ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни

(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 23.11.2010 № 499-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-20776-1-2010" "ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности..."
  n1["ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-iso-20776-1-2022" "ГОСТ Р ИСО 20776-1-2022. Национальный стандарт Российской Федерации. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для... (утв. и"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 23 ноября 2010 г. № 499-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КЛИНИЧЕСКИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ IN VITRO. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ИНФЕКЦИОННЫХ АГЕНТОВ И ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ИЗДЕЛИЙ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИМИКРОБНЫМ СРЕДСТВАМ

ЧАСТЬ 1

РЕФЕРЕНТНЫЙ МЕТОД ЛАБОРАТОРНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИМИКРОБНЫХ АГЕНТОВ ПРОТИВ БЫСТРОРАСТУЩИХ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems. Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices. Part 1. Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases

ISO 20776-1:2006 Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases (IDT)

ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

1. Подготовлен Лабораторией проблем клинико-лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» на основе собственного аутентичного перевода на русский язык стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 380 «Медицинские изделия для диагностики in vitro».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии Российской Федерации от 23 ноября 2010 г. № 499-ст.

4. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 20776-1:2006 «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни» (ISO 20776-1:2006 «Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems — Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices — Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases»).

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

Лабораторные исследования чувствительности проводят на микроорганизмах, вызывающих болезни, особенно если организм предположительно относится к виду резистентному (устойчивому) по отношению к часто используемым антибактериальным агентам.

Данные тесты также важны для надзора за резистентностью, для эпидемиологических исследований восприимчивости и при сравнении новых и существующих антибактериальных средств.

Процедуры разведения используются для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антимикробных препаратов и служат референтным методом испытания чувствительности (восприимчивости) микроорганизмов к антимикробным средствам.

Методы МПК используются:

• для надзора за резистентностью;
• при сравнительных испытаниях новых агентов, чтобы установить восприимчивость организмов, дающих сомнительные результаты в рутинных исследованиях;
• для испытаний на организмах, где рутинные тесты могут быть ненадежными и когда количественный результат требуется для менеджмента лечения.

В тестах разведения микроорганизмы проверяют на их способность производить видимый рост на ряде агаровых пластин (разведение в агаре) или в бульоне (разведение в бульоне), содержащих последовательные разведения антибактериального агента.

Наиболее низкая концентрация антибактериального агента (в мг/л), которая при определенных условия in vitro предотвращает появление видимого роста микроорганизма в пределах определенного промежутка времени, известна как минимальная подавляющая концентрация (МПК).

МПК служит руководством для клинициста относительно чувствительности организма к антибактериальному агенту и помогает в принятии решений о проведении лечения. Необходимы тщательный контроль и стандартизация внутри- и межлабораторной воспроизводимости, поскольку результаты могут значительно различаться в зависимости от используемого метода.

Общепринято, что бульонные тесты МПК воспроизводимы в пределах одного двойного разведения реальной конечной точки (то есть +/- одна лунка или пробирка в серии двойных разведений).

Разведение бульона — техника, согласно которой контейнеры, содержащие идентичные объемы растворов бульона с антибактериальным агентом в возрастающих (обычно в геометрической прогрессии) концентрациях, инокулируют известным числом микроорганизмов.

Микроразведение бульона — выполнение теста разведения бульона в емкостях для микроразведения.

Метод, описанный в настоящем стандарте, предназначен для испытания чистых культур аэробных бактерий, которые легко выращиваются путем ночной инкубации на агаре и хорошо растут в бульоне Mueller-Hinton, который может иметь добавки. Метод микроразведения в бульоне, описанный в настоящем стандарте, аналогичен методам, используемым во многих странах [1] - [5]. Данный метод — по существу то же самое, что и метод микроразведения в бульоне, изданный Европейским Комитетом по испытаниям антибактериальной восприимчивости (EUCAST) [6]. Все эти методы основаны на принципах, описанных Ericsson и Sherris [7].

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ! Использование настоящего стандарта может быть связано с применением опасных материалов, операций и оборудования. Настоящий стандарт не затрагивает решения проблем безопасности, связанных с его использованием. На пользователе настоящего стандарта лежит ответственность за установление соответствующих мер безопасности, условий охраны здоровья и определение применимости регулирующих ограничений перед использованием стандарта.

Настоящий стандарт описывает референтный метод микроразведений в бульоне для определения МПК. МПК отражает активность препарата в описанных условиях проведения теста и может быть использована для целей менеджмента лечения, принимая в расчет другие факторы, такие как фармакология препарата или механизмы резистентности бактерий. Это позволяет осуществить классификацию бактерий как «чувствительную» (S), «промежуточную» (I) или «резистентную» (R) формы. Кроме того, распределения МПК могут использоваться для определения дикого или недикого типов бактериальной популяции.

Хотя клиническая интерпретация значения МПК вне возможностей настоящего стандарта, модификации основного метода требуются для определенного антибактериального агента или комбинации бактерий, чтобы облегчить клиническую интерпретацию. Эти модификации приведены в таблице 3. Желательно сравнить другие методы испытания восприимчивости (например, рутинные методы или диагностические испытательные устройства) с данным референтным методом для валидации, чтобы гарантировать сопоставимые и надежные результаты.

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1. Антибактериальный агент (antimicrobial agent): вещество биологического, полусинтетического или синтетического происхождения, которое тормозит рост или убивает бактерии и таким образом потенциально применимо для лечения инфекций.

Примечание. Дезинфицирующие средства, антисептики и консерванты не включены в это определение.

2.2 Антибактериальные агенты — свойства (antimicrobial agents — properties):

2.2.1. Активность (potency): антибактериально активная фракция испытуемого вещества, определенного в биопробе, против образца для сравнения того же вещества.

Примечание. Активность выражена как массовая доля в миллиграммах на грамм (мг/г) или как содержание активности в Международных Единицах (IU) на грамм, или как объемная доля или массовая доля в процентах, или как концентрация количества вещества (массовая доля) в молях на литр компонентов в испытуемом веществе.

2.2.2. Концентрация (concentration): количество антибактериального агента в определенном объеме жидкости.

Примечание 1. Концентрация выражена в мг/л.

Примечание 2. Мг/л = мкг/мл, но не рекомендуют использовать единицу мкг/мл.

2.3. Базовый (основной) раствор (stock solution): первоначальный раствор, используемый для дальнейших разведений.

2.4. Минимальная подавляющая концентрация; МПК (minimum inhibitory concentration, MIC): наименьшая концентрация, которая при определенных условиях in vitro предотвращает видимый рост бактерий в пределах определенного промежутка времени.

Примечание. МПК выражена в мг/л.

2.5. Пограничное значение (breakpoint, BP): определенные значения параметров, например МПК, на основе которых бактерии могут быть распределены на клинические категории, как «чувствительные», «промежуточные» и «резистентные».

Примечание. Для действующих интерпретирующих пограничных значений можно сослаться на последние публикации организаций, использующих данный референтный метод (например, CLSI и EUCAST).

2.5.1. Чувствительный (susceptible, S): бактериальный штамм, ингибированный in vitro концентрацией антибактериального агента, которая связана с высокой вероятностью терапевтического успеха.

Примечание 1. Бактериальный штамм классифицирован как чувствительный путем применения соответствующих пограничных значений в определенной фенотипичной тест-системе.

Примечание 2. Эти пограничные значения могут быть изменены из-за изменений условий (например, изменения дозировки обычно используемого препарата, появление новых механизмов резистентности).

2.5.2. Промежуточная (умеренно чувствительная) форма (intermediate, I): бактериальный штамм, ингибированный in vitro концентрацией антибактериального агента, которая связана с сомнительным терапевтическим эффектом.

Примечание 1. Бактериальный штамм классифицирован как промежуточная форма с применением соответствующих пограничных значений в определенной фенотипичной тест-системе.

Примечание 2. Данный класс чувствительности означает, что инфекция, вызванная данным изолятом, может быть соответственно купирована в тех участках тела, где препарат физиологически концентрируется, или когда может быть применена высокая дозировка препарата.

Примечание 3. Данный класс также обозначает «буферную зону» для предупреждения небольших неконтролируемых технических факторов от несоответствия в интерпретациях.

Примечание 4. Данные пограничные значения могут быть изменены из-за изменений в условиях (например, изменения дозировки обычно используемого препарата, появление новых механизмов резистентности).

2.5.3. Резистентный (resistant, R): бактериальный штамм, ингибированный in vitro концентрацией антибактериального агента, которая связана с высокой вероятностью терапевтической неудачи.

Примечание 1. Бактериальный штамм классифицирован как резистентный с применением соответствующих пограничных значений в определенной фенотипичной тест-системе.

Примечание 2. Данные пограничные значения могут быть изменены из-за изменений при обстоятельствах (например, изменения дозировки обычно используемого препарата, появление новых механизмов резистентности).

2.6. Дикий тип (wild type): отсутствие приобретенных механизмов резистентности к антибактериальному агенту для данного штамма.

2.7. Референтный штамм (reference strain): каталогизируемые, охарактеризованные бактерии с устойчивыми, определенными антибактериальными фенотипами и/или генотипами чувствительности.

Примечание. Референтные штаммы сохраняют как базовые культуры, из которых получают рабочие культуры. Они могут быть получены из коллекций культур и использованы для контроля качества.

2.8 Метод испытания чувствительности (susceptibility testing method):

2.8.1. Разведение в бульоне (broth dilution): техника, в которой контейнеры заполнены соответствующими объемами антибактериального раствора, с использованием возрастающих (обычно вдвое) концентраций антибактериального агента и соответствующих объемов бульона с определенным прививочным материалом.

Примечание. Цель этого метода — определение МПК.

2.8.2. Микроразведение (microdilution): выполнение разведения в бульоне в планшетах для микроразведения вместимостью 200 мкл на лунку.

2.9. Бульон (broth): жидкая среда, используемая для роста бактерий in vitro.

2.10. Инокулюм (прививочный материал) (inoculum): число бактерий в суспензии, рассчитанное относительно окончательного объема.

Примечание. Прививочный материал выражен как колонии, образующие единицы в миллилитре (КОЕ/мл).

2.11. Эффект инокулюма (inoculum effect): изменение в МПК, связанное с изменением в инокулюме (прививочном материале).

3.1 Общие положения

Испытания выполняют в планшетах для микроразведения. Метод основан на подготовке рабочих растворов антибактериального агента объемом 50 мкл на лунку (с добавлением прививочного материала также в объеме 50 мкл) или в объеме 100 мкл на лунку (с добавлением максимально 5 мкл объемов прививочного материала).

3.2 Среда

Следует использовать бульон Mueller-Hinton (см. Приложение А для уточнения).

3.3 Антибактериальные агенты

3.3.1 Общие положения

Антибактериальные агенты должны быть получены непосредственно от изготовителя или из надежных коммерческих источников; фармацевтические препараты для клинического применения неприемлемы. Антибактериальные агенты должны быть снабжены номером партии, показателем потенции, указанием срока действия и деталями рекомендованных условий хранения. Вещества следует хранить в плотно закрытых контейнерах в темноте при температуре 4 °C — 8 °C, с осушителем, если иначе не рекомендовано изготовителем. Гигроскопические агенты должны быть распределены в определенных аликвотах, одна из которых используется в каждом случае испытания. Чтобы избежать конденсации, следует согреть контейнеры до комнатной температуры перед открытием.

3.3.2 Подготовка основных растворов

Для взвешивания антибактериальных агентов следует использовать калиброванные аналитические весы. Расчет потенции порошка для получения количества вещества антибактериального агента или объема разбавителя, необходимого для стандартного раствора, вычисляют по формуле

где \rho — концентрация основного раствора, мг/л;

m — масса антибактериального агента (порошок), г;

P — потенция антибактериального агента (порошок), мг/г;

V — объем разбавителя, л.

Концентрации основных растворов должны быть 1000 мг/л или больше, хотя растворимость некоторых агентов является лимитирующим фактором. Фактические концентрации основных растворов зависят от метода подготовки рабочих растворов (серийных разведений). Агенты должны быть растворены и разведены стерильной дистиллированной водой, если изготовителем не установлено иное. Некоторые агенты требуют альтернативных растворителей (см. таблицу 1). Стерилизация растворов обычно не является необходимой. Если она требуется, стерилизация должна быть проведена с помощью мембранной фильтрации, и образцы до и после стерилизации должны быть сравнены испытанием, чтобы гарантировать, что не произошло адсорбции.

Таблица 1

основных растворов избранных антимикробных средств

<1> Аналогичная информация представлена в Государственной фармакопее Российской Федерации.

Если информация относительно стабильности основных растворов при указанных условиях хранения недоступна, должны быть приготовлены свежие растворы для каждой партии испытаний.

3.3.3 Подготовка рабочих растворов

Диапазон концентраций, отобранных для испытания, зависит от микроорганизмов и антибактериального агента. Выбранный диапазон должен давать полное определение конечной точки МПК для соответствующих референтных штаммов. Двойные серийные разведения, основанные на 1 мг/л, готовят в бульоне Mueller-Hinton. Разведения должны быть приготовлены не последовательным разведением, а согласно процедуре, представленной в таблице 2. Рабочие растворы должны использоваться в день их приготовления, если нет информации о стабильности растворов при указанных условиях хранения.

агентов для использования при испытаниях чувствительности с применением разведений в бульоне [8]

3.3.4 Подготовка планшетов для микроразведения

Рабочие растворы распределяют в планшеты для микроразведения по 50 мкл на лунку с удвоенной желательной окончательной концентрацией антибактериального агента или по 100 мкл в лунку с желательной окончательной концентрацией.

По крайней мере одна лунка, содержащая 50 мкл или 100 мкл антибактериальной среды без агента, должна быть использована как контроль роста для каждого проверяемого штамма. Аналогично, лунка, содержащая 100 мкл среды без антибактериального агента, должна быть использована как неинокулированная лунка отрицательного контроля для каждого проверяемого штамма.

3.3.5 Хранение планшетов для микроразведения

Заполненные планшеты могут использоваться немедленно или могут быть сохранены в течение трех месяцев. Для хранения заполненные планшеты должны быть запечатаны в полиэтиленовые пакеты и немедленно помещены в морозильник при температуре ниже минус 60 °C, если нет информации относительно устойчивости антибактериального агента при более высоких температурах.

Хотя антибактериальные агенты в замороженных планшетах обычно остаются устойчивыми в течение нескольких месяцев, определенные агенты (например, clavulanic acid и imipenem) более лабильны, чем другие, и должны храниться при температуре ниже минус 60 °C. Подносы не следует хранить в морозильнике с функцией саморазмораживания и допускать их растаивание, антибактериальные растворы нельзя повторно замораживать, так как повторные циклы таяния-замораживания ускоряют деградацию некоторых антибактериальных агентов, особенно \beta - \text{лактамов} .

3.4 Подготовка инокулюма (прививочного материала)

3.4.1 Общие положения

Стандартизация инокулюма существенна для точного и воспроизводимого испытания чувствительности методом разведения в бульоне. Поэтому проверки чистоты и подсчет жизнеспособных колоний должны быть выполнены на каждом изоляте, проверенном с применением данной референтной методики.

Инокулюм может быть приготовлен путем разведения бульонной культуры или суспензии колоний, взятых из ночной культуры на неселективной агаровой среде, в бульоне или солевом растворе. Для любого метода берут четыре или пять колоний, выросших на чистой неселективной питательной агаровой среде, чтобы избежать случайного выбора нетипичного варианта микроорганизма.

Окончательный состав инокулюма должен содержать 5 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} (диапазон от 2 \times 10^{5} до 8 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} ).

3.4.2 Метод бульонной культуры

Три-пять колоний берут петлей с неселективной питательной агаровой среды и перемещают в бульон типа триптиказо-соевого или бульона из сердечно-мозговой вытяжки. Используемый бульон не должен быть антагонистом по отношению к проверяемому антибактериальному агенту. Бульон инкубируют при 34 °C — 37 °C, пока рост не достигнет мутности, равной или превышающей 0,5 стандарта McFarland. Если нужно, культура может быть отрегулирована с помощью солевого раствора или бульона до мутности, эквивалентной 0,5 стандарта McFarland. Это может быть сделано с помощью фотометрического устройства (используют длину волны 625 нм и кювету с длиной светового пути 1 см, абсорбция составит 0,08 — 0,13) или соответственно откалиброванного нефелометра. Такой же результат может быть достигнут путем визуального сравнения появляющихся в инокулюме черных линий и суспензии 0,5 стандарта McFarland (инокулюм и стандарт McFarland должны находиться в пробирках одного и того же размера) или любым другим методом, который дает воспроизводимую концентрацию КОЕ/мл.

Примечание. 0,5 стандарта McFarland можно получить, добавляя аликвоту 0,5 мл 0,048 моль/л BaCl_{2} (11,72 г/л BaCl_{2} \cdot 2H_{2}O ) к 99,5 мл из 0,18 моль/л H_{2}SO_{4} при постоянном встряхивании для сохранения суспензии.

3.4.3 Метод суспензии колоний

Три-пять колоний из неселективной питательной агаровой среды (инкубированной при 34 °C — 37 °C в течение 18 — 24 ч, если более длинная инкубация не требуется) берут петлей и перемещают в стерильный бульон или соляной раствор. Суспензию регулируют для получения мутности, эквивалентной 0,5 стандарта McFarland, как описано в 3.4.2 для метода бульонной культуры.

Для всех организмов точная концентрация жизнеспособных клеток в окончательном инокулюме зависит от состояния культуры. Этот эффект наиболее выражен у прихотливых организмов, типа Streptococcus pneumoniae, использование старых культур которых может значительно сократить число жизнеспособных клеток в суспензии.

Точно отрегулированная суспензия, подготовленная любым методом, содержит приблизительно 1 \times 10^{8}\text{КОЕ}/\text{мл} для обычных бактерий.

Отрегулированный инокулюм, приготовленный как указано выше, разводят в бульоне, чтобы получить окончательную концентрацию числа клеток 5 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} (в диапазоне от 2 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} до 8 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} ). Требуемое разведение зависит от проверяемого организма и метода, используемого для подготовки инокулюма. Перемещение 0,1 мл суспензии стандартизированного организма в пробирку, содержащую 9,9 мл (разведение 1:100) бульона, дает суспензию с концентрацией клеток 1 \times 10^{6}\text{КОЕ}/\text{мл} , при добавлении 50 мкл которой к равному объему (50 мкл) раствора антибактериального агента получают окончательный состав инокулюма 5 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} для многих грамотрицательных бактерий (например, Escherichia coli). Если лунки уже содержат по 100 мкл антибактериального агента в бульоне, соответствующее разведение, чтобы получить необходимый окончательный инокулюм, должно быть приготовлено путем добавления по 5 мкл разведенной суспензии в каждую лунку. Для грамположительных организмов может быть достаточным меньшее разведение суспензии 0,5 McFarland, как определено подсчетом колоний в предварительных испытаниях.

3.5 Инокулирование планшетов для микроразведения

Планшеты должны инокулироваться в пределах 30 мин стандартизации суспензии инокулюма, чтобы сохранить концентрацию числа жизнеспособных клеток. К каждой лунке, содержащей 50 мкл антибактериального агента, разведенного в бульоне (см. 3.3), добавляют 50 мкл бактериальной суспензии (см. 3.4). В лунки планшета, которые содержат по 100 мкл антибактериального агента, разведенного в бульоне, должно быть добавлено по 5 мкл разведенной суспензии инокулюма.

Подсчет жизнеспособных клеток должен быть выполнен на испытуемой суспензии, чтобы гарантировать, что тестовые лунки содержат приблизительно 5 \times 10^{5}\text{КОЕ}/\text{мл} . Для этого берут 10 мкл из лунки контроля роста немедленно после инокулирования и разводят эту аликвоту в 10 мл бульона или солевого раствора. 100 мкл этого разведения распределяют по поверхности подходящей агаровой пластины, которую затем инкубируют в течение ночи. Ожидается появление от 20 до 80 колоний от приемлемой испытуемой суспензии. Если этого не удается получить, результаты для этого штамма не могут быть использованы.

3.6 Инкубация планшетов для микроразведения

Планшеты для микроразведения должны быть запечатаны в пакеты из полиэтилена или прижаты плотной крышкой или клейкой пленкой перед инкубацией, чтобы предотвратить высушивание. Чтобы избежать неравного нагревания, планшеты для микроразведения должны быть сложены в стопки не больше чем по пять штук.

Если иначе не определено, планшеты для микроразведения инкубируют при 34 °C — 37 °C окружающей среды в течение (18 +/- 2) ч для большинства комбинаций антибактериальных агентов и бактерий. Не должна использоваться атмосфера, обогащенная CO_{2} .

3.7 Чтение результатов

Результаты следует прочитывать только при наличии достаточного роста испытуемого организма (то есть при явном пятне или определенном помутнении в положительном контроле роста), когда нет никакого роста в неинокулированном или отрицательном контроле роста (если присутствует) и когда были установлены чистота и соответствующая концентрация числа клеток инокулюма. Размер роста в каждой лунке сравнивают с размером роста в положительном контроле роста и наиболее низкую концентрацию агента, которая полностью тормозит видимый рост, регистрируют как МПК.

3.8 Особые ситуации испытаний, при которых результат МПК может быть ненадежным

В некоторых случаях значение МПК может не отражать истинную активность, поэтому интерпретация результатов испытаний с некоторыми антибактериальными агентами для клинического применения возможно должна быть изменена. В этих ситуациях референтный метод должен быть модифицирован, например, путем изменения условий инкубации или введением добавок в среду. Кроме того, при использовании стандартного метода разведения не всегда могут быть обнаружены определенные механизмы резистентности, например, экспрессия некоторых ( \beta - \text{лактамаз} , модификации выводящих насосов или целевого участка антибактериального препарата. В таких случаях МПК следует интерпретировать с осторожностью или использовать другую информацию для регулирования клинического лечения. В таблице 3 приведены несколько комбинаций антибактериальных агентов и бактерий, требующих особого внимания.

Особые ситуации испытаний

Качество результатов испытаний должно быть отслежено с помощью сопутствующего использования контрольных штаммов (см. таблицу 4). Банк контрольных штаммов следует хранить в лиофилизированном или замороженном виде (при температуре минус 60 °C или ниже). Рабочие культуры готовят с помощью субкультур из банка штаммов на неселективной питательной агаровой среде. Дальнейшие субкультуры могут быть приготовлены из первой рабочей культуры только в течение одной недели. Когда это возможно, по крайней мере, два соответствующих контрольных штамма должны быть проверены каждый день, когда проводят испытание. Испытуемые колонии контрольных культур обрабатывают таким же образом, как и обычные культуры. МПК антибактериальных агентов для контрольных организмов должны быть в пределах диапазонов, приведенных в таблице 4.

Диапазоны МПК (мг/л) для контрольных штаммов

Приложение А (обязательное)

ТРЕБОВАНИЯ К БУЛЬОНУ MUELLER-HINTON

А.1. Общие положения

Добавки, помимо двухвалентных катионов или других дополнительных компонентов, не должны использоваться, если они не являются необходимыми для роста испытуемых организмов.

А.2. Испытания неприхотливых микроорганизмов в бульоне Mueller-Hinton

А.2.1. Общие положения

Стандартной средой для испытания неприхотливых микроорганизмов является бульон Mueller-Hinton. Оригинальная формула его приготовления следующая [10]:

обезвоженная вытяжка из 300 г мяса;

кислотный отвар казеина 17,5 г;

крахмал 1,5 г;

QSP дистиллированная вода 1000 мл;

pH 7,2 — 7,4.

А.2.2. Добавление и содержание катионов

Бульон должен содержать достаточную концентрацию катионов, чтобы обеспечить адекватный рост и чтобы позволить пользователю определить значение МПК для контроля качества штаммов в пределах, указанных в таблице 4.

Новые партии бульона Mueller-Hinton могут требовать определения приемлемого содержания катионов. Это исследование может быть выполнено с помощью индуктивно-сопряженной плазменной спектроскопии (ICP) и пламенной атомно-абсорбционной спектрометрии (FAAS) [11].

Для добавления ионов кальция и магния готовят растворы 10 мг/л хлорида кальция (3,68 г CaCl_{2} \cdot 2H_{2}O в 100 мл деионизированной воды) и хлорида магния (8,36 г MgCl_{2} \cdot 6H_{2}O в 100 мл деионизированной воды), стерилизуют с помощью мембранного фильтра и хранят при температуре от 2 °C до 8 °C. Каждые 0,1 мл раствора катионов 10 мг/л, добавленные к 1 л бульона, повышают содержание катионов на 1 мг/л. Добавляют при помешивании при температуре от 2 °C до 8 °C.

Для большинства комбинаций антибактериальный агент-бактерия добавление кальция и магния до окончательной концентрации от 20 до 25 мг/л соответственно позволило получить правильные результаты контроля качества [12], [13].

Для daptomycin требуется окончательная концентрация ионов кальция в среде 50 мг/л [14].

Для агентов carbapenem — imipenem и meropenem — было показано, что окончательная концентрация цинка должна быть меньше 3 мг/л [15]. Массовая концентрация цинка, необходимая для максимальной активности других препаратов carbapenem, не была установлена, но возможно она должна быть на том же уровне.

А.2.3. Испытание родов Streptococcus

При испытании родов Streptococcus к содержащей катионы среде бульона Mueller-Hinton должна быть добавлена лизированная лошадиная кровь до окончательной концентрации от 2,5% до 5,0%. Кровь должна быть получена от заслуживающего доверия поставщика. Должна быть известна информация о гематокрите (не менее 30%). Для приготовления лизированной крови смешивают равные объемы дефибринированной крови и стерильной дистиллированной воды. Замораживают при температуре минус 20 °C и размораживают до окончательного лизирования клеток (может требоваться пять-семь циклов замораживания-оттаивания). Центрифугируют для просветления раствора. Полученный препарат лизированной крови является базовым раствором с объемной концентрацией 50%.

А.2.4. Дополнительные сообщения о средах

А.2.4.1. Общие положения

В настоящее время невозможно указать все возможности, которые появятся для контроля качества и референтного испытания антимикробной чувствительности аэробных и факультативно-аэробных бактериальных родов. Некоторые данные об эффектах сред содержатся в неопубликованных материалах. Новые агенты потребуют «стандартных» препаратов среды. Пользователи будут требовать подтверждения, что параметры стандартов контроля качества будут соответствовать и что новые издания будут доступны на международном уровне, так что настоящий стандарт может обновляться регулярно.

А.2.4.2. Sulphonamides и trimethoprim

Среда должна иметь массовую концентрацию тимидина менее чем 0,03 мг/л. Такая среда предотвращает использование для испытания других антимикробных средств.

А.2.4.3. Tigecycline

Tigecycline должен быть добавлен в бульон Mueller-Hinton в течение 12 ч приготовления бульона. Приготовленные планшеты для микроразведения могут быть заморожены.

А.2.4.4. Dalbavancin

Для испытания Dalbavancin отрегулированный катионами бульон Mueller-Hinton должен быть дополнен полисорбатом-80 объемной долей 0,002%.