Инфекционная анемия. Инструкция по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП)
Актуально на 10.11.2026.
Как цитировать: "Инфекционная анемия. Инструкция по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП)". https://bukva.ai/docs/infektsionnaya-anemiya-instruktsiya-po
(утв. Минсельхозом России, Россельхознадзором 24.03.2009)
Примечание
Взамен Наставлений по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации № 13-5-02/0894 от 27.01.2004, утв. Минсельхозом России.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ В РЕАКЦИИ ДИФФУЗИОННОЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РДП)
Инструкция разработана ФГУ «ВИЭВ» и ФГУП «Щелковский биокомбинат». 141142, Московская обл., Щелковский район, п. Биокомбината, ФГУП «Щелковский биокомбинат».
Набор рекомендован к регистрации ФГУ «ВГНКИ». Регистрационный номер ПВР-1-2.3/01289.
С утверждением настоящей инструкции прекращает действие на территории России наставление по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации за № 13-5-02/0894 от 27.01.2004, утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.
Адрес предприятия-изготовителя: 141142, Московская область, Щелковский район, п. Биокомбината. Коммерческая служба: (495) 225-18-16, тел./факс МО (256) 3-23-48, регион (496-56) 3-23-48.
I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
1. Набор для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП).
2. Набор рассчитан на исследование 90 ... 120 проб сывороток крови.
3. Препараты, входящие в состав набора (антиген, антисыворотка, кислота борная, раствор натрия гидроокиси, агар «Дифко») расфасованы во флаконы вместимостью 10 см3, укупорены пробками, укрепленными алюминиевыми колпачками.
4. На каждый флакон с препаратами наклеена этикетка с указанием наименования препарата, его количества в объемных единицах, количества доз антигена и антисыворотки, объема растворителя, вносимого во флакон с антигеном и антисывороткой, необходимого для приготовления рабочего разведения, номера серии и срока годности.
5. Флаконы с препаратами, входящими в состав набора, уложены в картонные коробки с разделительными перегородками. В каждую коробку вложена инструкция по применению набора.
6. На коробке с флаконами наклеена этикетка, на которой должны быть указаны наименование предприятия-изготовителя, его товарный знак, полное наименование набора, номер серии и номер контроля, количество флаконов каждого препарата в коробке, количество препарата в объемных единицах и количество доз препарата во флаконе (для антигена и антисыворотки), дата изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение нормативного документа и надпись «Для животных».
7. Флаконы с препаратами без этикеток, с трещинами, нарушенной укупоркой, содержащие посторонние примеси, хлопья, с истекшим сроком годности выбраковывают и обезвреживают кипячением в течение 15 мин.
8. Срок годности набора — 2 года с даты изготовления при хранении в сухом темном месте при температуре от 4 °C до 8 °C.
II. ПРИНЦИП МЕТОДА
9. Антиген (экстракт гомогената селезенки) содержит внутренний структурный белок вируса с молекулярной массой g 26. Он относится к так называемым растворимым антигенам, способным диффундировать в агаровом геле. Является общим (группоспецифическим антигеном) для всех штаммов вируса ИНАН.
10. Принцип метода основан на встречной диффузии антител (иммунной сыворотки) и растворимого антигена в агаровом геле. При наличии в исследуемой сыворотке антител, гомологичных антигену, образуется полоса преципитации.
11. Набор применяют для лабораторной диагностики инфекционной анемии лошадей с целью обнаружения специфических антител в сыворотках крови лошадей, больных инфекционной анемией.
12. Специфические антитела появляются в крови животных через 2 ... 6 недель после инфицирования и сохраняются на протяжении длительного времени (более 7 лет).
III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ НАБОРА
13. Набор применяют для исследования сывороток крови лошадей на выявление антител к вирусу инфекционной анемии при остром, хроническом и латентном течении болезни. Набор рассчитан на исследование 90 ... 120 проб сывороток крови.
14. Антиген и антисыворотка, имеющиеся в наборе, используются в качестве тест-системы «антиген-антитело» при постановке реакции.
15. Перед постановкой реакции сухие антиген и антисыворотку растворяют дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке (приготовленные разведения являются рабочими разведениями). Антиген и сыворотка должны полностью раствориться в течение 3 ... 5 мин без образования не разбивающихся при встряхивании хлопьев.
Антиген и антисыворотку, неиспользованные в день растворения, сохраняют в замороженном состоянии при температуре -10 °C до повторного исследования. Повторное замораживание сыворотки не допускается.
16. Испытуемые сыворотки в количестве не менее 5 ... 6 см3 получают от исследуемых лошадей. Их консервируют путем добавления антибиотиков: пенициллина и стрептомицина — по 1000 ЕД/мл и хранят при температуре 4 ... 8 °C в течение 10 сут. Сыворотки без консерванта сохраняют в замороженном состоянии.
17. Для приготовления 1% геля агара «Дифко» в стеклянную колбу вместимостью 250 ... 300 см3 отмеряют 140 см3 дистиллированной воды, затем в нее последовательно вносят борную кислоту и раствор гидроокиси натрия 3%. Содержимое колбы перемешивают до полного растворения борной кислоты. Проверяют pH буфера. Буфер должен иметь pH в пределах 8,6 +/- 0,1.
В приготовленный боратный буфер вносят агар «Дифко» — 1,5 г. Колбу ставят на баню с водой, воду доводят до кипения и выдерживают на бане до полного расплавления агара. В чашки Петри диаметром 15 см вносят 15 см3 расплавленного агара, предварительно охладив его до 60 °C. Чашки оставляют на один час с приоткрытыми крышками и дают агару застыть.
18. Контроль качества агара проводят визуально, после его застывания. Слой агара должен быть ровным по всей поверхности чашки, без пузырьков газа. Толщина слоя 3 мм.
После застывания агара приступают к вырезанию лунок. Для этого используют специально подготовленные пробойники из 7 жестко закрепленных трубочек диаметром 7 мм — одна в центре и 6 по окружности на расстоянии 3 мм от центральной и друг от друга (см. приложение, рис. 13). Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой. Если в лунках накапливается влага, то ее перед внесением реагентов отсасывают пипеткой.
Используют 2 схемы заполнения лунок. Первая — в центральную лунку вносят микропипеткой 0,05 ... 0,06 мл антигена, в три периферические лунки, через одну, закапывают по 0,05 ... 0,06 мл антисыворотку в рабочих разведениях (п. 3.2). Оставшиеся 3 свободные лунки заполняют с помощью тонко оттянутой пастеровской пипетки исследуемыми сыворотками. При этом в одной чашке исследуются 12 проб сыворотки (см. приложение, рис. 14).
20. В случае проведения массовых исследований может быть использована вторая схема заполнения лунок, которая позволяет в одной чашке одновременно исследовать 16 проб. В центральную лунку вносят антиген; в две периферические, диаметрально противоположные лунки вносят антисыворотку и в оставшиеся 4 — испытуемые сыворотки (см. приложение, рис. 15). Для каждой пробы сыворотки используют отдельную пастеровскую пипетку.
После заполнения лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру при температуре 18 ... 25°C.
Реакцию учитывают через 48 ... 72 ч. Чашки просматривают на темном фоне в косо направленном пучке света. Для этой цели используют осветитель ОИ-19 или другой аналогичный прибор.
Оценку реакции делают по контрольной линии преципитации — линии преципитации между контрольными антигеном и антисывороткой. Если она отсутствует или слабо выражена, то исследование необходимо повторить. Контрольные линии преципитации должны быть четкими, располагаться посередине между лунками с антигеном и сывороткой.
22. Существенный сдвиг контрольных линий преципитации в сторону антигена или сыворотки, а также слабо выраженные контрольные линии являются показателем слабой активности одного или обоих компонентов набора. В этом случае проводят подтитровку антигена и антисыворотки. Для этого сухой препарат, антиген или антисыворотку, растворяют в два раза меньшем объеме дистиллированной воды, затем готовят разведения 1:1,25; 1:1,5, 1:1,75 и проверяют в РДП. За рабочее разведение принимают то разведение диагностикума, которое дает четкие линии преципитации, расположенные посередине между лунками с антигеном и антисывороткой.
23. Оценка результатов реакции
Отрицательная — контрольные линии продолжаются в сторону лунки с испытуемой сывороткой без изгибов или с небольшим изгибом в сторону контрольной сыворотки (см. приложение, рис. 15, лунка 3).
а) между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном образуется полоса преципитации, которая соединяется с контрольной линией (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 1);
б) линия преципитации отсутствует, но контрольные линии образуют вблизи с испытуемой сывороткой изгиб, направленный в сторону антигена, — слабоположительная сыворотка (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 2);
в) контрольные линии укорачиваются со стороны лунки с испытуемой сывороткой, в отдельных случаях контрольные линии полностью растворяются, что свидетельствует о высоком титре антител (см. приложение, рис. 14 и 15, лунка 6).
Более различимые линии преципитации будут образовываться, если эти пробы развести 1:4 или 1:8 и повторить реакцию.
Сомнительная реакция — слабый изгиб контрольной линии плохо просматривается; образуются интенсивные неспецифические линии или ореол вокруг лунок, что затрудняет учет реакции.
От животных, давших сомнительную реакцию, через 2 ... 3 недели берут кровь и исследование повторяют.
Пробы сыворотки, давшие при повторном исследовании отрицательный результат, считают отрицательными.
При получении повторной сомнительной реакции результат считают положительным.
Неспецифическая преципитация образуется с некоторыми пробами сыворотки, особенно полученными от старых лошадей. Признаком неспецифической реакции является перекрещивание линий преципитации с контрольными линиями (см. приложение, рис. 14 и 15, лунки 5 и 4).
В одной и той же пробе сыворотки могут быть специфические и неспецифические антитела.
24. При образовании вокруг лунок интенсивного ореола, затрудняющего учет реакции, эти пробы сыворотки исследуют повторно, добавив к агару 5% хлористого натрия. Для этого к 150 мл боратного буфера добавляют 7,5 г химически чистого хлористого натрия.
25. Жеребят, полученных от положительно реагирующих в реакции РДП кобыл, исследуют после отъема в возрасте 6 ... 8 мес.
26. Результаты учета реакции регистрируют в специальных журналах, которые должны быть прошнурованы, пронумерованы и скреплены печатью.
IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ
27. При работе с препаратами, входящими в состав набора, следует соблюдать общие правила личной гигиены и техники безопасности, предусмотренные при работе с ветеринарными препаратами. При попадании на открытые участки тела или слизистые оболочки глаз, рта, носа и после окончания работы руки и другие открытые участки тела моют водой с мылом.
28. Набор следует хранить в местах, не доступных для детей.
ПРИЛОЖЕНИЕ к инструкции по применению набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП)
Рис. 13 Трафарет для размещения лунок в РДП
Рис. 14 Схема заполнения лунок для одновременного исследования на одной чашке Петри 12 проб сыворотки
Рис. 15 Схема заполнения лунок для одновременного исследования на одной чашке Петри 16 проб сыворотки
Условные обозначения: A — лунки с антигеном; C — лунки с контрольными антисыворотками; 1, 2, 3, 4, 5, 6 — лунки с испытуемыми сыворотками.