---
title: "\"ГОСТ Р 52996-2008 (ИСО 11816-1:2006). Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов\""
number: "ГОСТ Р 52996-2008"
issuer: "Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/gost-r-52996-2008"
---

## "ГОСТ Р 52996-2008 (ИСО 11816-1:2006). Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов"

# "ГОСТ Р 52996-2008 (ИСО 11816-1:2006). Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов"

(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 06.11.2008 N 289-ст)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза "О безопасности молока и молочной продукции" (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования" (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 N 80).
> Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимых для применения и исполнения Федерального закона "Технический регламент на молоко и молочную продукцию" и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 15.12.2008 N 1866-р).
> Документ [введен](#p100012) в действие с 01.01.2010.


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утвержден и введен в действие<br>
Приказом Федерального<br>
агентства по техническому<br>
регулированию и метрологии

</div>

от 6 ноября 2008 г. N 289-ст

<a id="p100002"></a>**НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100003"></a>**МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ**

<a id="p100004"></a>**ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ**

<a id="p100005"></a>**ЧАСТЬ 1**

<a id="p100006"></a>**ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ДЛЯ МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ**

<a id="p100007"></a>Milk and milk products. Determination of alkaline
phosphatase activity. Part 1. Fluorimetric
method for milk and milk products

<a id="p100008"></a>**ISO 11816-1:2006**
Milk and milk products - Determination of alkaline
phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric
method for milk and milk-based drinks
**(MOD)**

<a id="p100009"></a>**ГОСТ Р 52996-2008**
**(ИСО 11816-1:2006)**

<div align="right">

<a id="p100010"></a>Группа Н09

<a id="p100011"></a>ОКС 67.100

<a id="p100012"></a>Дата введения

</div>

1 января 2010 года


### <a id="p100013"></a>Предисловие


<a id="p100014"></a>Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. N 184-ФЗ "О техническом регулировании", а правила применения национальных стандартов Российской Федерации - ГОСТ Р 1.0-2004 "Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения".


### <a id="p100015"></a>Сведения о стандарте


1. <a id="p100016"></a>Подготовлен ОАО "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" (ОАО "ВНИИС") на основе аутентичного перевода международного стандарта, указанного в пункте 4.
2. <a id="p100017"></a>Внесен Техническим комитетом стандартизации ТК 335 "Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность".
3. <a id="p100018"></a>Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 6 ноября 2008 г. N 289-ст.
4. <a id="p100019"></a>Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту 11816-1:2006 "Молоко и молочные продукты. Определение активности щелочной фосфатазы. Часть 1. Флуориметрический метод для молока и молочных продуктов" (ISO 11816-1:2006 "Milk and milk products - Determination of alkaline phosphatase activity - Part 1: Fluorimetric method for milk and milk-based drinks").
<a id="p100020"></a>При этом дополнительные слова, фразы, абзацы, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом.
5. <a id="p100021"></a>Введен впервые.

<a id="p100022"></a>Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты", а текст изменений и поправок - в ежемесячно издаваемых информационных указателях "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.


### 1. <a id="p100023"></a>Область применения


<a id="p100024"></a>Настоящий стандарт устанавливает флуориметрический метод для определения активности щелочной фосфатазы (ALP) в пастеризованном цельном, полужирном и обезжиренном молоке. Метод применим для молока коров, овец, коз и для молочных напитков.
<a id="p100025"></a>Метод также пригоден для определения высокой активности щелочной фосфатазы в сыром и термообработанном молоке с активностью более 2000 мЕ/л после заданного разбавления образца.


### 2. <a id="p100026"></a>Нормативные ссылки


<a id="p100027"></a>В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
<a id="p100028"></a>[ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-1-2002) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
<a id="p100029"></a>[ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-2-2002) Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
<a id="p100030"></a>[ГОСТ 26809-86](https://bukva.ai/docs/gost-26809-86) Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу.

<a id="p100031"></a>*Примечание.* При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю "Национальные стандарты", который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.


### 3. <a id="p100032"></a>Термины и определения


<a id="p100033"></a>В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
<a id="p100034"></a>3.1. Активность щелочной фосфатазы (ALP активность): активность щелочной фосфатазы, присутствующей в продукте, определенная методом, установленным настоящим стандартом.
<a id="p100035"></a>*Примечание.* Активность щелочной фосфатазы выражена в миллиединицах активности фермента на литр, мЕ/л.

<a id="p100036"></a>3.2. Единица активности щелочной фосфатазы: объем фермента щелочной фосфатазы, который катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в минуту.


### 4. <a id="p100037"></a>Сущность метода


<a id="p100038"></a>Активность щелочной фосфатазы для образца измеряется путем непрерывного флуориметрического прямого кинетического анализа. В субстрате нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира, 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат, в присутствии любой щелочной фосфатазы, образованной из этого образца, происходит гидролиз его фосфатного радикала, производя продукт с интенсивной флуоресценцией. Флуориметрическое измерение активности щелочной фосфатазы проводят при температуре 38 °C в течение трех минут, используя субстрат. Сюда включена преинкубация субстрата и образца с последующим многократным кинетическим считыванием скорости реакции.
<a id="p100039"></a>*Примечание.* Хотя испытание длится 3 мин, первая минута является равновесным периодом для обеспечения температуры образца 38 °C. Измерения активности фактически начинаются со второй минуты и продолжаются до конца третьей минуты (т.е. 2 мин).


### 5. <a id="p100040"></a>Реактивы


<a id="p100041"></a>Используются только реактивы признанной аналитической чистоты, если нет других указаний, и дистиллированная или деминерализованная вода или вода аналогичной чистоты.
<a id="p100042"></a>5.1. Субстрат Флуорофоса в пробирках, каждая из которых содержит 144 мг порошка Флуорофоса .
<a id="p100043"></a>Этот субстрат нефлуоресцентного ароматического монофосфорного эфира, 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол фосфат ( Флуорофоса ). Субстрат Флуорофос остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробирках при температуре от 2 °C до 8 °C.
<a id="p100044"></a>5.2. Буферный раствор субстрата, буферный раствор диэтаноламина (DEA), c (DEA) = 2,4 моль/дм3, с pH 10,0 в пробирках вместимостью 240 см3 каждая.
<a id="p100045"></a>Буферный раствор субстрата остается стабильным в течение двух лет, если его хранить в закрытых пробирках при температуре от 2 °C до 8 °C.

#### <a id="p100046"></a>5.3 Рабочий субстрат

<a id="p100047"></a>Оставляют субстрат Флуорофоса и буферный раствор субстрата до достижения комнатной температуры. Добавляют содержимое одной пробирки с буферным раствором субстрата (240 см3) к содержимому одной пробирки Флуорофоса (144 мг) (см. [5.1](#p100042)) и хорошо перемешивают, переворачивая, в течение 3 мин. Используют желтое стекло для защиты против света.
<a id="p100048"></a>Перед использованием полученный раствор выдерживают при комнатной температуре как минимум 30 мин.
<a id="p100049"></a>Используют аналого-цифровой тест, описанный в [9.4.1.1](#p100112), для проверки устойчивости готового к использованию субстрата.
<a id="p100050"></a>Рабочий субстрат остается стабильным в течение 60 дней, если он защищен от света и хранится при температуре от 2 °C до 8 °C, или в течение 8 ч, если хранится при 38 °C. Не следует использовать рабочий субстрат, если получено показание выше 1200.
<a id="p100051"></a>*Примечание.* Полученный объем рабочего субстрата (240 мл) является достаточным приблизительно для 115 тестов.

<a id="p100052"></a>5.4. Рабочие калибровочные растворы, Флуорожелтый (FY), 2'-[2-бензотиазолил]-6'-гидроксибензотиазол в буферном растворе DEA.
<a id="p100053"></a>Рабочие калибровочные растворы остаются стабильными в течение 18 мес, когда их хранят при температуре от 2 °C до 8 °C.
<a id="p100054"></a>5.4.1. Калибровочный раствор A, содержащий 0 мкмоль/дм3 Флуорожелтого .
<a id="p100055"></a>5.4.2. Калибровочный раствор B, содержащий $17,24 \cdot 10^{- 3}$ мкмоль/дм3 Флуорожелтого .
<a id="p100056"></a>5.4.3. Калибровочный раствор C, содержащий $34,48 \cdot 10^{- 3}$ мкмоль/дм3 Флуорожелтого .
<a id="p100057"></a>5.5. Раствор для ежедневного контроля прибора, содержащий $34,48 \cdot 10^{- 3}$ мкмоль/дм3 Флуорожелтого .


### 6. <a id="p100058"></a>Аппаратура


<a id="p100059"></a>6.1. Фильтрованный флуориметр с термостатически регулируемым держателем кюветы при поддержании температуры (38 +/- 1) °C и правоугольной оптической системой, допускающей возбуждение при длине волны 440 нм и испускание при 520 - 560 нм (например, прибор Флуорофос ).
<a id="p100060"></a>Измерения должны быть оптимизированы согласно инструкциям изготовителей.
<a id="p100061"></a>6.2. Кюветы сменные, из нефлуоресцентного стекла, диаметром 12 мм и длиной 75 мм.

#### <a id="p100062"></a>6.3 Пипетки.


##### <a id="p100063"></a>6.3.1 Дозатор фиксированного объема, дозирующий по 2,0 см3.

<a id="p100064"></a>6.3.2. Пипетка вытеснительного типа или нагнетательная вместимостью 0,075 см3.

##### <a id="p100065"></a>6.3.3 Пипетка вместимостью 2 см3.

<a id="p100066"></a>6.4. Инкубаторный блок, поддерживающий температуру (38 +/- 1) °C, подходящий для помещения в них кювет.

#### <a id="p100067"></a>6.5 Парафильм <1> или другая подходящая пленка лабораторного класса.


<a id="p100068"></a>

---

<a id="p100069"></a><1> Парафильм является примером подходящего продукта, выпускаемого в промышленности.


#### <a id="p100070"></a>6.6 Вихревая мешалка.

<a id="p100071"></a>6.7. Водяная баня, поддерживающая температуру (63 +/- 1) °C и (95 +/- 1) °C.

#### <a id="p100072"></a>6.8 Мерные колбы с одной меткой вместимостью 100 см3.



### 7. <a id="p100073"></a>Отбор проб


<a id="p100074"></a>В лабораторию должна быть отправлена представительная проба. Ее следует оберегать от повреждений во время транспортирования или хранения.
<a id="p100075"></a>Рекомендуется отбор проб проводить по [ГОСТ Р 26809](https://bukva.ai/docs/gost-26809-86) и [[1].](#p100211)


### 8. <a id="p100076"></a>Подготовка к испытанию



#### <a id="p100077"></a>8.1 Молоко, не содержащее щелочной фосфатазы

<a id="p100078"></a>Приготовляют молоко без фосфатазы для испытания, тщательно дозируя требуемую порцию молока в пробирку или подходящий контейнер, следя, чтобы оно не касалось краев или стенок контейнера.
<a id="p100079"></a>Помещают пробирку или контейнер с образцом молока в водяную баню, установленную на 95 °C, нагревают до 95 °C и продолжают его подогрев в течение 5 мин при этой температуре. Температуру контролируют термометром или термисторным зондом, помещенным в центр пробирки или контейнера. Затем образец быстро охлаждают.
<a id="p100080"></a>Таким образом обработанный образец молока тестируют, чтобы удостовериться, что активность щелочной фосфатазы меньше 10 мЕ/л.

#### <a id="p100081"></a>8.2 Приготовление образца для испытаний


##### <a id="p100082"></a>8.2.1 Общие вопросы

<a id="p100083"></a>Перед использованием все испытуемые образцы тщательно перемешивают, не нагревая.

##### <a id="p100084"></a>8.2.2 Пастеризованные испытуемые образцы

<a id="p100085"></a>Пастеризованные испытуемые образцы используют в состоянии после поставки в требуемых количествах.

##### <a id="p100086"></a>8.2.3 Разбавление испытуемых образцов с высокими значениями ALP

<a id="p100087"></a>Приготовляют разбавленные образцы молока, используя молоко без фосфатазы, для того чтобы их уровни активности щелочной фосфатазы ALP соответствовали аналитическому диапазону испытания (< 2000 мЕ/л). Разбавленные растворы хорошо перемешивают.


### 9. <a id="p100088"></a>Проведение испытаний



#### <a id="p100089"></a>9.1 Проверка рабочих характеристик прибора

<a id="p100090"></a>Важно, чтобы до проведения испытания образцов была проведена проверка рабочих характеристик прибора на отклонение, рассеянное световое излучение и стабильность. Все параметры фильтрованного флуориметра должны соответствовать требованиям [6.1.](#p100059)
<a id="p100091"></a>Контрольные тесты качества включают:
- <a id="p100092"></a>ежедневный тест A/D (аналого-цифровое преобразование), выполняемый для проверки правильности функционирования оборудования путем измерения точности канала A/D преобразования и мониторинга A/D канала на отклонение по времени или температуре;
- <a id="p100093"></a>ежедневный контрольный тест прибора с использованием ежедневного контрольного раствора в приборе для мониторинга любого электронного или оптического отклонения флуориметра.
<a id="p100094"></a>Использование контрольных проверок системы и реактивов, описанных в [9.4](#p100110), настоятельно рекомендуется для ежедневного мониторинга параметров точности прибора.

#### <a id="p100095"></a>9.2 Калибровка прибора

<a id="p100096"></a>Калибровочные кривые обычно стабильны. Прибор следует калибровать каждые три месяца. Однако в случае, когда флуориметр устанавливают впервые, или если процедуры обслуживания влияют на сохраненную калибровку, или если проверенные контрольные значения показывают неприемлемые результаты, то его калибруют повторно.
<a id="p100097"></a>Если обнаружены изменения в калибровочной кривой, прибор также калибруют повторно, используя новый набор калибровочных растворов A, B и C (см. [5.4](#p100052)). Калибровочную кривую устанавливают для каждого типа испытуемого продукта.
<a id="p100098"></a>Перед использованием калибровочные растворы A, B и C смешивают, плавно переворачивая. С помощью пипетки переносят по 2,0 см3 калибровочных растворов A, B и C соответственно, каждого в двух экземплярах, в шесть предварительно маркированных кювет. Помещают кюветы в инкубаторный блок, установленный на 38 °C, и предварительно нагревают в течение 10 мин.
<a id="p100099"></a>С помощью нагнетательной или вытеснительной пипетки добавляют 0,075 см3 молока, не содержащего щелочной фосфатазы, в шесть кювет. Закрывают кюветы парафильмом (см. [6.5](#p100067)). Перемешивают их содержимое с помощью вихревой мешалки в течение 5 с или путем мягкого переворачивания кювет. Возвращают кюветы в инкубационный блок. Выполняют калибровку в течение 10 мин после добавления испытуемого образца в калибровочный раствор.
<a id="p100100"></a>Начиная с калибровочного раствора A, выполняют следующие установившиеся процедуры калибровки. Перед помещением кювет в фильтровальный Флуорофос нажимают "CALIB" и выбирают меню "ALP Diary" (щелочная фосфатаза в молочных продуктах). Прокручивают меню и, когда отображается продукт, который должен калиброваться, нажимают "ENTER". Начиная с калибровочного раствора A, помещают этот раствор во флуориметр и нажимают "START". Когда измерение закончено, измеряют второй калибровочный раствор A.
<a id="p100101"></a>Такую же процедуру выполняют для калибровочных растворов B и C, пока все процедуры не будут закончены. Прибор Флуорофос автоматически вычисляет значение флуоресценции, полученное с калибровочными растворами B и C в сравнении с калибровочным раствором A, чтобы установить калибровочный коэффициент прибора.
<a id="p100102"></a>Когда калибровка выполнена, приступают к анализу испытуемых образцов.

#### <a id="p100103"></a>9.3 Определение

<a id="p100104"></a>С помощью дозатора фиксированного объема переносят 2,0 см3 субстрата в маркированную кювету. Помещают кювету в инкубаторный блок, установленный на 38 °C, и нагревают в течение 15 мин.
<a id="p100105"></a>С помощью пипетки добавляют 0,075 см3 хорошо перемешанного испытуемого образца (см. [8.2.2](#p100084) или [8.2.3](#p100086)) к субстрату. Накрывают кювету парафильмом (см. [6.5](#p100067)). Сразу же перемешивают ее содержимое, используя вихревую мешалку (см. [6.6](#p100070)) в течение 5 с или плавно переворачивая кювету. Вытирают кювету снаружи мягкой тканью и помещают ее в фильтровальный флуориметр.
<a id="p100106"></a>Нажимают клавишу "TEST", появляется надпись "ALP Diary", затем нажимают "ENTER". Прокручивают меню и нажимают "ENTER", когда отображается продукт, который должен анализироваться. Затем нажимают клавишу "START", чтобы начать испытание. На дисплее будет идти обратный отсчет 60 с, пока субстрат и образец нагреется до 38 °C. Через 60 с флуориметр начинает измерение, показывая флуоресценцию образца в единицах флуоресценции (FLU). Отображение начинается с 200 FLU и медленно возрастает в течение следующих двух минут. В конце третьей минуты периода прибор Флуорофос автоматически выполняет необходимые вычисления и отображает идентификационный номер образца, активность ALP в миллиединицах на литр и среднее увеличение флуоресценции, если это было предварительно задано. Затем эта информация будет напечатана.
<a id="p100107"></a>Делят разность между двумя показаниями флуоресценции на время интервала (записанное в минутах), чтобы получить среднее увеличение флуоресценции в минуту (F/мин). Используют значение F/мин, чтобы вычислить активность ALP для испытуемого образца.
<a id="p100108"></a>Прибор может отобразить на дисплее и распечатать сообщение "Error: Unstable Reading, Repeat Test" (Ошибка. Нестабильное показание. Повторить испытание). В случае очень высоких результатов нужно разбавить испытуемый образец термообработанным молоком, не содержащим фосфатазы, и провести другое испытание.
<a id="p100109"></a>Для очень низких результатов (обычно 6 FLU/мин), когда нестабильные показания получаются чаще, оставляют кювету с образцом в камере Флуорофос и проводят другое определение. Тогда обычно получается действительный результат. Однако, если снова возникает ошибка из-за нестабильных показаний, повторяют все определение с новым испытуемым образцом.

#### <a id="p100110"></a>9.4 Контрольные тесты


##### <a id="p100111"></a>9.4.1 Контрольные проверки системы и реагентов


###### <a id="p100112"></a>9.4.1.1 Тест A/D

<a id="p100113"></a>При использовании прибора Флуорофос тест A/D проводят ежедневно перед испытанием.
<a id="p100114"></a>Отмеряют 2,0 см3 ежедневного контрольного раствора для прибора в маркированную кювету. Помещают кювету в инкубаторный блок, установленный на 38 °C, на 10 мин.
<a id="p100115"></a>Получают доступ к тесту A/D через меню "SETUP". Нажимают клавишу "SETUP", затем выбирают пункт меню "A/D Test", нажимая <or>. При пустом держателе кюветы нажимают "START". Ждут, когда цифры, появляющиеся на экране дисплея, стабилизируются.
<a id="p100116"></a>Показание дисплея должно быть 302 +/- 4. Если показание вне этого диапазона, очищают фильтры возбуждения и испускания и повторяют тест A/D.
<a id="p100117"></a>Вставляют предварительно нагретую кювету в держатель кюветы. Закрывают крышкой. Когда показание дисплея стабильно, записывают отображаемое значение, которое должно быть 602 +/- 12. Если значение вне этого диапазона, используют маленькую отвертку из поставки и медленно поворачивают винт потенциометра с левой стороны прибора по часовой стрелке или против, как необходимо, пока показание дисплея не будет 602.
<a id="p100118"></a>Тест A/D можно также использовать для проверки пригодности готового к использованию рабочего субстрата. Только что приготовленный субстрат в режиме A/D обычно дает показание около 650 FLU, которое увеличивается со временем.
<a id="p100119"></a>Не следует использовать рабочий субстрат, когда на дисплее получено показание выше 1200 FLU.

###### <a id="p100120"></a>9.4.1.2 Позитивный, негативный и $PhosphaCheck - N^{TM}$ (контроль фосфатазы) механизмы контроля

<a id="p100121"></a>После калибровки канала, используемого для коровьего молока, анализируют три контрольных раствора (т.е. позитивный, негативный и $PhosphaCheck - N^{TM}$ ) путем добавления 75 мм3 каждого контрольного раствора к 2 см3 предварительно нагретого субстрата. Выполняют тест ALP.
<a id="p100122"></a>Показание для негативного контроля должно быть < 10, а для $PhosphaCheck - N^{TM}$ < 40.

##### <a id="p100123"></a>9.4.2 Испытуемый образец и механизмы контроля, связанные с прибором


###### <a id="p100124"></a>9.4.2.1 Тест негативного контроля

<a id="p100125"></a>Включают тест негативного контроля с каждой партией испытуемых образцов. Нагревают испытуемый образец, как описано в [8.1](#p100077). Показание прибора должно быть меньше 10 мЕ/л, то есть флуоресцентная активность не детектируется. Если значение превышает 10 мЕ/л, повторяют действие [9.4.1.2](#p100120).

###### <a id="p100126"></a>9.4.2.2 Тест позитивного контроля

<a id="p100127"></a>Включают один или больше механизмов позитивного контроля с каждой партией испытуемых образцов. Приготовляют образцы аналогичного или почти аналогичного состава, используя образцы сырого молока, разбавленные молоком без фосфатазы.

##### <a id="p100128"></a>9.4.3 Тест на интерферирующие вещества

<a id="p100129"></a>Если значения ALP получены выше ожидаемых, добавляют в кювету с помощью пипетки 0,075 см3 испытуемого образца и 2,0 см3 калибровочного раствора A, который предварительно нагревали в инкубаторном блоке, установленном на 39 °C, в течение 10 мин, и перемешивают.
<a id="p100130"></a>Помещают кювету с этой смесью в прибор Флуорофос и испытывают, как в [9.2](#p100095). Если полученное значение превышает 20 мЕ/л, значит, присутствует интерферирующее вещество. В этом случае повторяют испытание со свежим образцом.

##### <a id="p100131"></a>9.4.4 Контрольный тест на теплостойкую щелочную фосфатазу

<a id="p100132"></a>Добавляют другой испытуемый образец в пробирку. Вставляют термометр или термисторный зонд в пробирку и все помещают в водяную баню, установленную на 63 °C. Когда испытуемый образец нагревают до 63 °C, его выдерживают при этой температуре 30 мин, затем быстро охлаждают. Определяют остаточную активность фосфатазы согласно [9.3](#p100103). Любая остаточная активность обусловлена присутствием теплостойкой микробной щелочной фосфатазы.


### 10. <a id="p100133"></a>Вычисление и выражение результатов



#### <a id="p100134"></a>10.1 Калибровочный коэффициент

<a id="p100135"></a>Результаты вычисляют автоматически прибором Флуорофос посредством алгоритма, встроенного в фильтровальный флуориметр. Если результаты будут вычисляться вручную, действуют следующим образом.
<a id="p100136"></a>Записывают значения флуоресценции калибровочных растворов B и калибровочного раствора C (см. [5.4.3](#p100056)), сравнивают с калибровочным раствором A (см. [5.4.1](#p100054)), установленным на нулевую флуоресценцию на фильтровальном флуориметре.
<a id="p100137"></a>Калибровочный коэффициент K вычисляют по формуле

<a id="p100138"></a> $K = \frac{F_{C} + 2F_{B}}{4}$ , (1)

<a id="p100139"></a>где $F_{C}$ - значение флуоресценции, полученное путем измерения калибровочного раствора C в сравнении с калибровочным раствором A, установленным на нулевую флуоресценцию (см. [9.2](#p100095));
<a id="p100140"></a> $F_{B}$ - числовое значение флуоресценции, полученное путем измерения калибровочного раствора B в сравнении с калибровочным раствором A, установленным на нулевую флуоресценцию (см. [9.2](#p100095)).

#### <a id="p100141"></a>10.2 Вычисление ALP

<a id="p100142"></a>Активность щелочной фосфатазы $A_{P}$ , мЕ/л, вычисляют по формуле

<div align="center">

<a id="p100143"></a> $A_{P} = \frac{F_{av}c_{B}}{KV} f$ , (2)

</div>


<a id="p100144"></a>где $F_{av}$ - среднее значение флуоресценции, производимой в минуту (см. [9.3](#p100103)), измеренное в сравнении с калибровочным раствором A (см. [9.2](#p100095)) от начала второй минуты до конца третьей;
<a id="p100145"></a> $C_{B}$ - концентрация Флуорожелтого в калибровочном растворе B в микромолях на 2 см3 калибровочного раствора;
<a id="p100146"></a>K - калибровочный коэффициент по [(1)](#p100138), см3;
<a id="p100147"></a>V - объем испытуемого образца;
<a id="p100148"></a>f - коэффициент разбавления $(1 \cdot 10^{6})$ для пастеризованных образцов; для испытуемых образцов сырого молока f равно $1 \cdot 10^{8}$ ; для испытуемых образцов термообработанного молока умножают $f = 1 \cdot 10^{6}$ на коэффициент разбавления $f_{t}$ испытуемого образца $(f = f_{t} \cdot 10^{6})$ .

#### <a id="p100149"></a>10.3 Выражение результатов испытания

<a id="p100150"></a>Результаты испытания выражают с точностью до ближайшего целого знака миллиединицы.


### 11. <a id="p100151"></a>Прецизионность


<a id="p100152"></a>Прецизионность метода и результатов измерений рассчитывают по [ГОСТ Р ИСО 5725-1](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-1-2002) и [ГОСТ Р ИСО 5725-2](https://bukva.ai/docs/gost-r-iso-5725-2-2002).

#### <a id="p100153"></a>11.1 Межлабораторное испытание

<a id="p100154"></a>Детали межлабораторного испытания приведены в [Приложении A](#p100181). Значения, полученные из этого испытания, можно применять для других диапазонов и матриц.

#### <a id="p100155"></a>11.2 Повторяемость

<a id="p100156"></a>Абсолютная разность между двумя независимыми результатами единичных испытаний, полученными одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в одной и той же лаборатории одним и тем же оператором, использующим одно и то же оборудование, в течение короткого интервала времени, должна не более чем в 5% случаев превышать значения для r, приведенные в таблице 1.

<div align="right">

<a id="p100157"></a>Таблица 1

</div>


<a id="p100158"></a>Значения предела повторяемости r


<table>
<colgroup><col width="23%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="15%"><col width="16%"><col width="16%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Продукт</td><td colspan="5">Уровень активности щелочной фосфатазы, мЕ/л</td></tr>
<tr><td>20</td><td>40</td><td>100</td><td>350</td><td>500</td></tr>
<tr><td>Коровье молоко</td><td>-</td><td>21,50</td><td>22,10</td><td>89,60</td><td>93,30</td></tr>
<tr><td>Овечье молоко</td><td>10,43</td><td>16,26</td><td>33,67</td><td>96,82</td><td>99,76</td></tr>
<tr><td>Козье молоко</td><td>8,63</td><td>7,98</td><td>26,20</td><td>42,83</td><td>28,56</td></tr>
</table>



#### <a id="p100164"></a>11.3 Воспроизводимость

<a id="p100165"></a>Абсолютная разность между двумя результатами единичных испытаний, полученными одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях разными операторами, использующими разное оборудование, должна не более чем в 5% случаев превышать значения для R, приведенные в таблице 2.

<div align="right">

<a id="p100166"></a>Таблица 2

</div>


<a id="p100167"></a>Значения предела воспроизводимости R


<table>
<colgroup><col width="22%"><col width="15%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="15%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2">Продукт</td><td colspan="5">Уровень активности щелочной фосфатазы, мЕ/л</td></tr>
<tr><td>20</td><td>40</td><td>100</td><td>350</td><td>500</td></tr>
<tr><td>Коровье молоко</td><td>-</td><td>31,80</td><td>51,00</td><td>136,40</td><td>211,10</td></tr>
<tr><td>Овечье молоко</td><td>16,63</td><td>20,34</td><td>46,63</td><td>170,24</td><td>233,10</td></tr>
<tr><td>Козье молоко</td><td>10,69</td><td>20,55</td><td>28,71</td><td>127,89</td><td>87,51</td></tr>
</table>



### 12. <a id="p100173"></a>Протокол испытания


<a id="p100174"></a>Протокол испытания должен включать в себя:
- <a id="p100175"></a>всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
- <a id="p100176"></a>метод отбора проб и приготовления образцов, если известно;
- <a id="p100177"></a>используемый метод испытания;
- <a id="p100178"></a>все рабочие детали или рассматриваемые как факультативные, а также детали всех инцидентов, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;
- <a id="p100179"></a>полученный(е) результат(ы) или, если проверялась повторяемость, окончательно указанный полученный результат.





<div align="right">

<a id="p100180"></a>Приложение A

</div>

<div align="center">

(справочное)

<a id="p100181"></a>**МЕЖЛАБОРАТОРНОЕ ИСПЫТАНИЕ**

</div>


<a id="p100182"></a>Межлабораторное испытание, включающее 13 лабораторий из семи стран (США, Великобритания, Франция, Норвегия, Италия, Нидерланды и Швейцария), проводилось согласно [[2]](#p100212) и [[3]](#p100213) на четырех типах коровьего молока и на овечьем и козьем молоке. Испытание было закончено в марте 2004 г.
<a id="p100183"></a>Полученные результаты были подвергнуты статистическому анализу согласно [[2]](#p100212) и [[3]](#p100213), из которого получены данные прецизионности, приведенные в таблицах A.1 и [A.2](#p100198). Данные выражены как значения относительного стационарного отклонения в процентах и представляют сводные статистические результаты межлабораторного исследования. Общий отчет об исследовании опубликован в [[4]](#p100214).

<div align="right">

<a id="p100184"></a>Таблица A.1

</div>


<div align="center">

<a id="p100185"></a>Относительное стандартное отклонение повторяемости

</div>


<a id="p100186"></a>                                                                В процентах

<table>
<colgroup><col width="12%"><col width="30%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="11%"><col width="11%"><col width="12%"></colgroup>
<tr><td colspan="2" rowspan="2">Продукт</td><td colspan="5">Уровень активности щелочной фосфатазы, мЕ/л</td></tr>
<tr><td>20</td><td>40</td><td>100</td><td>350</td><td>500</td></tr>
<tr><td rowspan="5">Коровье молоко</td><td>Цельное</td><td>16,20</td><td>22,51</td><td>6,79</td><td>4,60</td><td>8,37</td></tr>
<tr><td>Полужирное</td><td>13,15</td><td>13,19</td><td>7,53</td><td>12,72</td><td>2,97</td></tr>
<tr><td>Обезжиренное</td><td>-</td><td>13,09</td><td>7,94</td><td>5,32</td><td>5,84</td></tr>
<tr><td>Ароматизированное &lt;1&gt;</td><td>-</td><td>12,85</td><td>6,12</td><td>4,68</td><td>3,33</td></tr>
<tr><td>Коровье молоко (все)</td><td>-</td><td>18,66</td><td>7,69</td><td>8,89</td><td>6,48</td></tr>
<tr><td colspan="2">Овечье молоко</td><td>11,68</td><td>12,04</td><td>10,68</td><td>7,86</td><td>5,69</td></tr>
<tr><td colspan="2">Козье молоко</td><td>13,81</td><td>5,94</td><td>7,29</td><td>3,65</td><td>1,74</td></tr>
<tr><td colspan="7">&lt;1&gt; Для испытания ароматизированного молока использовали молоко с добавлением вкуса клубники.</td></tr>
</table>


<div align="right">

<a id="p100197"></a>Таблица A.2

</div>


<div align="center">

<a id="p100198"></a>Относительное стандартное отклонение воспроизводимости

</div>


                                                                В процентах

<table>
<colgroup><col width="11%"><col width="30%"><col width="11%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="12%"><col width="12%"></colgroup>
<tr><td colspan="2" rowspan="2">Продукт</td><td colspan="5">Уровень активности щелочной фосфатазы, мЕ/л</td></tr>
<tr><td>20</td><td>40</td><td>100</td><td>350</td><td>500</td></tr>
<tr><td rowspan="5">Коровье молоко</td><td>Цельное</td><td>16,20</td><td>25,44</td><td>15,96</td><td>6,60</td><td>17,29</td></tr>
<tr><td>Полужирное</td><td>24,30</td><td>17,19</td><td>16,45</td><td>16,86</td><td>9,79</td></tr>
<tr><td>Обезжиренное</td><td>-</td><td>27,21</td><td>19,01</td><td>9,81</td><td>12,37</td></tr>
<tr><td>Ароматизированное &lt;1&gt;</td><td>-</td><td>22,13</td><td>11,26</td><td>10,47</td><td>9,50</td></tr>
<tr><td>Коровье молоко (все)</td><td>-</td><td>27,60</td><td>17,69</td><td>13,53</td><td>14,66</td></tr>
<tr><td colspan="2">Овечье молоко</td><td>18,62</td><td>15,07</td><td>14,79</td><td>13,82</td><td>13,30</td></tr>
<tr><td colspan="2">Козье молоко</td><td>17,11</td><td>15,31</td><td>7,98</td><td>10,91</td><td>5,33</td></tr>
<tr><td colspan="7">&lt;1&gt; Для испытания ароматизированного молока использовали молоко с добавлением вкуса клубники.</td></tr>
</table>


<a id="p100209"></a>*Примечание.* В некоторых случаях было недостаточно данных для коровьего молока, чтобы вычислить значения r и R при уровне активности 20 мЕ/л. Причина в том, что прибор Флуорофос записывает значение < 10 мЕ/л для очень низких значений ALP и нет принятого статистического механизма для обработки такого результата. Это означает, что все результаты, правильно записанные как < 10 мЕ/л, пришлось исключить из статистических вычислений.






## <a id="p100210"></a>БИБЛИОГРАФИЯ



1. <a id="p100211"></a>ИСО 707:1997        Молоко и молочные продукты. Руководящие указания
   по подбору проб
2. <a id="p100212"></a>ИСО 5725-1:1994     Точность (правильность и прецизионность) методов
   и результатов измерений. Часть 1. Общие принципы
   и определения
3. <a id="p100213"></a>ИСО 5725-2:1994     Точность (правильность и прецизионность) методов
   и результатов измерений. Часть 2. Основной метод
   для определения повторяемости и воспроизводимости
   стандартного метода измерения
4. <a id="p100214"></a>HARDING, F and      Collaborative evaluation of a fluometric method
   GARRY, E            for measuring alkaline phosphatase activity
   in cow's, sheep's and goat's milk. J. Food Prot,
   68(5), 2005, pp. 1047-1053.
   <a id="p100215"></a>------------------------------------------------------------------