--- title: "\"ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа. (Контрольный метод)\"" number: "ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010" issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии" status: утратил силу canonical: "https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-13366-1-2010" --- ## "ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа. (Контрольный метод)" # "ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа. (Контрольный метод)" (утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 30.11.2010 N 686-ст) > [!WARNING] > Документ утратил силу с 01.07.2017 в связи с изданием Приказа Росстандарта от 23.09.2016 N 1207-ст. > Взамен введен в действие [ГОСТ ISO 13366-1-2014](https://bukva.ai/docs/standart-gost-iso-13366-1-2014). > Документ утратил силу с 01.07.2017 в связи с изданием Приказа Росстандарта от 23.09.2016 N 1207-ст. Взамен введен в действие [ГОСТ ISO 13366-1-2014](https://bukva.ai/docs/standart-gost-iso-13366-1-2014). > Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 N 80). > Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 N 880). > Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимых для применения и исполнения Федерального закона "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 15.12.2008 N 1866-р). > Документ [введен](#p100012) в действие с 01.01.2012. > [!NOTE] > ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ ```mermaid flowchart LR n0["ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-13366-1-2010" "ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа. (Контрольный метод) (утв. и введе" n1["ГОСТ ISO 13366-1-2014"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-iso-13366-1-2014" "ГОСТ ISO 13366-1-2014. Межгосударственный стандарт. Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (контрольный метод) (введен в действие Приказом Рос" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000; ```
Утвержден и введен в действие
Приказом Федерального агентства
по техническому регулированию
и метрологии
от 30 ноября 2010 г. N 686-ст
**НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ** **МОЛОКО. ПОДСЧЕТ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК** **ЧАСТЬ 1** **МЕТОД С ПРИМЕНЕНИЕМ МИКРОСКОПА** **(КОНТРОЛЬНЫЙ МЕТОД)** Milk. Enumeration of somatic cells. Part 1. Microscopic method (Reference method) **ISO 13366-1:2008** Milk - Enumeration of somatic cells - Part 1: Microscopic method (Reference method)(IDT)
**ГОСТ Р ИСО 13366-1-2010**
Группа Н19 ОКС 67.100.10 ОКСТУ 9209 Дата введения
1 января 2012 года
### Предисловие Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения". ### Сведения о стандарте 1. Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе собственного аутентичного перевода на русский язык международного стандарта, указанного в пункте 4. 2. Внесен Техническим комитетом стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность". 3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 30 ноября 2010 г. N 686-ст. 4. Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ИСО 13366-1:2008 "Молоко. Подсчет соматических клеток. Часть 1. Метод с применением микроскопа (Контрольный метод)" [ISO 13366-1:2008 "Milk - Enumeration of somatic cells - Part 1: Microscopic method (Reference method)"]. В настоящем стандарте исключен пункт "Протокол испытания" в связи с различиями форм записи результатов испытаний в различных лабораториях. 5. Введен впервые. Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет. ### 1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета соматических клеток с применением микроскопа в сыром и химически консервированном молоке. Стандарт допускается применять для подготовки стандартных проб при калибровке механизированных и автоматизированных способов подсчета клеток. Предупреждение. Использование настоящего стандарта может быть сопряжено с применением опасных материалов, операций и оборудования. Настоящий стандарт не имеет целью решение всех вопросов безопасности, обусловленных его применением. На пользователя настоящего стандарта возлагается вся ответственность по установлению надлежащих правил безопасности и охраны здоровья и определения применимости регулятивных ограничений, разработанных до использования. ### 2. ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями: 2.1. Соматические клетки (somatic cells): клетки с ядрами, то есть все лейкоциты и эпителиальные клетки, определяемые в соответствии с процедурой, приведенной в настоящем стандарте. ### 3. СУЩНОСТЬ МЕТОДА Анализируемую пробу молока распределяют на предметном стекле и получают мазок, который высушивают. После высушивания мазок окрашивают. Далее окрашенные клетки подсчитывают с использованием микроскопа. Количество подсчитанных клеток на четко установленной площади умножают на рабочий коэффициент с целью определения количества клеток на миллилитр. ### 4. РЕАКТИВЫ Используют только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированную или деминерализованную воду или воду аналогичной чистоты. #### 4.1 Растворы красителей Предупреждение. Тетрахлорэтан является ядовитым веществом. Бромистый этидий является мутагенным веществом. В случае проливания следует предпринять надлежащие действия по обезвреживанию. Подготовка и применение растворов красителей должны осуществляться под вытяжным шкафом с использованием защитного оборудования. ##### 4.1.1 Модифицированный окрашивающий раствор ###### 4.1.1.1 Состав
Этанол, 95% (по объему), см3 a) Тетрахлорэтан , см3 Метиленовый синий, г Кислота уксусная, безводная, см354,0 40,0 0,6 6,0
a) Допускается применять ксилол в том же объеме, какой указан для тетрахлорэтана.
###### 4.1.1.2 Приготовление модифицированного окрашивающего раствора Смешивают этанол и тетрахлорэтан и закрывают сосуд. Смесь нагревают на водяной бане [(5.1)](#p100087) при температуре 65 °C. Добавляют метиленовый синий под вытяжным шкафом и тщательно перемешивают. Смесь охлаждают до температуры 4 °C. Затем добавляют безводную уксусную кислоту и вновь тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через фильтр [(5.2)](#p100088) и помещают в герметичный сосуд на хранение. Перед использованием окрашивающий раствор снова фильтруют. ##### 4.1.2 Окрашивающий раствор бромистого этидия ###### 4.1.2.1 Основной окрашивающий раствор ###### 4.1.2.1.1 Состав | Бромистый этидий, г Деминерализованная вода, см3 | 0,25 100 | | --- | --- | ###### 4.1.2.1.2 Приготовление основного окрашивающего раствора Бромистый этидий растворяют в деминерализованной воде, предварительно нагретой до 40 °C. Раствор охлаждают до комнатной температуры. Доводят объем до 100 см3 деминерализованной водой. Основной окрашивающий раствор бромистого этидия хранят в темном месте при температуре (2 +/- 2) °C не более 2 мес. ###### 4.1.2.2 Буферный раствор ###### 4.1.2.2.1 Состав | Калия гидрофталат, г Калия гидроксид, г Вода деминерализованная, см3 | 0,51 0,162 100 | | --- | --- | ###### 4.1.2.2.2 Приготовление буферного раствора Растворяют по отдельности калия гидрофталат и калия гидроксид в деминерализованной воде. Буферный раствор хранят в темном месте при температуре (2 +/- 2) °C не более 2 мес. ###### 4.1.2.3 Рабочий окрашивающий раствор бромистого этидия ###### 4.1.2.3.1 Компоненты
Основной окрашивающий раствор бромистого a) этидия (4.1.2.1), см3 Буферный раствор (4.1.2.2), см3 Тритон X-100, см3 Вода деминерализованная, см32 8 0,1 90
a) Высокая температура может привести к снижениию окрашивающей способности бромистого этидия.
###### 4.1.2.3.2 Приготовление рабочего окрашивающего раствора бромистого этидия Последовательно добавляют основной окрашивающий раствор бромистого этидия, буферный раствор и Тритон X-100 к деминерализованной воде и тщательно перемешивают. Свежий рабочий окрашивающий раствор бромистого этидия готовят непосредственно перед использованием. #### 4.2 Фосфатный буферный раствор (PBS) ##### 4.2.1 Компоненты | NaCl, г | 8 | | --- | --- | | KCl, г | 0,2 | | Na HPO ·7H O, г | 1,15 | | 2 4 2 | | | KH PO , г | 0,2 | | 2 4 | | | Вода деминерализованная, см3 | 1000 | ##### 4.2.2 Приготовление фосфатного буферного раствора (PBS) Соли растворяют в деминерализованной воде. Доводят объем до 1000 см3 оставшимся количеством деминерализованной воды. Устанавливают pH на уровне 7,2 +/- 0,1. *Примечание.* Допускается использовать готовый фосфатный буферный раствор с pH = 7,2. ### 5. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ Используют обычное лабораторное оборудование и, в частности, нижеприведенное. 5.1. Бани водяные, работающие при температуре (40 +/- 2) °C, (50 +/- 2) °C и (65 +/- 2) °C. 5.2. Фильтр, устойчивый к используемым растворителям, с диаметром пор 10 - 12 мкм. 5.3. Микроскоп, имеющий увеличение $500^{\times}$ - $1000^{\times}$ . Допускается использовать масляно-иммерсионные объективы. При использовании бромистого этидия микроскоп должен иметь флуоресцентное оборудование. 5.4. Микрошприц, для дозирования установленного объема молока 0,01 см3, с максимальным допуском 2%. #### 5.5 Микрометр 5.6. Стекла предметные с предварительно нанесенными очерченными контурами (прямоугольным или круговым), площадью 1 см2 +/- 5% (95 - 105 мм2), или стандартное предметное стекло 20 x 5 мм или имеющее диаметр 11,28 мм. ##### 5.6.1 Формы предметных стекол При использовании предметного стекла прямоугольной формы верхняя и нижняя внутренняя ширина, с одной стороны, и левая и правая внутренняя высота, с другой стороны, не должны отличаться более чем на 0,2 мм. При использовании предметных стекол круглой формы вертикальный и горизонтальный внутренние диаметры не должны отличаться более чем на 0,2 мм. ### 6. ОТБОР ПРОБ В лабораторию доставляют представительную пробу. Проба не должна быть повреждена или модифицирована при транспортировании или хранении. Отбор проб не является частью метода, устанавливаемого в настоящем стандарте. Отбор проб - по [[1]](#p100302). ### 7. ПРИГОТОВЛЕНИЕ АНАЛИЗИРУЕМОЙ ПРОБЫ #### 7.1 Хранение До проведения определения или химического консервирования анализируемые пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C. Определение проводят в течение 6 ч после отбора проб. В случае более длительного хранения в пробы добавляют химические консерванты, такие как борная кислота, бронопол или дихромат калия. Массовая концентрация борной кислоты в анализируемой пробе не должна превышать 0,6 г на 100 см3. Массовая концентрация бронопола в анализируемой пробе не должна превышать 0,05 г на 100 см3. Массовая концентрация дихромата калия в анализируемой пробе не должна превышать 0,1 г на 100 см3. Консервированные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более 6 дней. Рекомендуется ограничить использование дихромата калия в случае проб, для которых предусмотрен только длительный срок хранения. #### 7.2 Приготовление пробы Анализируемую пробу молока нагревают (см. [7.1](#p100101)) на водяной бане [(5.1)](#p100087) при температуре 40 °C, постоянно перемешивая. Охлаждают пробу до температуры 20 °C. Разбавляют анализируемую пробу фосфатно-буферным раствором [(4.2)](#p100074) до получения около 500 000 соматических клеток/см3 для каждой разбавленной анализируемой пробы.
$d = \frac{V_{s}}{V_{s} \times V_{b}} ,(1)$
где d - коэффициент разбавления для получения надлежащего количества соматических клеток в анализируемой пробе, примерно 500 000 клеток/см3; $V_{s}$ - объем, см3, анализируемой пробы; $V_{b}$ - объем, см3, буферного раствора, используемого для разбавления анализируемой пробы. Записывают надлежащий коэффициент разбавления, d, объем анализируемой пробы $V_{s}$ , и объем буферного раствора $V_{b}$ , используемый для получения нужного разбавления. ### 8. ПРОВЕДЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Для каждой анализируемой пробы приготовляют как минимум два мазка (см. 8.1) и отбирают лучший из них (например, мазок, не поврежденный в процессе окрашивания). Погружают предметные стекла [(5.6)](#p100093) в этанол (95% по объему). Стерилизуют пламенем и охлаждают. #### 8.1 Приготовление мазка и окрашивания Для приготовления мазка и окрашивания следуют рекомендациям, приведенным в 8.1.1 или [8.1.2](#p100126). Примечание. Окрашивание в случае козьего молока описано в [Приложении B](#p100263). ##### 8.1.1 Приготовление мазка и окрашивания с использованием окрашивающего раствора Используя микрошприц [(5.4)](#p100091), отбирают 0,01 см3 анализируемой пробы (при необходимости разбавленной) (см. [7.2](#p100107)). Микрошприц промывают анализируемой пробой. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала с анализируемой пробой. Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 [(5.6)](#p100093). Используя иглу, равномерно распределяют анализируемую пробу на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости. Высушенный на предметном стекле мазок погружают в модифицированный окрашивающий раствор [(4.1.1)](#p100036) в течение не менее 15 мин. Высушивают мазок при комнатной температуре. Затем осторожно вносят мазок под водопроводную воду до полного смыва всех излишков красителя. Высушивают вновь и хранят в условиях защиты от пыли. Срок хранения предметных стекол с мазками - не более 12 мес. ##### 8.1.2 Окрашивание с использованием окрашивающего раствора бромистого этидия и приготовление мазка Смешивают 1 см3 приготовленной анализируемой пробы (см. [7.2](#p100107)) с 1 см3 рабочего окрашивающего раствора бромистого этидия [(4.1.2.3)](#p100064) в пробирке. Смесь хранят в защищенном от света месте. Нагревают пробирку на водяной бане [(5.1)](#p100087) при температуре 50 °C в течение 3 мин. Охлаждают до комнатной температуры. Используя микрошприц [(5.4)](#p100091), отбирают 0,01 см3 смеси. Микрошприц промывают смесью. При необходимости тщательно и аккуратно очищают внешнюю сторону микрошприца, которая контактировала со смесью. Помещают смесь на чистое предметное стекло площадью 1 см2 [(5.6)](#p100093). Используя иглу, равномерно распределяют смесь на всей указанной поверхности, при этом контролируют, чтобы площадь, прилегающая к внешним границам, была также равномерно покрыта. Мазок подсушивают при комнатной температуре до состояния полной сухости. #### 8.2 Определение ##### 8.2.1 Оптимизация считывания Используя микроскоп [(5.3)](#p100089), подсчитывают ядра клеток в полученном мазке ([8.1.1](#p100120) или [8.1.2](#p100126)) в полях микроскопа, целиком заполненных только мазком молока. Выбирают наилучшее увеличение (от $500^{\times}$ до $1000^{\times}$ ), чтобы в каждом поле максимальное количество клеток в среднем было 20. Клетки имеют окрашенное ядро. Размер клетки - не менее 8 мкм. Не следует подсчитывать клетки с размером не более 4 мкм (см. [рисунок 1](#p100142)). Фрагменты клеток подсчитывают в окончательном результате, если видно более 50% ядерного материала. Кластеры клеток подсчитывают как одну клетку, если ядра четко не разделены. См. [рисунки 2](#p100145) и [3](#p100148).
![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_0.png) Макрофаг
8 - 30 мкм
Связь между цитоплазмой и ядром прочная. Фагоцитоз, презентация антигена, секреция хемоаттрактантов. ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_1.png) Полиморфоядерный нейтрофил
10 -14 мкм
90% в случае острого мастита
60% в случае хронического
Связь между цитоплазмой и ядром незначительная. Фагоцитоз. Первая линия защиты от мастита. ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_2.png) Лимфоцит
5 - 10 мкм
Связь между цитоплазмой и ядром незначительная. T-клетка-хелпер, T-клетка-супрессор, B-клетка с интенсивно окрашенным ядром. ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_3.png) Эпителиальная клетка
10 - 14 мкм
Круглое ядро. Цитоплазма окрашена слабо.
Рисунок 1. Примеры клеток ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_4.png)
Длина клетки: L1 = 9,79 мкм и L2 = 2,77 мкм Рисунок 2. Примеры клеток сборного коровьего молока
(увеличение $1000^{\times}$ ) ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_5.png)
Длина клетки: L22 = 9,08 мкм; L23 = 8,27 мкм; L24 = 4,95 мкм;
L25 = 7,39 мкм; L26 = 6,37 мкм; L27 = 3,58 мкм.
Рисунок 3. Примеры клеток сборного коровьего молока
(увеличение $500^{\times}$ и $1000^{\times}$ ) На примере кластера, представленного на рисунке 3, следует подсчитать 5 клеток. L27 опущен из-за своего диаметра, который имеет размеры не более 4 мкм. *Примечание.* Подготовка и профессиональное мастерство аналитика являются основными решающими факторами успешного использования метода. Частое использование данного метода и участие в межлабораторных испытаниях играют существенную роль в плане обеспечения надлежащего уровня подсчета. Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона (см. [Приложение C](#p100289)). Минимальное количество клеток (N), подсчитываемых с учетом требуемого уровня подсчета клеток, с целью достижения указанного коэффициента вариации, приведено в [таблице 1](#p100154). Для правильного выполнения метода важно, чтобы указанное минимальное количество клеток было подсчитано. Подсчитываемые поля и полосы выбирают таким образом, чтобы получить представительный подсчет для всего мазка. Таблица 1 Минимальное количество клеток (N) | Концентрация клеток (x 1000 клеток/см3) | Коэффициент вариации, % | Минимальное количество клеток (N) | | --- | --- | --- | | < 150 | 10 | 100 | | 150 - 250 | 7 | 200 | | 250 - 400 | 6 | 300 | | >= 400 | 5 | 400 | ##### 8.2.2 Подсчет в последовательных полях микроскопа Подсчитывают ядра в последовательных полях, в вертикальных полосах на равномерно размещенных полях (см. [рисунок 4](#p100184) и [таблицу 1](#p100154)). a) Начинают приблизительно на расстоянии $d_{L}$ от левой стороны. В случае круглой формы начинают на достаточном расстоянии $d_{L}$ от левой стороны горизонтального диаметра таким образом, чтобы обеспечить подсчет минимум 5 полей от верхней части полосы. Расстояние $d_{L}$ 0,5 мм подходит для прямоугольной и круглой формы. b) Помещают верхний или нижний край окружности поля тангенциально по отношению к внутренней верхней или нижней границе шаблона (шаблон не должен быть видимым в поле). В случае наличия непокрытой поверхности вблизи границы шаблона корректируют поле по границе мазка. c) После подсчета первого поля объектив передвигают на установленное расстояние $d_{H}$ вниз или вверх, до следующей градации в направлении нижнего или верхнего края и подсчитывают новое поле. Расстояние $d_{H} = 1\text{мм}$ считается пригодным. d) С последнего подсчитанного поля повторяют операцию c) вплоть до достижения противоположной стороны (верхней или нижней) полосы. Выбирают один из двух приведенных вариантов. - Вариант 1: последнее поле не подлежит подсчету. - Вариант 2: если появляется верхняя или нижняя граница и она заполняет менее половины поверхности поля, подсчет производится после передвижения объектива до полного исчезновения границы с поля, которое в этом случае только покрывает мазок. e) Затем объектив передвигают вправо на расстояние $d_{W}$ (например, $d_{W} = 1,5\text{мм}$ или $d_{W} = 2\text{мм}$ в зависимости от необходимого числа полей) и начинают работать с новой полосой в противоположном направлении (вверх или вниз). f) Операции [b)](#p100163) - e) повторяют до достижения правой стороны шаблона. g) В случае недостаточного количества подсчитываемых полей (см. [таблицу 1](#p100154)) можно подсчитать дополнительные поля. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации расстояний при поэтапном передвижении) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полей, которое является репрезентативным для всего мазка. h) Результат рассчитывают в соответствии с указаниями [9.1](#p100188) для прямоугольной формы или [9.3](#p100214) для круглой формы. *Примечание.* В случае прямоугольной формы возможно расположение 5 полей на 1 мм в вертикальных полосах и 10 полос, расположенных на расстоянии 2 мм, что позволяет подсчитать 50 полей. Приблизительно такое же количество полей получается при круглой форме при использовании тех же расстояний. Расстояния между сдвигами (пространства) измеряются от той же зоны полей с использованием прибора корректировки (выравнивание верхнего или нижнего края) таким образом, чтобы они включали в себя диаметр поля. ##### 8.2.3 Подсчет в прямоугольной форме по полосам Ядра подсчитывают в расположенных с равными интервалами вертикальных полосах (см. [рисунок 5](#p100186) и [таблицу 1](#p100154)): a) Начинают приблизительно на расстоянии $d_{L}$ от левой стороны. Расстояние $d_{L}$ 0,5 мм считается пригодным. b) Начинают подсчитывать от верхней или нижней границы прямоугольной площади. Помещают границу поверхности в центр зрения микроскопа. После подсчета всех клеток объектив передвигают в направлении, противоположном границе, и подсчитывают все клетки, видимые в этой полосе, вплоть до достижения противоположной границы. Записывают число подсчитанных клеток. c) Затем объектив передвигают вправо на расстояние $d_{W}$ и начинают подсчет новой полосы (например, $d_{W} = 3 - 4\text{мм}$ в зависимости от необходимого числа полей для репрезентативного подсчета всего мазка). Операции b) - c) повторяют до достижения правой стороны шаблона. В случае недостаточного количества подсчитываемых полос (см. [таблицу 1](#p100154)) можно подсчитать дополнительные полосы. Для выполнения этой операции объектив микроскопа фокусируют на другие зоны (например, посредством изменения исходной позиции и/или адаптации $d_{W}$ ) таким образом, чтобы получить надлежащее количество полос, которое является репрезентативным для всего мазка. Результат подсчитывают, как указано в [9.2](#p100204).
![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_6.png) ![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_7.png) 1 - вниз вплоть до нижней границы Рисунок 4. Вертикальные полосы, образованные
равноудаленными полями в случае круглой
или прямоугольной формы
![8. Проведение определения](https://i.bukva.ai/d6iqSi2V/img_8.png)
Рисунок 5. Равноудаленные вертикальные полосы
### 9. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ #### 9.1 Подсчет для прямоугольной формы в последовательных полях Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины $L_{s}$ и ширины $W_{s}$ мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа. Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение: $c = \frac{W_{s} \times L_{s} \times N_{t}}{\pi \times (\frac{D_{f}}{2})^{2} \times N_{f} \times V_{m}} \times \frac{1}{d} ,(2)$
или $c = f_{w} \times [\frac{N_{t}}{N_{f}} \times \frac{1}{d}](3)$
с постоянным рабочим коэффициентом $f_{w}$ $f_{w} = \frac{W_{s} \times L_{s}}{\pi \times (\frac{D_{f}}{2})^{2} \times V_{m}} ,(4)$ где c - общая концентрация, выраженная в количестве клеток на миллилитр; $W_{s}$ - ширина мазка, мм; $L_{s}$ - длина мазка, мм; $N_{t}$ - общее количество подсчитанных клеток, шт.; $D_{f}$ - диаметр поля микроскопа, мм; $N_{f}$ - количество полностью подсчитанных полей, шт.; $V_{m}$ - объем, см3, испытуемой пробы мазка (см. [8.1.1](#p100120) или [8.1.2](#p100126)) [ $V_{m}$ , равный 0,01 см3, в случае использования для окрашивания [(8.1.1)](#p100120) модифицированного рабочего окрашивающего раствора; $V_{m}$ , равный 0,005 см3, в случае использования для окрашивания [(8.1.2)](#p100126) окрашивающего раствора бромистого этидия]. d - коэффициент разбавления, используемый в [7.2](#p100107) (если разбавление не требуется, d = 1; при разбавлении 1:1 d = 0,5). #### 9.2 Подсчет для прямоугольной формы в полосах Проверяют контрольные значения 20,0 и 5,0 мм для длины и ширины мазка с использованием градуировки и прибора корректировки микроскопа. Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение: $c = \frac{W_{s} \times N_{t}}{D_{f} \times N_{b} \times V_{m}} \times \frac{1}{d} (5)$ или $c = f_{w} \times [\frac{N_{t}}{N_{b}} \times \frac{1}{d}](6)$ с постоянным рабочим коэффициентом $f_{w}$ $f_{w} = \frac{W_{s}}{D_{f} \times V_{m}} ,(7)$ где $N_{b}$ - количество полностью подсчитанных полос. Остальные обозначения приведены в [9.1](#p100188). #### 9.3 Подсчет для круглой формы в последовательных полях Проверяют диаметр мазка, равный 11,28 мм, используя градуировку и прибор корректировки микроскопа. Рассчитывают общую концентрацию c клеток, используя следующее уравнение: $c = \frac{D_{c}^{2} \times N_{t}}{D_{f}^{2} \times N_{f} \times V_{m}} \times \frac{1}{d} (8)$ или $c = f_{w} \times [\frac{N_{t}}{N_{f}} \times \frac{1}{d}](9)$ с постоянным рабочим коэффициентом $f_{w}$ $f_{w} = \frac{D_{c}^{2}}{D_{f}^{2} \times 2} ,(10)$ где $D_{c}$ - диаметр мазка, мм. Остальные обозначения приведены в [9.1](#p100188). #### 9.4 Выражение результатов Результаты испытаний округляют до тысячи клеток (например, 401 586 клеток/см3 выражают как 402 000 клеток/см3). ### 10. ПРЕЦИЗИОННОСТЬ Точность настоящего метода установлена в соответствии с [[2]](#p100303) и [[3]](#p100304). Значения, полученные для повторяемости и воспроизводимости, выражены при уровне вероятности 95%. #### 10.1 Повторяемость Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в той же лаборатории, одним и тем же оператором с использованием одного и того же оборудования в течение короткого периода времени, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 2.
Таблица 2
Значения повторяемости
| Концентрация клеток (x 1 000 клеток/см3) | s (x 1 000 клеток/см3) r | r (x 1 000 клеток/см3) | | --- | --- | --- | | 245 | 38 | 107 | | 455 | 43 | 121 | | 679 | 69 | 192 | | 791 | 110 | 308 | #### 10.2 Воспроизводимость Абсолютная разница между двумя независимыми отдельными результатами определений, полученными с использованием одного и того же метода применительно к идентичному анализируемому материалу в различных лабораториях, различными операторами с использованием различного оборудования, должна не более чем в 5% случаев превышать значения, приведенные в таблице 3.
Таблица 3
Значения воспроизводимости
| Концентрация клеток (x 1 000 клеток/см3) | s (x 1 000 клеток/см3) R | R (x 1 000 клеток/см3) | | --- | --- | --- | | 245 | 41 | 114 | | 455 | 62 | 174 | | 679 | 78 | 218 | | 791 | 110 | 308 |
Приложение A
(справочное)
**РЕЗУЛЬТАТЫ МЕЖЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ**
A.1. Общие положения В октябре 2005 г. были проведены совместные международные исследования коровьего молока, в которых приняли участие восемнадцать лабораторий и тринадцать стран. Испытание включало 8 проб на четырех уровнях клеток/мл и включало 16 дублирующих проб без указания источника поступления. Среднее значение каждого уровня соответственно составляет: - уровень 1, пробы A и B: 245 000 клеток/см3; - уровень 2, пробы C и D: 455 000 клеток/см3; - уровень 3, пробы E и F: 679 000 клеток/см3; - уровень 4, пробы G и H: 791 000 клеток/см3. Испытание было организовано A.I.A. Laboratorio Standard Latte, Maccarese-Roma (Италия), которая также провела статистический анализ согласно [[2]](#p100303) и [[3]](#p100304) с целью предоставления прецизионных данных, приведенных в таблице A.1.
Таблица A.1
Результаты межлабораторных испытаний
Наименование показателяУровень
1234
Число участников после исключения лабораторий с резко отклоняющимися результатами24232424
Среднее значение (x 1000 клеток/см3)245455679791
Среднее квадратичное отклонение повторяемости s (x 1000 клеток/см3) r Коэффициент вариации повторяемости (%) Предел повторяемости r (2,8s ) (x 1000 r клеток/см3)38 169 10743 9 12169 10 192110 14 308
Среднее квадратичное отклонение воспроизводимости S (x 1000 клеток/см3) R Коэффициент вариации воспроизводимости (%) Предел воспроизводимости R (2,8s ) (x 1000 R клеток/см3)41 17 11462 14 17478 11 218110 14 308
Приложение B
(справочное) **ОКРАШИВАНИЕ КОЗЬЕГО МОЛОКА**
B.1. Окрашивающие растворы для козьего молока B.1.1. Фиксатор Карнуа B.1.1.1. Состав | Хлороформ Кислота уксусная безводная Этанол 100% | 60 см3 20 см3 120 см3 | | --- | --- | B.1.1.2. Приготовление Последовательно добавляют хлороформ и безводную уксусную кислоту в этанол и тщательно перемешивают. B.1.2. Окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого B.1.2.1. Состав | Пиронин-Y Метиловый зеленый Вода деминерализованная | 1,0 г 0,56 г 196 см3 | | --- | --- | B.1.2.2. Приготовление Последовательно добавляют пиронин-Y и метиловый зеленый в сосуд с деминерализованной водой и тщательно перемешивают. Фильтруют через подходящий фильтр [(5.2)](#p100088) и хранят в коричневой емкости. Перед использованием раствор фильтруют снова через подходящий фильтр [(5.2)](#p100088). B.2. Приготовление мазка Работают с предметным стеклом, выполняя следующие этапы окрашивания: 1. Используют фиксатор Карнуа [(B.1.1)](#p100265) в течение 5 мин. 2. Используют этанол в концентрации 50% в течение 1 мин. 3. Используют этанол в концентрации 30% в течение 1 мин. 4. Используют воду в течение 1 мин. 5. Используют окрашивающий раствор пиронина-Y и метилового зеленого [(B.1.2)](#p100272) для окрашивания в течение 6 мин.
6. Кратковременно промывают н-бутиловым спиртом, затем ксилолом.
7. Предметные стекла хранят в условиях защиты от пыли не более 12 мес.
Приложение C
(справочное)
**РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПУАССОНА**
Клетки в молоке распределяются по закону Пуассона. Распределение Пуассона по формуле
$M = V = s^{2},$ где M - среднее значение, которое, в случае подсчета количества соматических клеток, представляет собой число подсчитанных частиц (клеток); V - дисперсия; s - стандартное отклонение.
Коэффициент вариации (CV) будет равен
$CV = \frac{s}{M} \times 100\%,$
или
$CV = \frac{100\%}{s} ,$
или $CV = \frac{100\%}{\sqrt{M}} .$
## БИБЛИОГРАФИЯ 1. ИСО 707:2008 [<*>](#p100306) Молоко и молочные продукты. Руководящие указания по подбору проб 2. ИСО 5725-1:2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения 3. ИСО 5725-2:2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений -------------------------------- <*> Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе соответствующего ИСО. ------------------------------------------------------------------