дифференцируют 1% водным раствором соляной кислоты.
6. Заключают в гумми-сироп или в глицерин, глицерин-желатину, поливиниловый спирт.
Результат: зернистость лейкоцитов окрашивается в оранжево-красный цвет.
Примечание. При низкой температуре красителя окрашивание идет плохо. Можно окрашивать срезы при 37 °C в течение 10 — 30 мин, а при комнатной температуре в течение нескольких часов.
XVII. Окраска бактерий патогенных грибов и простейших
а) окраска микобактерий туберкулеза и палочек лепры карбол-фуксином Циля
Приготовление растворов красителей
Карбол-фуксин Циля. Состоит из одной части насыщенного спиртового (на 96° спирте) основного фуксина (1 г красителя на 10 мл спирта) и десяти частей 5% водного раствора карболовой кислоты.
Метиленовый синий Лефлера. 30 мл профильтрованного насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешать со 100 мл 0,01% раствора едкого калия. Раствор должен созревать в течение 1 месяца в термостате при температуре 37 °C в хорошо закрытой посуде.
Фиксация абсолютным или 96° спиртом, сулемой, формалином. Срезы парафиновые, несколько хуже замороженные и целлоидиновые.
1. Срезы депарафинируют и доводят до спирта. Целлоидин удаляют смесью спирта с эфиром.
2. На срез, покрытый фильтровальной бумагой, которая не должна заходить за края предметного стекла, наливают карбол-фуксин и подогревают над пламенем спиртовки до появления паров. Подогревание ведут в течение 1 — 2 мин, затем краску оставляют на срезе после прекращения подогревания еще на 20 — 25 мин.
3. Краску сливают и при споласкивании в воде осторожно снимают со среза фильтровальную бумагу.
4. Дифференцируют 1% солянокислым спиртом (70°) до появления бледно-розового тона.
5. Промывают в водопроводной воде 1 — 2 мин.
6. Докрашивают срезы метиленовым синим Лефлера в течение 0,4 — 0,5 мин. Окрашивают не сильно, затем дифференцируют в 0,5 — 1% солянокислом спирте и хорошо промывают в воде.
7. Быстро проводят через спирты, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, ядра — в синий.
б) окраска бактериальной флоры и патогенных грибов по Грам-Вейгерту
Приготовление растворов красителей
Литиевый кармин Орта (см. пропись IX).
Генциановый фиолетовый (генциан-виолет) или кристаллический фиолетовый (кристалл-виолет) на анилиновой воде. К 10 мл дистиллированной воды добавляют 1 мл анилинового масла, хорошо взбалтывают в пробирке (1 — 2 мин) и фильтруют через влажный фильтр. Если фильтрат слегка мутноват, его снова фильтруют через влажный фильтр. К прозрачному фильтрату добавляют 1 мл насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового (кристаллического фиолетового).
Генциановый фиолетовый или кристаллический фиолетовый на карболовой воде. Смешивают одну часть насыщенного спиртового раствора генцианового фиолетового с десятью частями 2% водного раствора карболовой кислоты.
Фиксация лучше всего спиртом (абсолютным или 96°), сулемой, хуже формалином. Срезы лучше парафиновые, можно замороженные и целлоидиновые.
1. Срезы депарафинируют и окрашивают литиевым кармином Орта 5 — 10 мин.
2. Переносят в 1% солянокислый спирт (70°) на 5 мин и более (чем дольше, тем лучше).
3. Промывают в водопроводной воде 1 — 3 мин.
4. Окрашивают анилиновым или карболовым генциановым фиолетовым 5 — 10 мин.
Окрашивание проводят на предметном стекле. Во избежание образования осадков краску наливают на фильтровальную бумагу, которую накладывают на срез так, чтобы края ее не заходили за пределы предметного стекла.
5. Ополаскивают срез в водопроводной воде и осторожно снимают фильтровальную бумагу.
6. Срез обрабатывают в течение 2 — 3 мин раствором Люголя следующего состава:
Кристаллический йод - 1 г Йодистый калий - 2 г Дистиллированная вода - 300 мл
7. Раствор Люголя сливают и быстро промокают срез сложенной в несколько слоев фильтровальной бумагой.
8. Срезы дифференцируют анилиновым маслом, повторно наливая его на стекло, до тех пор пока не отойдет синяя краска, а срез из темно-синего вновь не станет красным (3 — 5 мин).
9. Тщательно удаляют анилиновое масло ксилолом, применяя его многократно и промокают фильтровальной бумагой.
Результат: грам-положительные микробы окрашиваются в темно-синий цвет.
Примечание. В данной методике можно обходиться без литиевого кармина, в таком случае окраску начинают сразу с генцианового фиолетового. После дифференцировки анилиновым маслом такие срезы принимают бледно-желтую или сероватую окраску.
в) окраска метиленовым синим Лефлера
Приготовление раствора красителя (см. пропись XVII).
Фиксация спиртом (абсолютным или 96°), сулемой, формалином. Срезы парафиновые, замороженные и целлоидиновые.
1. Срезы депарафинируют и помещают в раствор метиленового синего (или наливают краситель прямо на срез) на 5 — 10 мин.
2. Хорошо споласкивают в водопроводной воде.
3. Дифференцируют в 0,5% водном растворе уксусной кислоты около 3 — 10 с.
4. Споласкивают в водопроводной воде и проверяют под микроскопом качество дифференцировки. Критерием достаточности являются резко выделяющиеся клеточные структуры.
5. Быстро проводят через спирты (абсолютный и 96°), просветляют в ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: возбудители дифтерии окрашиваются в синий цвет.
г) импрегнация грам-отрицательных бактерий и спирохет по Левадити.
Фиксация маленьких (толщиной 2 — 3 мм) кусочков в формалине не менее суток. Берут несколько кусочков, т.к. не во всех из них исследуемые объекты могут быть хорошо импрегнированы.
1. Перекладывают кусочки из фиксатора на сутки в 96° спирт.
2. Промывают их в дистиллированной воде, до тех пор пока кусочки не потонут.
3. Затем помещают в 1,5 — 3% раствор азотнокислого серебра на абсолютно чистой дистиллированной воде на 3 — 6 дней. Импрегнацию ведут в термостате при температуре 37 °C в темной посуде.
4. Кусочки промывают в дистиллированной воде.
5. Для восстановления серебра их помещают при комнатной температуре на 24 — 48 ч в следующую смесь:
Пирогалловая кислота (пиррогаллол) - 2 - 4 мл 40% формалин - 5 мл Вода дистиллированная - 100 мл
7. Заливают в парафин, получают тонкие срезы, хорошо просушивают, удаляют парафин ксилолом и заключают их в канадский бальзам.
Ядра клеток можно докрасить сафранином, карболовым фуксином или толуидиновым синим.
Результат: спирохеты окрашиваются в черный цвет на желтоватом фоне ткани.
Примечание. На поверхности кусочков и по краям срезов могут выпадать осадки, которые зависят от плохой промывки кусочков после серебрения.
XVIII. Методы окраски нервной ткани
Для достижения хороших результатов методы импрегнации требуют исключительно чистой посуды и реактивов. Срезы перекладывают только стеклянными иголками, которые часто меняют.
а) импрегнация ретикулиновой ткани мозга (по Снесареву)
Фиксация формалином, тонкие (4 — 6 мкм) парафиновые срезы.
1. Срезы депарафинируют и промывают в 2-х порциях дистиллированной воды.
2. Переносят в 10% раствор нейтрального формалина на 1 сутки.
3. Промывают в дистиллированной воде.
4. Помещают в вертикальном положении в 2% раствор карболовой желатины на 1 сутки в термостат при температуре 37 °C.
5. Вынув из желатины, срезы подсушивают (в вертикальном положении) до равномерного подсушивания.
6. Помещают в 10% нейтральный формалин на 1 сутки.
7. Промывают в 2-х порциях дистиллированной воды.
8. Переносят в 4% раствор железоаммиачных квасцов на 1 сутки.
9. Хорошо промывают в дистиллированной воде.
10. Помещают в 10% раствор азотнокислого серебра на 1 сутки.
11. Быстро промывают в дистиллированной воде и переносят в раствор аммиачного серебра на 30 мин.
10% раствор азотнокислого серебра - 12 мл 40% раствор едкого натрия - 9 капель
Аммиак — по каплям до просветления раствора
Вода дистиллированная — до 60 мл
12. Быстро промывают в дистиллированной воде.
13. Переносят в раствор 10% кислого формалина на 5 — 10 мин.
14. Промывают в водопроводной воде и затем в дистиллированной.
15. Переносят срезы в раствор хлорного золота (1 мл 1% хлорного золота смешивают с 50 — 60 мл дистиллированной воды) до появления серого фона.
16. Промывают в дистиллированной воде.
17. Помещают в 5% раствор гипосульфита на 1 с.
18. Промывают в дистиллированной воде.
19. Обезвоживают в абсолютном спирте (2 порции), ксилоле (2 порции) и заключают в бальзам.
Результат: аргирофильные волокна импрегнируются в черный цвет.
б) выявление осевых цилиндров (по Бильшовскому).
Размер кусочков до 1 см, фиксация 10 — 15% раствор нейтрального формалина (2 — 8 недель). Промывка 24 ч в проточной воде и несколько часов в дистиллированной. Срезы замороженные, толщиной 5 — 10 мк.
1. Срезы выдерживают в дистиллированной воде 1 — 2 ч.
2. Помещают в 2% раствор азотнокислого серебра на 24 — 48 ч (в темноте).
3. Быстро споласкивают в дистиллированной воде (2 — 3 с).
4. Переносят в свежеприготовленный и отфильтрованный раствор аммиачного серебра (см. пропись 5) на 5 — 20 мин.
5. Быстро споласкивают в дистиллированной воде и переносят в 20% раствор нейтрального формалина на 5 — 10 мин. При этом срезы быстро темнеют и принимают темно-бурую окраску.
6. Промывают в водопроводной воде 10 — 20 мин.
7. Обрабатывают слабым раствором хлорного золота или золотохлористоводородной кислоты (1 — 3 капли 1% хлорного золота или золотохлористводородной кислоты на 1 мл дистиллированной воды) в течение 1 — 2 ч до появления на срезах сероватого или фиолетового тона.
8. Промывают в водопроводной воде 5 — 10 мин.
9. Перекладывают срезы в 5% раствор гипосульфита на 1 — 2 мин для удаления невосстановленного серебра. В случае резкой импрегнации в гипосульфите срезы держат дольше (3 — 5 мин), контролируя под микроскопом. Долго оставлять срезы в гипосульфите нельзя, т.к. импрегнация ослабевает.
10. Промывают в водопроводной воде до суток.
11. Обезвоживают в спиртах, просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле и заключают в бальзам.
Результат: внутриклеточные фибриллярные структуры и осевые цилиндры импрегнируются в черный цвет.
в) золото-сулемовый метод импрегнации астроцитарной глии по Рамон-Кахалю
Приготовление золото-сулемового раствора
0,5 г кристаллической сулемы растирают в порошок и высыпают в колбу с 50 мл дистиллированной воды. Растворяют при нагревании, не доводя до кипения. Теплый раствор фильтруют и тотчас приливают к нему 6 мл 1% раствора хлорного золота ( AuCl_{3} ). При отсутствии последнего можно использовать золотохлористоводородную кислоту ( HAuCl_{4} \cdot 4H_{2}O ).
Кусочки ткани толщиной не более 0,5 см. Фиксация бром-формолом при комнатной температуре 2 — 20 дней (не дольше).
Формалин нейтральный - 15 мл Вода дистиллированная - 85 мл Аммоний бромистый - 2 г
Срезы замороженные, толщиной 15 — 25 мкм собирают в свежую порцию фиксирующей жидкости.
1. Споласкивают в 2-х порциях дистиллированной воды.
2. Помещают в золото-сулемовый раствор на 3 — 6 ч при комнатной температуре до появления пурпурного или красноватого цвета. Дольше держать нельзя, т.к. срезы могут потемнеть.
3. Переносят в 5% раствор гипосульфита на 5 — 10 мин или в специальный фиксатор Кахаля следующего состава:
Гипосульфит - 5 г Вода дистиллированная - 70 мл Спирт 96° - 30 мл Концентрированный раствор бисульфита натрия - 5 мл
5. Вылавливают срезы на предметные стекла, тщательно расправляют, обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.
Результат: астроциты и их отростки окрашиваются в пурпурно-красный цвет. Центральные части астроцитов отличаются более интенсивной окраской, фон — светло-красный.
г) метод импрегнации серебром микроглии и гистиоцитов (по Мийягава-Александровской)
Приготовление раствора аммиачного серебра
К 2 мл 20% раствора азотнокислого серебра добавляют 2 капли 10 — 15% аммиака (обычный нашатырный спирт, разведенный пополам) и доливают дистиллированной водой до 30 мл. Раствор фильтруют через двойной фильтр.
Приготовление растворов желатины и методика заливки в нее
Из бесцветной пищевой желатины готовят 2 раствора 12,5% и 25% на 1% карболовой (дистиллированной) воде. Вначале готовят 25% раствор, для чего навеску желатины мелко разрезают, высыпают в широкогорлую банку, заливают соответствующим количеством воды и хранят в термостате при температуре 37 °C до полного растворения. Часть приготовленной желатины разводят пополам теплой 1% карболовой водой для получения 12,5% раствора. Пропитывание кусочков проводится в термостате при 37 °C. Хорошо промытые проточной водой кусочки помещают вначале в 12,5% раствор желатины на 3 — 6 ч, а затем в 25% раствор на 6 — 12 — 24 ч. Пропитывание ведут в небольших и хорошо закрытых широкогорлых банках во избежание испарения воды и сгущения желатины. По окончании пропитывания 25% раствор желатины с кусочками разливают в предварительно подогретые маленькие чашки, помещают в них кусочки и быстро охлаждают в чашке с холодной водой. Из затвердевшей желатины вырезают блоки и подвергают их уплотнению в 20% формалине (3 — 6 ч) и сохраняют в 10% формалине.
Фиксация формалином. Старый материал рекомендуется дофиксировать в 20% формалине, лучше в термостате при 37 °C в течение 2 — 3 дней. Промывка в проточной воде 24 ч и заключение в карболовую желатину.
1. Вырезают желатиновые блоки с кусочками, уплотняют их в формалине 18 — 24 ч.
2. Промывают в проточной воде до 1 ч и готовят замороженные срезы толщиной 10 — 15 мкм. Срезы собирают в дистиллированную воду.
3. Переносят в 10% раствор формалина на 10 — 20 мин.
4. Затем перекладывают в слабый раствор щелочи (на 20 мл дистиллированной воды 2 капли 40% едкого натрия) на 1 — 5 мин.
5. Быстро (3 — 5 с) промывают в дистиллированной воде.
6. Переносят в чашку с аммиачным серебром на 15 — 25 с, где срезы быстро передвигают стеклянной иголочкой.
7. Погружают по 1 — 2 среза в слабокипящий 10% раствор формалина на 2 — 10 с. Срезы сразу буреют. Одновременно буреет раствор формалина. Кипячение формалина ведут в вытяжном шкафу на малом огне в фарфоровой чашечке с закрытой крышкой.
8. Из кипящего формалина срезы переносят в холодный 10% формалин на 30 минут.
9. Быстро промывают в дистиллированной воде и затем в водопроводной. Последнюю несколько раз меняют.
10. Помещают в 5% раствор гипосульфита (на дистиллированной воде) на 30 — 60 с.
11. Промывают в дистиллированной воде.
12. Вылавливают срезы на предметные стекла, смазанные белком с глицерином и обработанные сухим жаром.
13. Срезы подсушивают сложенной в 3 — 4 слоя фильтровальной бумагой и проводят через спирты, карбол-ксилол, ксилол и заключают в бальзам.
Результат: при хорошей импрегнации отчетливо выступают все детали клеток микроглии (тела, ядра, отростки). В норме эти клетки определяются в небольшом количестве и не во всех частях препарата.
д) окраска миелиновых оболочек по Шпильмейеру
Фиксация 10 — 15% формалином (3 — 5 дней). Промывают в проточной воде 1 — 2 ч. Срезы замороженные, толщиной 20 — 30 мкм.
1. Срезы протравляют в 2,5% растворе железоаммонийных квасцов 6 — 18 ч.
2. Хорошо промывают в дистиллированной воде (1 — 2 ч и более).
3. Помещают в чашечку с 70° спиртом на 10 мин и в ней передвигают срезы при помощи стеклянной иголки.
4. Окрашивают в старом профильтрованном растворе гематоксилина Гейденгайна (см. пропись 1), разведенным в два раза дистиллированной водой, в течение 6 — 18 ч.
5. Срезы споласкивают в дистиллированной воде и дифференцируют в 2,5% растворе железоаммонийных квасцов (квасцы должны быть прозрачными, фиолетового цвета, беловатые или зеленые кристаллы непригодны). Процесс дифференцировки идет медленно. Контроль ведут через каждые 10 — 15 мин под микроскопом.
6. Основательно промывают в дистиллированной воде, а затем в водопроводной (1 — 2 ч).
7. Обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.
Результат: мякотные волокна окрашиваются в сине-черный цвет.
XIX. Иммуногистохимические методы (см. руководства)
XX. Методы выявления ферментов
а) метод азосочетания для выявления щелочной фосфатазы
Срезы из нефиксированной, свежезамороженной ткани или из тканей, фиксированных холодным (4 °C) 10% нейтральным формалином в течение 10 — 16 ч. Срезы наклеивают на предметные стекла без применения клеящих средств.
1. Подсушивают на воздухе в течение 1 — 3 ч, чтобы обеспечить приклеивание их к стеклу.
2. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 — 60 мин в среде следующего состава:
Альфа-нафтилфосфат - 3 мг Трис буфер 0,1 М, pH 10 - 3 мл Прочный синий RR - 3 мг
Смесь хорошо перемешать и перед употреблением отфильтровать.
3. По истечении времени инкубации срезы вынимают из инкубационного раствора и промывают в проточной воде 1 — 3 мин.
4. Докрашивают гемалауном Майера (4 — 6 мин).
5. Промывают в проточной воде 30 — 60 мин.
6. Заключают в глицерин-желатин.
Результат: места активности щелочной фосфатазы окрашиваются в серовато-черный цвет, ядра — в темно-синий цвет.
б) метод азосочетания для выявления кислой фосфатазы
Срезы нефиксированной свежезамороженной ткани или замороженные срезы из тканей, фиксированных в формалине. Срезы наклеиваются на предметные стекла без какого-либо клеящего вещества.
1. Срезы инкубируют в термостате при 37 °C в смеси, приготовленной по следующей прописи: растворить 3 мг \alpha - \text{нафтилфосфата} натрия в 3 мл 0,1 М веронал-ацетатного буфера (Михаэлис) при pH 5,0 или 0,1 М ацетатном буфере (по Уолполу), добавить 3 мг прочного гранатового (или прочного красного), хорошо смешать и отфильтровать непосредственно на срезы.
2. После инкубации срезы промывают в водопроводной воде в течение 2 мин.
3. Докрашивают гемалауном Майера (4 — 6 мин).
4. Промывают в проточной воде.
5. Заключают в глицерин-желатин.
Результат: участки, обнаруживающие активность кислой фосфатазы окрашиваются в красновато-коричневый цвет, ядра — в темно-синий. Более длительная инкубация приводит к образованию кристаллов.
Срезы из нефиксированной ткани, фиксированной в формалине и из тканей, залитых в парафин после лиофилизации.
1. Срезы инкубируют в среде следующего состава:
АТФ (125 мг на 100 мл) - 20 мл Трисмалеатный буфер (pH 7,2), 0,2 М - 20 мл 2% раствор нитрата свинца - 3 мл 0,1 М раствор сульфата магния - 5 мл Дистиллированная вода - 2 мл
Инкубацию проводят от 5 до 180 мин в термостате при 37 °C.
2. По окончании инкубации срезы споласкивают в дистиллированной воде.
3. Быстро помещают в 1 — 2% раствор уксусной кислоты и вновь споласкивают в дистиллированной воде.
4. Переносят в 1% раствор желтого сульфида аммония.
5. Споласкивают в водопроводной воде.
6. Заключают в водорастворимую среду или обезвоживают в спиртах, просветляют в газолине или тетрахлорэтане и заключают в синтетическую смолу, растворенную в этом же растворителе.
Результат: коричнево-черный осадок сульфида свинца указывает на локализацию АТФ-азы.
г) метод выявления глюкозо-6-фосфатазы
Срезы из свежезамороженной нефиксированной ткани.
1. Инкубируют в среде следующего состава:
1 часть 1% раствора натриевой или калиевой соли глюкозо-6-фосфата и 2 части 0,006 М (0,2%) раствора нитрата свинца. При смешивании выпадает небольшой осадок, который необходимо фильтровать.
Инкубацию ведут в термостате при 32 °C в течение 5 — 15 мин.
2. Споласкивают в дистиллированной воде.
3. Быстро погружают в 1 — 2% раствор уксусной кислоты и вновь споласкивают в дистиллированной воде.
4. Помещают на 2 мин в 1% раствор сульфида аммония, затем споласкивают в проточной воде. Заключают в водорастворимую среду или обезвоживают в спиртах, просветляют в газолине или в тетрахлорэтане и заключают в синтетическую смолу.
Результат: коричнево-черный осадок сульфида свинца указывает на локализацию глюкозо-6-фосфатазы.
д) выявление эстеразы методом с использованием \alpha - \text{нафтилацетата}
Фиксация холодным формалином, срезы замороженные; парафиновые, криостатные срезы с последующей фиксацией в формалине.
1. Замороженные срезы, толщиной 10 — 15 мкм, наклеивают на чистые предметные стекла и высушивают на воздухе для обеспечения приклеивания.
2. Инкубируют в течение 1 — 15 мин при комнатной температуре в среде следующего состава: растворяют 10 мг \alpha - \text{нафтилацетата} в 0,25 мл ацетона и добавляют 20 мл 0,1 М фосфатного буфера (pH 7,4). Энергично встряхивают, пока не исчезнет большая часть первоначального помутнения. Добавляют 50 — 100 мг прочного синего BB, хорошо встряхивают и профильтровывают непосредственно на срезы. Замороженные срезы при этом должны быть сухими, а парафиновые — влажными.
3. Промывают в водопроводной воде в течение 2 мин.
4. Дополнительно окрашивают гемалауном Майера в течение 4 — 6 мин.
5. Промывают в проточной воде не менее 30 мин.
6. Заключают в глицерин-желатин.
Результат: структуры, обладающие эстеразной активностью, окрашиваются в черный цвет, ядра — в темно-синий.
е) выявление \beta - \text{глюкуронидазы} методом последующего азосочетания
Срезы нефиксированной замороженной ткани и фиксированные в течение 10 мин в холодном нейтральном формалине.
1. Срезы промывают в холодной воде в течение 15 мин.
2. Инкубируют в термостате при 37 °C от 4 до 6 ч в среде следующего состава:
\beta - (6 - \text{Бром} - 2 - \text{нафтил}) - \text{Д} - \text{глюкопиранозид} — 30 мг растворенный в 5 мл метанола
Фосфатно-цитратный буфер 0,15 М, pH 4,95 - 20 мл Вода дистиллированная - 75 мл
3. После инкубации срезы промывают в течение 1 мин в водопроводной воде.
4. Погружают на 2 мин в раствор прочного синего B (готовится непосредственно перед употреблением растворением (1 мг/1 мл) в холодном (4 °C) фосфатном буфере 0,02 М, pH 7,5).
5. Дважды промывают в двух сменах холодной дистиллированной воды.
6. Споласкивают в 0,1% растворе уксусной кислоты и заключают в смесь глицерин-желатина.
Результат: места, обладающие \beta - \text{глюкуронидазной} активностью окрашиваются в синий или пурпурный цвет. Структуры, содержащие липиды, окрашиваются в красный цвет.
ж) метод выявления фосфорилазы
Срезы из нефиксированной замороженной ткани, толщиной 20 мкм.
1. Срезы инкубируют в среде следующего состава:
Глюкозо-1-фосфат (натриевая соль) - 50 мг Аденозин-5-фосфат - 10 мг Ацетатный буфер 0,1 М, pH 5,7 - 20 мл Этанол - 5 мл Гликоген - 2 мг
Раствор инсулина 1 — 2 капли (10 — 20 единиц).
Время инкубации 3 — 4 ч. Температура 37 °C.
2. По окончании инкубации срезы погружают на несколько мин в разбавленный раствор Люголя, приготовленный по прописи:
Основной раствор Грама (составляющие его компоненты находятся в соотношении J_{2}:KJ:H_{2}O соответственно 1:2:300) разбавляют в 10 раз дистиллированной водой. Срезы помещают в йод-глицериновый раствор (основной раствор Грама разбавляют глицерином в соотношении 1:9).
3. Затем срезы заключают в смесь йода с глицерином или в глицерин и покровное стекло окантовывают парафином.
Результат: места активности фосфорилазы в срезах обнаруживаются по фиолетово-синему или темно-синему окрашиванию. Если же в срезах ткани присутствует нативный гликоген, то он окрашивается в красно-коричневый цвет, а не в характерный синий, специфичный для вновь образованного полисахарида.
з) выявление аминопептидазы методом азосочетания
Ткани лиофилизированные, залитые в парафин; нефиксированные замороженные ткани. Срезы из замороженной, фиксированной в ацетоне или формалине ткани.
1. Срезы инкубируют в смеси, приготовленной по следующей прописи:
К 1 мл 1% водного раствора \beta - \text{нафтиламида} - \alpha - \text{лейцина} прибавляют 40 мл 0,2 М трис буфера, pH 7,1 (необходимо очень точно соблюдать значение pH буфера). Затем добавляют 30 мг диазотированного o-аминоазотолуола (прочный гранатовый GBC). Смесь встряхивают и фильтруют в сосуд Коплина. Можно растворять около 5 мг лейцильного или аланильного субстратов в дистиллированной воде и буфере. Если используют не соль, а свободное основание, его сначала растворяют в небольшом количестве (примерно 0,25 мл) метанола или диметилформамида.
Время инкубации от нескольких минут до нескольких часов, пока не появится окраска достаточной интенсивности.
2. Затем срезы быстро промывают в проточной воде, переносят в дистиллированную воду и заключают в смесь глицерин-желатина.
Срезы из свежезамороженной нефиксированной ткани и из тканей, фиксированных холодным формалином.
1. После непродолжительного подсушивания на воздухе срезы инкубируют в среде, приготовленной по прописи: растворить 5 мг 3,3-диаминобензидина тетрахлорида (ДАБ) в 9 мл 50 мМ фосфатного буфера (pH 7,4), добавить 1 мл раствора каталазы (20 мг/1 мл), 10 мг цитохрома «c» (тип II, Sigma) и 750 мг сахарозы; срезы инкубируют при комнатной температуре (22 °C) в течение 30 — 60 мин.
2. Быстро промывают в дистиллированной воде.
3. Обезвоживают в спиртах, просветляют в ксилоле и заключают в синтетическую среду.
Результат: в местах активности цитохромоксидазы наблюдается коричневое окрашивание.
Примечание. В случае фиксированного материала в качестве фиксатора используют 4% раствор деполимеризованного параформальдегида, полученного путем растворения его в горячей воде, в которую добавлен 1 № раствор едкого натрия для поддержания нейтрального pH. Перед употреблением pH фиксатора необходимо довести до 7,4.
к, л) методы выявления глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы
Срезы из нефиксированной свежезамороженной ткани слегка подсушивают на воздухе (30 — 60 с).
1. Инкубируют в среде следующего состава:
Глюкозо-6-фосфат натрия 0,1 М - 15 мл НАДФ 0,1 М - 0,3 мл Фосфатный буфер 0,1 М - 9 мл Нитро-СТ - 5 мг Вода дистиллированная - до 30 мл
Инкубацию проводят в термостате при 37 °C 10 — 40 мин. (Время инкубации для каждой ткани подбирается эмпирически).
2. Срезы промывают 1 мин в дистиллированной воде.
3. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости (30°, 50°, 70°, 85°, 96°, 100°) по 5 мин в каждом, затем в смеси абсолютного спирта с ксилолом, двух сменах ксилола и заключают в бальзам.
Результат: выпадение мелкозернистых гранул диформазана соответствует местам локализации фермента. При постановке гистохимической реакции необходим контроль. Для этого срезы инкубируют в среде того же состава за исключением субстрата, вместо которого добавляют соответствующий объем дистиллированной воды. Активность фермента в контрольных препаратах должна отсутствовать.
6-фосфоглюконатдегидрогеназа выявляется также, однако в составе инкубационной среды в качестве субстрата вместо глюкозо-6-фосфата используется бариевая соль 6-фосфоглюконата.
м) метод выявления сукцинатдегидрогеназы
Срезы из свежезамороженной нефиксированной ткани, толщиной 10 — 12 мк.
1. После непродолжительного подсушивания на воздухе срезы инкубируют в среде следующего состава:
Нитро-СТ - 5 мг Фосфатный буфер, pH 7,6; 0,1 М - 15 мл Сукцинат натрия 0,1 М - 15 мл
Инкубацию проводят в термостате при температуре 37 °C в течение 10 — 30 мин до появления интенсивно-синего цвета.
2. По окончании инкубации срезы промывают в течение 1 мин в дистиллированной воде.
3. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости (30°, 50°, 70°, 85°, 96°, 100°), затем в смеси абсолютного спирта с ксилолом, 2-х сменах ксилола и заключают в бальзам.
Результат: выпадение мелкозернистых гранул диформазана соответствует местам локализации фермента.
При постановке реакции на сукцинатдегидрогеназу необходим контроль, для чего срезы инкубируют в той же инкубационной среде, но без добавления субстрата. Контроль должен быть отрицательным.
н) метод выявления лактатдегидрогеназы
Срезы из свежезамороженной нефиксированной ткани, толщиной 10 — 12 мк.
1. После непродолжительного подсушивания на воздухе срезы инкубируют в среде следующего состава:
Лактат натрия 0,1 М - 15 мл Никотинамидадениндинуклеотид (НАД) 0,1 М - 0,3 мл Фосфатный буфер 0,1 М - 9 мл Нитро-СТ - 5 мг Дистиллированная вода - 30 мл
Инкубировать в термостате при 37 °C в течение 20 — 30 мин до появления синего цвета.
По окончании инкубации реакцию останавливают споласкиванием срезов в 10% формалине, приготовленном на физиологическом растворе. Обезвоживают в спиртах восходящей крепости и заключают в бальзам.
Результат: в местах локализации фермента выпадают мелкозернистые гранулы диформазана.
Контроль: инкубирование срезов в среде без добавления субстрата. Контроль должен быть отрицательным.
ИССЛЕДОВАНИЯ БИОПСИЙНОГО И СЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА
Во время аутопсии для гистологического исследования иссекают не менее 10 — 15 кусочков, в том числе из патологически измененных участков и прилежащих тканей (2 — 3) и других органов (головной мозг, сердце, легкое, печень, почка, селезенка, поджелудочная железа, надпочечник и др.).
Для более углубленного изучения патологии отдельных органов и систем при различных заболеваниях можно руководствоваться приводимым ниже перечнем.
| Ткань, орган и его отделы | Количество кусочков | Методики исследования (в соответствии с нумерацией, данной в Приложении I) |
|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 |
1. <a id="p100677"></a>Инфекционные и паразитарные болезни
Острые респираторные вирусные инфекции:
Трахея 3 " Главный бронх 1 " Легкие 10 " Трахео-бронхиальные 2 "
лимфоузлы
Тонкая кишка 4 1
Мазки для бактериоскопии (обнаружение фуксинофильных включений):
из носа 2 17 б
из трахеи 1 17 б
из легких 2 17 б
Острые кишечные инфекции и интоксикации
При всех кишечных инфекциях (холера, брюшной тиф, паратифы, паразиты, острая дизентерия), токсикоинфекциях и пищевых интоксикациях обязательно исследуются:
Кроме того, дополнительно исследуются:
головной и спинной мозг 2 — 4 1 из различных отделов
узел блуждающего нерва 1 1
лучевой и локтевой нервы 2 1
б) при брюшном тифе и паратифах:
костный мозг, грудины, 2 1 бедра
Помимо материала, который необходимо исследовать при всех кишечных инфекциях, производят изучение:
а) узлов солнечного 2 — 3 17 а, 17 б сплетения
б) бактериоскопию мазков 8 — 10 слизи из тонкого кишечника, окрашенных по Граму и карболовым фуксином
Чума, туляремия, Берутся кусочки 17 б сибирская язва из всех органов, увеличенные лимфоузлы, очаги поражения на коже
Берутся кусочки Импрегнация из всех органов, по Морозову для а также очаги выявления телец Пашена поражения в коже, Выявление вируса оспы слизистой оболочке методом люминесценции
носа, глотки,
оболочки головного
мозга, пирамиды
височных костей
(при подозрении
на отит), яичко
а) Стенка каверны и очаги 3 — 4 1, 2 или 3, 5
Ткань легкого на остальном 2 — 3 1, 2 или 3, 5 протяжении
Регионарные лимфоузлы 1 — 2 17 а
Дополнительно исследуется 2 1, 2 или 3, 17 а стенка бронха по линиям операционного разреза
Ткань почки с очагами 3 — 4 1, 2, 17 а
поражения, стенка лоханки В зависимости и мочеточник от количества
доставленного
материала
Лимфатические узлы Каждый кусочек 1, 17 а и др. ткани целиком
При сыпном тифе необходимо исследовать продолговатый мозг, кору головного мозга, миокард, яичко, кожу, конъюнктиву; при бешенстве — аммонов рог (фиксация в ацетоне), продолговатый мозг; при столбняке — спинной мозг, межпозвоночные узлы, поясничные мышцы, прямую мышцу живота, тела позвонков.
При подозрении на сифилис кусочки измененных органов исследуются с использованием дополнительной методики 17 г.
При прочих инфекционных и паразитарных заболеваниях набор дополнительных методик исследования расширяется в соответствии с рекомендациями, данными в специальных руководствах.
| 1 | 2 | 3 |
|---|
Из опухоли 2 2, 5, 6, 20 з, и, м
По линиям операционных разрезов 2 Стенка желудка вне опухоли 2 Сальник 1
Пергигастральные лимфоузлы 2 — 4 5, 6
Граница опухоли и окружающей 1 — 2 6, 20 в, ж, з, м ткани
Ткань железы вне опухоли 1 - 2 Область соска и крупных протоков 1 - 2 Кожа в случае ее поражения 1
Опухоль 1 — 3 2, 6, 11, 20 а, з
Граница опухоли и ткани легкого 1 Ткань легкого на остальном 1 - 2
протяжении
Регионарные лимфоузлы 2 — 3 20 а, з
Из каждой доли 1 — 2 2, 6, 7, 20 м
Диагностические биопсии Исследуются целиком не менее чем в 6 ступенчатых срезах; при подозрении на инвазивный рак изготовляется 10 и более срезов
Конизация 8 кусочков по окружности наружного зева (через область переходной складки и на стыке влагалищной порции и цервикального канала)
Удаленный комплекс женских половых органов
Опухоль 2 — 3 2, 6, 11, 15, 20 а, д
Граница опухоли с неизмененными 1 тканями
Цервикальный канал вне опухоли 1 Тело матки вне опухоли 1 Яичники 2 Трубы 2
Лимфатические узлы параметральной 6, 11, 15 клетчатки
Опухоли мягких тканей 5 — 10 и более 2 или 3, 4, 5, 6, 15, 19, 20 а, б, в, д, з, м
При системных заболеваниях Материал целиком 2 (5, 15, 20 а, б, кроветворной ткани в, г, д, з, к, л)
При метастазах опухолей Материал целиком 2 (5, 6, 11, 15, с невыясненной первичной 19, 20) локализацией
Из других органов и тканей вырезается 2 — 3 кусочка: 1 — 2 кусочка из опухоли, 1 — 2 кусочка из окружающей ткани. При наличии удаленных лимфатических узлов исследуется не менее 2 — 3 лимфоузлов даже при отсутствии в них макроскопических признаков опухоли (см. «Инструкцию по исследованию биопсийного и цитологического материала», утвержденную Минздравом СССР 08.07.1972, М., 1972) с изготовлением с каждого кусочка не менее 2-х срезов.
Для уточнения гистогенеза новообразования при опухолях ряда органов и тканей рекомендуется проводить следующие гистоферментативные реакции: печень - 20 г, д, з; яичко - 20 а; предстательная железа - 20 б. Для выявления энтерохромафинных клеток карциноидов рекомендуется проводить следующие гистохимические реакции: аргентафинная реакция, диазореакция с прочным черным K, ферри-ферроцианидная реакция.
И НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ
Рекомендуется проводить следующие дополнительные окраски и гистохимические реакции:
Гипофиз — комбинация ШИК-реакции и окраски оранжевым «G» по Халми-Дыбану;
Надпочечники — выявление холестерина по Шульцу;
Поджелудочная железа — окраска альдегид-фуксином;
| 1 | 2 | 3 |
|---|
Болезни крови и кроветворных органов
тел позвонков 1 — 2 1
ребер 1 — 2 1
грудины 1 — 2 1
диафиза бедра 2 — 3 1 (толщина кусочков не более 1 см; фиксация в жидкости Ценкер-формол)
Лимфатические узлы 4 — 6 1, 2, 5, 14, 20 а, б, г
Опухолевые разрастания 4 — 6 1, 2, 5
Тонкая кишка 1 1
Толстая кишка 1 1
Вилочковая железа 1 1
Отпечатки костного мозга, 2 — 3 По Романовскому-Гимза печени, селезенки и других очагов поражения
Болезни нервной системы и органов чувств (в патологоанатомических отделениях специализированных лечебных учреждений)
Средняя лобная извилина слева 2 (один из них 1, 3, 12, 18 а, б, в для заморозки)
Средняя лобная извилина справа 1 1, 3, 12
Передняя центральная извилина 2 (один из них 1, 3, 12, 18 а, б, в справа для заморозки)
Задняя центральная извилина 1 1, 3, 12 слева
Задняя центральная извилина 1 1, 3, 12, 18 а, б, в справа
Средняя височная извилина слева 1 " Средняя височная извилина справа 1 " Затылочный полюс слева 1 " Затылочный полюс справа 1 "
Подкорковые узлы справа 1 1, 3, 12, 18
Подкорковые узлы слева 2 (один из них 1, 3, 12, 18 а, б, в для заморозки)
Зрительный бугор слева 1 1, 3, 12, 18
Зрительный бугор справа 1 " Средний мозг (верхний отдел) 1 " Варолиев мост (нижний отдел) 1 "
Продолговатый мозг (средний 2 (один из них 1, 3, 12, 18 а, б, в отдел) для заморозки)
Продолговатый мозг 1 1, 3, 12, 18 (нижний отдел)
Левое полушарие мозжечка 1 « (участок с зубчатым ядром)»
3 — 5 шейные сегменты 3 (один из них 1, 3, 12, 18 а, б, в для заморозки)
4 - 5 грудные сегменты 2 " 8 - 9 грудные сегменты 2 " 4 - 5 поясничные сегменты 2 "
В случаях смерти с подозрением на вирусный, протозойный энцефалит или миелит исследуется минимум 13 кусочков; на полиомиелит — не менее 9 кусочков с разных уровней спинного мозга; на полирадикулоневрит и спинную сухотку — межпозвоночные узлы, передние и задние корешки на разных уровнях (5 — 8).
| 1 | 2 | 3 |
|---|
Глаз (с прилежащими тканями) Разделяется парал- 1, 2, 5
Глазное яблоко лельными разрезами на 3 блока. С централь- ного блока изготов- ляется 200 — 300 серийных срезов, из которых окрашивается каждый десятый. С 2-х остальных блоков — по 2 — 3 среза (при опухолях количество срезов увеличивается)
Придаточный аппарат глаза 1 — 2 1, 2
Прилежащие участки кожи 1 — 2 1, 2
Болезни системы кровообращения
Очаг поражения и пограничные зоны 2 — 3 1 (2 или 3, 4, 5, 6, 15)
Верхушка сердца 1 1
Межжелудочковая перегородка 1 1
Передне-боковая стенка левого 1 1 желудочка
Стенка правого желудочка 1 1
Сосочковая мышца 1 1
Измененные клапаны со стенкой сердца 1 1, 2 или 3, 6
Левое предсердие 1 1
Правое предсердие 1 1
Передняя межжелудочковая 1 1, 2 или 3, 15
Левая огибающая 1 " Правая 1 " Аорта (над клапаном) 1 " Другие артерии 2 "
Из пораженных и непораженных Не менее 5 из 1, 3, 5, 8, 17 отделов каждого легкого
Регионарные лимфоузлы 1 — 2 1
Гортань 1 — 2 1
Трахея 1 1
Главный бронх 2 1
Прицельная аспирационная биопсия 1 1, 2, 6
Операционная биопсия 2 — 3 1, 2
Прицельная аспирационная биопсия 1 1, 2, 5, 6, 14
Операционная биопсия 3 — 4 1, 2, 5, 6
Прицельная аспирационная биопсия 1 1, 6
Операционная биопсия 4 1, 2, 6
Червеобразный отросток 1 1
Секционный материал По 1 кусочку 1, 2 или 3, 15 с поверхности и из глубины органа, при необходимости из всех долей
Биопсийный материал Целиком 1, 2 или 3, 5, 6, 8, 15
Из каждой почки берутся следующие отделы
Корковый и мозговой слои 2 1, 3 или 2, 6, 7, 15
Лоханка с частью мозгового слоя 2
Мочеточник 1 — 2 1
Мочевой пузырь 1 1
Пункционная биопсия 1 1, 2 или 3, 5, 6, 15, 19
Операционная биопсия — исследуется по тем же правилам, что и секционный материал (см. выше)
Новорожденные и мертворожденные
Пупочные сосуды (артерии и вена) 2 1 с прилежащими тканями
Плацента 1 1
Пуповина 1 1
Оболочки плаценты 1 1
Слюнные железы 1 1
Болезни соединительной ткани с иммунными нарушениями
пораженные клапаны 2 1, 2 или 3, 6, 15
стенка левого желудочка 1 « и перегородка»
Артерии пораженных органов 2 - 4 " Скелетная мышца 1 "
Кожа из пораженных участков 1 «»
Скелетные мышцы (конечностей, 2 1 межреберные)
При проведении патологогистологических исследований биопсийного и секционного материала рекомендуется изучать не менее двух срезов с каждого блока.
Все заключения, основанные на данных срочного гистологического исследования, требуют подтверждения после заливки оставшегося диагностического и операционного материала в целлоидин или парафин с изготовлением достаточного количества срезов.
Изучая ткани, органы и системы при заболеваниях, не упомянутых в настоящей инструкции, а также при исследовании секционных и биопсийных наблюдений, трудных для диагностики и подлежащих разбору на клинико-анатомической конференции, патологоанатом может по своему усмотрению расширить объем применяемых гистологических и гистохимических методик в соответствии с рекомендациями специальной литературы, отражающими современное состояние проблемы. В частности, при исследовании пункционной биопсии почки для постановки точного нозологического диагноза нефрита необходимо применить иммуноморфологические методы и электронную микроскопию.
При гистологическом исследовании биописийного и секционного материала каждому взятому кусочку присваивается отдельный регистрационный номер. В тех случаях, когда обработка срезов с одного и того же кусочка требует дополнительных затрат времени и в связи с трудоемкостью методик (гистоэнзиматических, иммуноморфологических) этим срезам присваивается отдельный регистрационный номер.