ГОСТ Р ИСО 21527-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод подсчета дрожжевых и плесневых грибов. Часть 1. Методика подсчета колоний в продуктах, активность воды в которых больше 0,95

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2010 № 656-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р ИСО 21527-1-2010"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-21527-1-2010" "ГОСТ Р ИСО 21527-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод подсчета дрожжевых и плесневых грибов. Часть 1... "
  n1["ГОСТ ISO 21527-1-2013"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-iso-21527-1-2013" "ГОСТ ISO 21527-1-2013. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Метод подсчета дрожжевых и плесневых грибов. Часть 1. Методика подсчета к"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 30 ноября 2010 г. № 656-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ И КОРМОВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ. МЕТОД ПОДСЧЕТА ДРОЖЖЕВЫХ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ

ЧАСТЬ 1

МЕТОДИКА ПОДСЧЕТА КОЛОНИЙ В ПРОДУКТАХ, АКТИВНОСТЬ ВОДЫ В КОТОРЫХ БОЛЬШЕ 0,95

ISO 21527-1:2008 Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds Part 1. Colony count technique in products with water activity greater than 0,95

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Подготовлен ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. № 656-ст.

4. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 21527-1:2008 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета дрожжевых и плесневых грибов. Часть 1. Методика подсчета колоний в продуктах, активность воды в которых больше 0,95» (ISO 21527-1:2008 «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds — Part 1: Colony count technique in products with water activity greater than 0,95»).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2004 (пункт 3.5).

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Предупреждение: подсчет плесневых грибов следует проводить с большой осторожностью для обеспечения защиты оператора и предотвращения загрязнения атмосферы плесневыми спорами.

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт устанавливает горизонтальный метод для определения количества жизнеспособных дрожжевых и плесневых грибов в продуктах с активностью воды больше 95%, предназначенных для потребления человеком или для кормления животных [яйца, мясо, порошковые продукты (кроме сухого молока), фрукты, овощи, свежая паста и др.], посредством подсчета колоний при (25 +/- 1) °C [1], [2].

Настоящий стандарт не устанавливает подсчет спор плесневых грибов. Идентификация грибковой флоры и испытание пищевых продуктов на микотоксины не относятся к области применения настоящего стандарта. Метод, установленный в настоящем стандарте, не пригоден для подсчета теплостойких грибов, таких как Byssochlamys fulva или Byssochlamys nivea, в консервированных фруктах и овощах в банках или бутылках.

2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ИСО 6887-1:1999 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила приготовления исходной суспензии и десятичных разведений

ИСО 6887-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 2. Специальные правила для приготовления мяса и мясных продуктов

ИСО 6887-3:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 3. Специальные правила для приготовления рыбы и рыбных продуктов

ИСО 6887-4:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Приготовление проб для испытаний, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 4. Специальные правила для приготовления продуктов, кроме молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов и рыбы и рыбопродуктов.

ИСО 7218:2007 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ИСО 8261:2001 <*> Молоко и молочные продукты. Общие правила приготовления испытуемых проб, исходных суспензий и десятичных разведений для микробиологических исследований

<*> Заменен на ИСО 6885-5:2010.

ИСО/ТС 11133-1:2000 <*> Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 1. Общие правила по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории

<*> Заменен на ИСО/ТС 11133-1:2009.

ИСО/ТС 11133-2:2003 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Правила приготовления и производства питательных сред. Часть 2. Практическое руководство по определению эффективности питательных сред

3. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

Примечание. Некоторые промежуточные формы и различия между дрожжевым грибом (3.1) и плесневым грибом (3.2) могут быть произвольными.

3.1. Дрожжевой гриб (yeast): мезофильный аэробный микроорганизм, который при температуре 25 °C в условиях, описанных в настоящем стандарте, образует на поверхности микологической агаровой среды матовые или блестящие округлые колонии (3.4), обычно имеющие ровные очертания либо более или менее выпуклую поверхность.

Примечание. Дрожжевые грибы внутри среды, а не на поверхности образуют круглые, чечевицеобразные колонии.

3.2. Плесневый гриб (mould): мезофильный аэробный нитевидный микроорганизм, который на поверхности микологической агаровой среды в условиях, описанных в настоящем стандарте, обычно образует гладкие или ворсистые раскидистые пропагулы/зародыши (3.3) или колонии (3.4), часто с окрашенными плодоносными или спороносными структурами.

Примечание. Плесневые грибы внутри среды, а не на поверхности образуют круглые чечевицеобразные колонии.

3.3. Пропагула (росток)/зародыш (propagule/germ): жизнеспособный организм, растущий в питательной среде.

Пример. Вегетативная клетка, группа клеток, спора, скопление спор или часть мицелия (грибницы).

[ИСО 6107-6:2004, 65]

3.4. Колония (colony): локализованное видимое скопление микробной массы, образованное на или в твердой питательной среде из жизнеспособной частицы.

[ИСО 6107-6:2004, 15]

4. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

4.1. Приготовляют поверхностно-инокулированные пластины, используя установленную селективную культуральную (питательную) среду. В зависимости от ожидаемого числа колоний используют заданное число пробы (если продукт жидкий) или исходной суспензии (в случае других продуктов), или десятикратных разведений пробы/суспензии.

Дополнительные пластины приготовляют при тех же условиях, используя десятикратные разведения испытательного образца или исходной суспензии.

4.2. Затем пластины аэробно инкубируют при (25 +/- 1) °C в течение пяти дней. При необходимости пластины выдерживают при дневном рассеянном свете в течение одного-двух дней.

4.3. Затем колонии/пропагулы подсчитывают и, если необходимо (чтобы различать колонии дрожжевых грибов от бактериальных колоний), идентичность любых сомнительных колоний подтверждают посредством исследования с помощью бинокулярной лупы или микроскопа.

4.4. Число дрожжевых или плесневых грибов на грамм или см3 пробы рассчитывают из числа колоний/пропагул/зародышей, полученных на пластинах при уровнях разбавления, дающих исчисляемые колонии. При необходимости плесневые и дрожжевые грибы подсчитывают по отдельности.

5. ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА И РАЗБАВИТЕЛЬ

Приготовление десятичных разбавителей на основе испытуемой пробы — по ИСО 6887 (все части) и ИСО 8261.

5.1 Разбавитель

5.1.1 Общие вопросы

Качество подготовки, изготовления и оценки эффективности питательных сред для выращивания дрожжевых или плесневых грибов — по ИСО/ТС 11133-1 и ИСО/ТС 11133-2 или конкретному международному стандарту на исследуемый продукт.

Примечание. К разбавителям можно добавить поверхностно-активные агенты, например, натрий поли(оксиэтилен)сорбатианмоноолеат [0,05% (массовая концентрация)] для уменьшения скопления плесневых спор и конидий [2].

Помимо специального приготовления испытуемого образца, рекомендуется использовать в качестве разбавителя 0,1%-ную пептонную воду (массовая концентрация) с питательным бульоном.

5.1.2 Состав 0,1%-ной пептонной воды (массовая концентрация) с питательным бульоном

5.1.3 Приготовление 0,1%-ной пептонной воды (массовая концентрация) с питательным бульоном

Растворяют компоненты в воде, при необходимости производя нагрев. При необходимости регулируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен 7,0 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

5.2 Питательная среда

5.2.1 Агар с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфениколом (DRBC) [3], [4]

5.2.1.1 Состав

5.2.1.2 Приготовление

5.2.1.2.1 Общие вопросы

Суспендируют в воде все ингредиенты, кроме хлорамфеникола, и доводят до кипения для полного растворения. При необходимости регулируют pH так, чтобы после стерилизации он был равен 5,6 +/- 0,2 при температуре 25 °C.

Добавляют 10 см3 1%-ного раствора хлорамфеникола (массовая концентрация) в этаноле и перемешивают. Распределяют среду в большом количестве в удобные контейнеры (6.5) подходящей емкости. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин.

Затем среду немедленно охлаждают в водяной бане (6.3), поддерживаемой при температуре от 44 °C до 47 °C. Охлаждают до температуры ниже 50 °C и распределяют в объеме по 15 см3 в стерильные чашки Петри (6.6).

Оставляют среду до затвердевания и, при необходимости, сушат поверхность чашек, как описано в ИСО 7218 и ИСО/ТС 11133-1 и ИСО/ТС 11133-2.

Среды используют немедленно или хранят в темноте согласно ИСО/ТС 11133-1 и ИСО/ТС 11133-2.

Предупреждение: следует избегать воздействия света на среду, поскольку в результате недооценки микофлоры в образцах могут быть образованы цитотоксические продукты распада.

5.2.1.2.2 Факультативное добавление гидрохлорида хлортетрациклина

Если возникают сложности из-за чрезмерного бактериального роста (например, при использовании сырого мяса), рекомендуется использовать хлорамфеникол (50 мг/дм3) и хлортетрациклин (50 мг/дм3). В этом случае приготовляют среду, как описано выше, только с использованием 50 мг хлорамфеникола, распределяют ее в объеме по 100 см3 и стерилизуют. Готовят также раствор 0,1%-ного гидрохлорида хлортетрациклина (массовая концентрация) в воде (будучи относительно неустойчивым в растворе, он должен быть свежеприготовленным) и стерилизуют фильтрацией. Непосредственно перед использованием добавляют 5 см3 этого раствора асептически к 100 см3 основной среды и разливают в чашки. Использование гентамицина не рекомендуется, так как согласно представленным данным он вызывает ингибирование некоторых видов дрожжевых грибов.

5.2.1.2.3 Факультативное добавление микроэлементов

Для идентификации плесневых грибов на среде DRBC перед обработкой в автоклаве добавляют раствор следующих микроэлементов в объеме 1 см3 на литр среды: ZnSO_{4}·7H_{2}O — 1 г; CuSO_{4}·5H_{2}O — 0,5 г; вода дистиллированная или деионизированная — 100 см3 ([1]).

5.2.1.2.4 Факультативное добавление тергитола

Для предотвращения чрезмерного роста микроорганизма Mucoraceae на агаровых пластинах рекомендуется добавление к культуральной среде тергитола (1 см3/дм3).

5.2.1.3 Испытание рабочих характеристик для гарантии качества питательной среды

5.2.1.3.1 Общие вопросы

DRBC является твердой средой. Продуктивность и селективность — по ИСО/ТУ 11133 (все части) со следующими техническими и условиями:

5.2.1.3.2 Продуктивность

Инкубация:

5 дней при (25 +/- 1) °C.

Штаммы:

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763,

Candida albicans ATCC 10231,

Aspergillus niger ATCC 16404,

Mucor racemosus ATCC 42647

или штаммы, зарегистрированные как эквивалентные в других грибковых семействах.

Эталонные среды:

партия сред SDA (декстрозный агар Сабуро), уже валидированных.

Контрольный метод:

количественный.

Критерии:

коэффициент продуктивности, P_{R} \geq 0,5 .

Характеристическая реакция:

характеристические колонии/пропагулы/зародыши согласно каждому виду.

5.2.1.3.3 Селективность

Инкубация:

5 дней при (25 +/- 1) °C.

Штаммы:

Escherichia coli ATCC 25922 или

Bacillus subtilis ATCC 6633,

или штаммы, зарегистрированные как эквивалентные в других бактериальных семействах.

Контрольный метод:

качественный.

Критерии:

полное ингибирование.

6. ОБОРУДОВАНИЕ И СТЕКЛЯННАЯ ПОСУДА

Одноразовая аппаратура является приемлемой альтернативой стеклянной посуде многоразового использования, если она обладает подходящими техническими характеристиками. Используют следующее обычное микробиологическое оборудование:

6.1 Термостат, способный поддерживать температуру (25 +/- 1) °C.

6.2. Мерные пипетки, стерильные, вместимостью 1 см3, и градуированные с ценой деления 0,1 см3.

6.3. Водяная баня или аналогичная аппаратура, способная поддерживать температуру от 44 °C до 47 °C.

6.4. pH-метр, с точностью измерения до 0,1 единицы pH при 25 °C.

6.5. Бутылки, колбы и пробирки для кипячения и хранения питательной среды и для приготовления разведений.

6.6. Чашки Петри, стерильные, стеклянные или пластмассовые, диаметром от 90 до 100 мм.

6.7. Микроскоп для отличия дрожжевых грибов от бактериальных клеток (область увеличения от 250 до 1000 раз).

6.8. Шпатели, сделанные из стекла или пластика (диаметром меньше 2 мм и длиной 80 мм). Диаметр не должен превышать 2 мм, чтобы минимизировать количество образца, прилипающего к шпателям в конце процедуры его распределения.

6.9. Бинокулярная лупа для различения и дифференцирования колоний/клеток дрожжевых и плесневых грибов (увеличение от 6,5 до 50 раз).

7. ОТБОР ПРОБ

В лабораторию следует отправлять представительную пробу. Она не должна быть повреждена или изменена во время транспортирования или хранения. Лабораторную пробу не замораживают.

Отбор проб не является частью метода, установленного настоящим стандартом. Отбор проб следует проводить согласно стандарту на проверяемый продукт. Если не существует стандарта на проверяемый продукт, заинтересованным сторонам рекомендуется достичь соглашения по этому вопросу.

8. ПОДГОТОВКА ПРОБ ДЛЯ ИСПЫТАНИЯ

Образец для испытания приготовляют согласно ИСО 6887 (все части), ИСО 7218, ИСО 8261 и стандарту на проверяемый продукт. Если не существует стандарта на проверяемый продукт, заинтересованным сторонам рекомендуется достичь соглашения по этому вопросу.

9. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ИСПЫТАНИЯ

9.1 Навеска, исходная суспензия и разведения.

Приготовляют навеску, исходную суспензию (первичную суспензию) и последующие разведения согласно ИСО 6887 (все части), ИСО 7218, ИСО 8261 и стандарту на проверяемый продукт.

Помимо специального приготовления испытательного образца рекомендуется использовать в качестве растворителя 0,1%-ную пептонную воду с питательным бульоном (5.1.3). Использование перистальтического гомогенизатора предпочтительнее смесителя или шейкера.

По причине быстрого осаждения спор в пипетке (6.2) ее следует держать в горизонтальном (не вертикальном!) положении при заполнении соответствующим объемом исходной суспензии и разведений.

Встряхивают исходную суспензию и разведения для избежания осаждения частиц, содержащих микроорганизмы.

9.2 Инокуляция и инкубация

9.2.1. На одну агаровую пластинку с DRBC (5.2.1) переносят с помощью стерильной пипетки (6.2) 0,1 см3 испытательного образца, если это жидкость, или 0,1 см3 исходной суспензии — в случае других продуктов (раздел 8).

На вторую агаровую пластинку с DRBC переносят с помощью новой стерильной пипетки 0,1 см3 первого десятикратного (10^{- 1}) разведения (жидкий продукт) или 0,1 см3 разведения 10^{- 2} (другие продукты).

Для облегчения подсчета низких популяций дрожжевых и плесневых грибов объемы, вплоть до 0,3 см3 разведения 10^{- 1} пробы или испытательного образца, в случае жидкости можно нанести на три пластинки.

Эти операции повторяют с последующими разведениями, используя новую стерильную пипетку для каждого десятикратного разведения.

Примечание. Если предполагается присутствие быстрорастущих плесневых грибов, следует использовать ИСО 21527-2 [6].

9.2.2. Жидкость распределяют по поверхности агаровой пластинки стерильным шпателем (6.8) до тех пор, пока она не будет полностью абсорбирована в среду.

Для инокуляции пластинок можно также использовать наливной метод, но в этом случае эквивалентность результатов должна быть валидирована при сравнении с поверхностной инокуляцией, и различение и дифференцирование плесневых и дрожжевых грибов неприемлемы. Метод нанесения на поверхность может дать более высокие результаты подсчета. Поверхностный метод обеспечивает максимальное воздействие атмосферного кислорода на клетки и предотвращает риск тепловой инактивации грибных пропагул. Результаты могут зависеть от типа грибов.

9.2.3. Приготовленные пластинки (9.2.2) инкубируют аэробно, с крышками наверху, в прямом положении в инкубаторе (6.1) при (25 +/- 1) °C в течение пяти дней. При необходимости агаровые пластинки выдерживают на рассеянном свете от одного до двух дней.

Рекомендуется инкубировать чашки (6.6) в открытом пластмассовом пакете во избежание загрязнения инкубатора в случае разрастания плесневых грибов из чашек.

9.3 Подсчет и отбор колоний для подтверждения

Считывают пластинки в промежутке от двух до пяти дней инкубации. Отбирают чашки (9.2.3), содержащие меньше 150 колоний/пропагул/зародышей, и подсчитывают эти колонии/пропагулы/зародыши. Если возникают трудности из-за быстрорастущих плесневых грибов, подсчитывают колонии/пропагулы/зародыши через два дня и снова через пять дней инкубации.

Примечания. 1. Методы подсчета дрожжевых и особенно плесневых грибов не являются точными, потому что они состоят из смеси мицелия и спор бесполого и полового размножения. Количества колониеобразующих единиц зависят от степени фрагментации мицелий и соотношения спор, способных расти на питательной среде.

2. Часто имеет место нелинейность подсчетов при инокуляции с использованием разведений, т.е. 10-кратные разведения часто не дают 10-кратного уменьшения количества колоний, полученных на питательной среде. Это относят за счет фрагментации мицелия и разрыва скоплений спор во время разведения, помимо конкурентного ингибирования, когда на пластинах вырастает большое число колоний.

Предупреждение: споры плесневых грибов рассеиваются в воздухе с большой легкостью, поэтому при работе с чашками Петри следует соблюдать осторожность во избежание развития сателлитных колоний, которые дают завышенную оценку популяции в образце.

При необходимости проводят исследование с помощью бинокулярной лупы (6.9) или микроскопа (6.7) для различения клеток дрожжевых или плесневых грибов и бактерий от колоний.

Подсчитывают колонии дрожжевых грибов и колонии/пропагулы плесневых грибов по отдельности, если необходимо.

Для идентификации дрожжевых и плесневых грибов отделяют области грибного роста и удаляют для высокоэффективного микроскопического анализа или инокулируют на подходящую разделительную или идентификационную среду.

10. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

См. ИСО 7218.

При необходимости регистрируют колонии дрожжевых грибов и колонии/пропагулы плесневых грибов отдельно.

11. ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЯ

Протокол испытания должен включать в себя, как минимум:

a) информацию, необходимую для полной идентификации образца;

b) используемый метод приготовления образцов (если известен);

c) используемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;

d) все рабочие подробности, не установленные в настоящем стандарте или факультативные, вместе с подробностями любых инцидентов, которые могли бы повлиять на результаты испытания;

e) полученные результаты испытания.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Bell, C., Neaves, P., Williams, A.P. Food microbiology and laboratory practice. Blackwell, Oxford, 2005. 324 p.

2. Beuchat, L.R. Media for detecting and enumerating yeasts and moulds. In: Corry, J.E.L., Curtis, G.D.W., Baird, R.M., editors. Handbook of culture media for food microbiology, pp. 369-386. Elsevier, Amsterdam,

2003. (Progress in industrial microbiology, Vol 37)

3. Beuchat, L.R., Frдndberg , E., Deak, Т., Alzamora, S.M., Chen, J., Guerrero, A.S., Lo\prime pez -Malo, A., Ohlsson, I., Olsen, M., Peinado, J.M., Schnurer, J., de Siloniz, M.I., Tornai-Lehoczki, J. (2001) Performance of mycological media in enumerating desiccated food spoilage yeasts: An interlaboratory study. Int. J. Food Microbiol. 2001, 70, pp. 89-96

4. King Jr, A.D., Hocking, A.D., Pitt, J.I. (1979) Dichloran-rose bengal medium for enumeration and isolation of molds from foods. Appl. Environ. Microbiol. 1979, 37, pp. 959-964

5. ISO 6107-6:2004 Water quality — Vocabulary Part 6

6. ISO 21527-2 Microbiology of food and animal feedings stuffs -

   Horizontal  method  for the enumeration of yeasts and moulds - Part 2:
   Colony  count  technique  in  products  with  water activity less than

or equal to 0,95

------------------------------------------------------------------