ГОСТ Р 52831-2007 (ИСО 14674:2005). Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M1. Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии

(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 27.12.2007 № 458-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 52831-2007"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-52831-2007" "ГОСТ Р 52831-2007. Национальный стандарт Российской Федерации. Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M1. Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и... (ут"
  n1["ГОСТ 31709-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-31709-2012" "ГОСТ 31709-2012. Межгосударственный стандарт. Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M1. Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью.."
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 27 декабря 2007 г. № 458-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОЛОКО И СУХОЕ МОЛОКО

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ АФЛАТОКСИНА M_{1} . ОЧИСТКА С ПОМОЩЬЮ ИММУНОАФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Milk and milk powder. Determination of aflatoxin M_{1} content. Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography

ISO 14674:2005 Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M_{1} content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography (MOD)

ГОСТ Р 52831-2007 (ИСО 14674:2005)

1 января 2009 года

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Подготовлен ОАО «Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации» (ОАО «ВНИИС») на основе русской версии стандарта, указанного в пункте 4, который выполнен ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ».

2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. № 458-ст.

4. Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ИСО 14674:2005 «Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M_{1} . Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью тонкослойной хроматографии» (ISO 14674:2005 «Milk and milk powder — Determination of aflatoxin M_{1} content — Clean-up by immunoaffinity chromatography and determination by thin-layer chromatography»). При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребностей национальной экономики Российской Федерации и особенностей российской национальной стандартизации, выделены курсивом.

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов национальным стандартам Российской Федерации, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в дополнительном Приложении B.

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

#Настоящий стандарт распространяется на молоко и сухое молоко и устанавливает метод определения содержания афлатоксина M_{1} с помощью тонкослойной хроматографии с предварительной очисткой с использованием иммуноаффинной хроматографии.#

Минимально определяемое количество афлатоксина M_{1} составляет 2 нг, что соответствует около 0,10 мкг/дм3 для молока или разбавленного сухого молока.

2. #Нормативные ссылки#

#В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений

ГОСТ Р 52501-2005 Вода для лабораторного анализа. Технические условия

ГОСТ Р 52738-2007 Молоко и продукты переработки молока. Термины и определения

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия

ГОСТ 5789-78 Реактивы. Толуол. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 20015-88 Хлороформ. Технические условия

ГОСТ 22300-76 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования#

Примечание. При использовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

#В настоящем стандарте применяют термины по ГОСТ Р 52738, а также следующие термины с соответствующими определениями:#

3.1. Содержание афлатоксина M_{1} : #массовая концентрация# афлатоксина M_{1} , #выраженная в мкг/дм3, — для молока или массовая доля афлатоксина M_{1} , выраженная в мкг/кг, — для сухого молока#, определенная методом, установленным в настоящем стандарте.

3.2. #Аналитический выход (recovery): отношение массы, массовой доли или массовой концентрации определяемого компонента, найденное данным методом, к действительному значению соответствующей величины в исходном образце.#

#4. Сущность метода#

#Афлатоксин M_{1} экстрагируют, пропуская пробу через иммуноаффинную колонку, содержащую специфические антитела, связанные с твердым материалом субстрата. Когда проба проходит через колонку, антитела селективно связываются с любым присутствующим афлатоксином M_{1} (антигеном) и образуют комплекс антитело-антиген.# Все другие компоненты основного состава пробы вымываются из колонки водой. Затем афлатоксин M_{1} элюируют из колонки смесью ацетонитрил/метанол. В соответствии с концентрацией элюата количество афлатоксина M_{1} определяют методом однонаправленной тонкослойной хроматографии. В случае возникновения помех проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию, чтобы отделить афлатоксин M_{1} от примесей.

5. Реактивы

#При отсутствии специальных указаний используют реактивы только признанных аналитических марок.

Вода должна соответствовать требованиям квалификации не ниже 3-й степени чистоты согласно ГОСТ Р 52501. Вода не должна содержать органические примеси.#

5.1 Чистые растворители

5.1.1 Хлороформ #по ГОСТ 20015#.

5.1.2 Ацетонитрил #[1]#.

5.1.3 Диэтиловый эфир по #ГОСТ 22300#.

5.1.4 Метанол по #ГОСТ 6995#.

5.1.5 Толуол по #ГОСТ 5789#.

5.1.6 Ацетон по #ГОСТ 2603#.

5.1.7 Изопропанол #[2]#.

5.2. #Смесь# ацетонитрил/метанол, #в объемном соотношении 3:2

Смесь приготовляют, добавляя 30 см3 ацетонитрила# (см. 5.1.2) к 20 см3 метанола (см. 5.1.4), и перемешивают.

5.3. #Смесь# толуол/ацетонитрил, #в объемном соотношении 9:1

Смесь приготовляют, добавляя 9 см3 толуола# (см. 5.1.5) к 1 см3 ацетонитрила (см. 5.1.2), и перемешивают. Этот раствор используют для повторного суспендирования #стандартных# растворов афлатоксина M_{1} (см. 5.5) и выпаренного элюата перед #проведением анализа методом тонкослойной хроматографии.#

5.4. #Растворители для проведения тонкослойной хроматографии#

5.4.1 Раствор для однонаправленной #тонкослойной хроматографии#

Приготовляют 100 см3 раствора для однонаправленной #тонкослойной хроматографии# путем добавления 4 см3 метанола (см. 5.1.4) и 1 см3 воды к 95 см3 диэтилового эфира (см. 5.1.3) и тщательно перемешивают (объемное отношение 95:4:1).

5.4.2 Раствор для двунаправленной #тонкослойной хроматографии#

Приготовляют 100 см3 раствора для двунаправленной тонкослойной хроматографии путем добавления 10 см3 ацетона (см. 5.1.6) и 3 см3 изопропанола (см. 5.1.7) к 87 см3 хлороформа (см. 5.1.1) и тщательно перемешивают (объемное отношение 87:10:3).

5.5. #Стандартный# раствор афлатоксина M_{1}

5.5.1. #Основной стандартный# раствор афлатоксина M_{1}

Приготовляют #основной стандартный# раствор афлатоксина M_{1} с номинальной концентрацией афлатоксина M_{1} 10 мкг/см3 (см. 5.1.1) путем повторного суспендирования 10 мкг лиофилизированной пленки афлатоксина M_{1} в 1 см3 хлороформа.

Согласно протоколу AOAC [3] концентрацию основного стандартного раствора афлатоксина M_{1} определяют путем измерения его #оптической плотности при длине волны максимального поглощения в диапазоне длин волн 200 — 400 нм относительно хлороформа (см. 5.1.1), применяемого в качестве образца сравнения#.

Контролируют чистоту афлатоксина M_{1} , регистрируя спектр в интервале 200 — 400 нм. Измеряют #оптическую плотность# (A) при длине волны максимума поглощения (\lambda_{\text{макс}}) , близкой к 365 нм.

Вычисляют массовую концентрацию c, мкг/см3, по формуле

c = AM \cdot 100/\epsilon , (1)

где A — числовое значение #оптической плотности#, измеренной при (\lambda_{\text{макс}}) ;

M — числовое значение молярной массы афлатоксина M_{1} , г/моль (M = 328 г/моль);

\epsilon — числовое значение #молярного# коэффициента поглощения афлатоксина M_{1} в хлороформе, м2/моль (\epsilon = 1995\text{м}^{2}/\text{моль}) .

#Основной стандартный# раствор афлатоксина M_{1} #хранят# в хорошо закупоренном пузырьке #из темного стекла#, защищенном от света при температуре ниже 0 °C. #Срок хранения основного стандартного раствора афлатоксина M_{1} — один год.#

5.5.2. #Рабочий стандартный# раствор афлатоксина M_{1}

5.5.2.1 Рабочий раствор A

Используют мерную пипетку или микрошприц типа Гамильтон <1> (см. 6.2) для помещения 50 мм3 рабочего стандартного раствора афлатоксина M_{1} (см. 5.5.1) в пузырек. #Раствор упаривают досуха.# Повторно суспендируют #сухой остаток# с 500 мм3 #смеси# толуол/ацетонитрил (см. 5.3), чтобы получить #рабочий стандартный# раствор афлатоксина M_{1} с концентрацией 1 мкг/см3 (рабочий раствор A). Раствор A используют для нанесения его на пластинки #для тонкослойной хроматографии при исследовании проб# с высоким уровнем загрязнения или когда #массовая концентрация афлатоксина M_{1} близка# к 0,50 мкг/дм3.

5.5.2.2 Рабочий раствор B

Помещают 100 мм3 раствора A в пузырек. Добавляют 900 мм3 смеси толуол/ацетонитрил (см. 5.3), чтобы получить рабочий стандартный раствор афлатоксина M_{1} с концентрацией 0,1 мкг/см3 (рабочий раствор B). Раствор B используют для нанесения его на пластинки тонкослойной хроматографии при исследовании проб с низким уровнем загрязнения или когда #массовая концентрация афлатоксина M_{1} близка# к 0,10 мкг/дм3.

6. #Средства измерений и оборудование#

#Используют# обычное лабораторное оборудование и, в частности:

6.1 Мерные пипетки требуемой #вместимости по ГОСТ 29227#.

6.2 Микрошприцы типа Гамильтон <1>.

<1> #Шприцы типа Гамильтон являются примером коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.#

6.3. Лабораторную стеклянную посуду: стеклянные колбы и воронки соответствующей #вместимости по ГОСТ 25336#.

6.4. Колбу мерную с одной меткой #вместимостью# 200 см3 #по ГОСТ 1770#.

6.5. Цилиндр мерный #вместимостью# 100 см3 #по ГОСТ 1770#.

6.6 Одноразовые шприцы #вместимостью# 10 и 100 см3.

6.7. Стеклянную #пробирку с коническим дном вместимостью# 5 см3 для сбора экстракта после этапа очистки #по ГОСТ 1770#.

6.8. Испарительную систему, испаритель роторный или #оборудование, позволяющее получать слабый поток азота#.

6.9. Спектрометр #с диапазоном измерения, позволяющим проводить исследования при длинах волн от 200 до 400 нм, снабженный кварцевыми кюветами с длиной оптического пути 10 мм#.

6.10. Термостат водяной, #поддерживающий# температуру #от# 35 °C до 37 °C.

6.11. Центрифугу, обеспечивающую радиальное ускорение #не менее# 2000 g и охлаждение до 4 °C.

6.12. Бумага фильтровальная (ватман № 4 <1> или аналогичная) #по ГОСТ 12026#.

<1> #Ватман № 4 является примером коммерчески доступной продукции. Данная информация приведена только для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этой продукции.#

6.13 Иммуноаффинные колонки

Иммуноаффинные колонки должны содержать антитела относительно афлатоксина M_{1} . Максимальная емкость колонок должна быть не менее 100 нг афлатоксина M_{1} (что соответствует 1 мкг/дм3 или 10 мкг/кг, когда используют 100 см3 пробы для анализа). Они должны давать #выход афлатоксина M_{1} не менее 80% для массы# 4 нг токсина (что соответствует 0,04 мкг/дм3 или 0,40 мкг/кг на 100 см3 пробы для анализа). Допускается использовать любую иммуноаффинную колонку, удовлетворяющую #вышеуказанным# рабочим характеристикам.

6.14. Весы #лабораторные# с точностью взвешивания до 0,1 г по #ГОСТ 24104#.

6.15 Магнитная мешалка.

6.16 Мешалка вихревого типа.

6.17 Вакуумная система для иммуноаффинного картриджа.

6.18. Шкаф сушильный #(термостат), обеспечивающий поддержание# температуры 50 °C.

6.19 Камера для тонкослойной хроматографии.

6.20. Пластинки для тонкослойной хроматографии, размером 10 x 10 см или 20 x 20 см, с силикагелем 60, сделанные из стекла или алюминия.

6.21 Ультрафиолетовая лампа, #излучающая при длине волны# 365 нм.

6.22 Денситометр.

7. Отбор проб

#7.1. Отбор проб — по ГОСТ 26809 и ИСО 707 [4].

В лабораторию направляют представительные пробы, которые не были повреждены в процессе хранения и транспортирования.#

8. #Подготовка# проб

8.1 Молоко

Пробу нагревают в термостате (см. 6.10) до (35 +/- 2) °C, чтобы растворить слой жира для получения хорошей гомогенизации пробы для анализа при умеренном перемешивании.

Гомогенизированную пробу для анализа центрифугируют (см. 6.11) при радиальном ускорении 2000 g не менее 15 мин. Пробу охлаждают для лучшего отделения жира и верхний тонкий слой жира удаляют. #При необходимости# проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают #не менее# 100 см3 приготовленной таким образом пробы для анализа.

8.2. #Сухое# молоко

20,0 г навески пробы с точностью до 0,1 г помещают в мерную колбу вместимостью 250 см3 и растворяют со 150 см3 воды, предварительно нагретой при #температуре от# 50 °C до 60 °C. Полученный раствор перемешивают магнитной мешалкой (см. 6.15) в течение 10 мин.

#Испытуемый раствор оставляют охлаждаться до комнатной температуры.# Затем осторожно #переносят# весь раствор в мерную колбу вместимостью 200 см3 (см. 6.4). Разбавляют до метки водой. Закрывают колбу и встряхивают ее содержимое для получения хорошо гомогенизированного раствора.

Центрифугируют (см. 6.11) #испытуемый# раствор при радиальном ускорении 2000 g #не менее# 15 мин. Раствор охлаждают для лучшего отделения жира и удаляют верхний тонкий слой жира. #При необходимости# проводят фильтрование через один или более листов фильтровальной бумаги (см. 6.12). Собирают #не менее# 100 см3 приготовленной пробы для испытания.

8.3 Иммуноаффинная очистка

Иммуноаффинной колонке (см. 6.13) дают достигнуть комнатной температуры. Присоединяют шприц к верхней части иммуноаффинного картриджа. Отбирают 100 см3 приготовленного испытуемого раствора (см. 8.1 или 8.2), используя #мерный цилиндр вместимостью# 100 см3 (см. 6.5) или пипетку.

Переводят анализируемую пробу в шприц и пропускают через иммуноаффинную колонку с #постоянной медленной скоростью потока# около 2 — 3 см3/мин. Используют гравитационную или вакуумную систему (см. 6.17) для контроля скорости потока. Не следует допускать #высыхания# колонки. Промывают колонку, используя 40 см3 воды при постоянной медленной скорости потока. После промывки колонку продувают #досуха#, промывочный раствор выбрасывают.

Устанавливают другой сухой чистый шприц на картридж. Медленно элюируют афлатоксин M_{1} из колонки, пропуская 2,5 см3 #смеси# ацетонитрил/метанол (см. 5.2) и затем 2,5 см3 чистого метанола (5.1.4). Дают этим растворам контактировать с колонкой не менее 1 мин при соблюдении постоянной медленной скорости потока. Затем продувают колонку #досуха#.

Собирают элюат в #пробирку с коническим дном# и выпаривают #до минимального объема (1 — 2 капли)#, используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре <= 40 °C или используя слабый поток азота. Не следует испарять элюат до полной сухости, это позволит достичь хорошего повторного суспендирования афлатоксина M_{1} , присутствующего в остатке пробы.

Добавляют 200 мм3 чистого ацетонитрила (см. 5.1.2) к остатку пробы. Закрывают #пробирку# и интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 6.16), в течение 1 мин. Испаряют снова #до минимального объема (1 — 2 капли)#, используя роторный испаритель (см. 6.8) при температуре <= 40 °C или слабый поток азота.

Примечание. Предыдущий этап необходим, чтобы избежать образования эмульсии и получить хорошее повторное суспендирование при добавлении #смеси# толуол/ацетонитрил.

Открывают пробирку и добавляют 100 мм3 #смеси# толуол/ацетонитрил (см. 5.3) к остатку пробы. Закрывают пробирку и снова интенсивно перемешивают, используя мешалку вихревого типа (см. 5.16), в течение 1 мин. Очищенную таким образом пробу для анализа хранят до начала процедуры.

#9. Проведение определения#

9.1 Однонаправленная тонкослойная хроматография

#На пластинку тонкослойной хроматографии# (см. 6.20) #наносят# 10 — 20 мм3 очищенной пробы по 8.3. Добавляют аликвоты, например, по 5, 10, 20 мм3 соответствующего #рабочего стандартного# раствора афлатоксина M_{1} , приготовленного по 5.5.2 (раствор A или B).

#Пластинку помещают в камеру для тонкослойной хроматографии# (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной тонкослойной хроматографии (см. 5.4.1). #Хроматографию# проводят до тех пор, пока #фронт растворителя# не достигнет высоты #примерно# 10 см.

Удаляют пластинку из #камеры# и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают #интенсивность флуоресценции# пятна на #хроматограмме пробы# с интенсивностями, полученными для #рабочих стандартных# растворов афлатоксина M_{1} .

Вычисляют содержание афлатоксина M_{1} в анализируемой пробе, как описано в разделе 10.

Если #интенсивность флуоресценции# пятна на #хроматограмме пробы# выше по сравнению с рабочим стандартным раствором афлатоксина M_{1} самой высокой #интенсивности флуоресценции, то# оценивают уровень загрязнений. Исходя из этого уровня, разбавляют очищенную пробу для анализа (см. 8.3) подходящим объемом #смеси# толуол/ацетонитрил (см. 5.3).

Повторяют процедуру с разбавленной очищенной пробой, описанную в настоящем подразделе.

9.2 Двунаправленная тонкослойная хроматография

#При появлении на хроматограмме помех вблизи флуоресцирующих пятен# проводят двунаправленную тонкослойную хроматографию. #Наносят# на пластинку #для тонкослойной хроматографии# (см. 6.20) 20 мм3 очищенной пробы для анализа (см. 8.3). Добавляют по 5, 10, 20 мм3 #рабочего стандартного# раствора афлатоксина M_{1} , приготовленного как описано в 5.5.2, чтобы пропустить его в направлении 1, и по 5, 10, 20 мм3 того же самого рабочего стандартного раствора афлатоксина M_{1} (см. 5.5.2), чтобы пропустить его в направлении 2 (см. рисунок 1).

Рисунок 1. Двунаправленная тонкослойная хроматография

Помещают пластинку в #камеру тонкослойной хроматографии# (см. 6.19), содержащую раствор для однонаправленной #тонкослойной хроматографии# (см. 5.4.1). #Хроматографируют (элюируют)# пластинку в первом направлении до тех пор, пока #фронт подвижной фазы# не достигнет высоты #примерно# 7 см. Удаляют пластинку из камеры и оставляют ее сохнуть на воздухе.

Нагревают сухую пластину в сушильном шкафу (термостате) (см. 6.18) при #температуре# 50 °C в течение 5 мин. Охлаждают пластинку и помещают ее в другую #камеру для тонкослойной хроматографии для элюирования в направлении 2#. Хроматографируют (элюируют) пластинку во втором направлении до тех пор, пока #фронт растворителя# не достигнет высоты около 7 см.

Удаляют пластинку из #камеры# и оставляют ее сохнуть на воздухе. Считывают полученные пятна, используя ультрафиолетовую лампу (см. 6.21) или денситометр (см. 6.22) при 365 нм. Сравнивают интенсивность флуоресценции пятна на испытательном образце с интенсивностями, полученными для #рабочих стандартных# растворов афлатоксина M_{1} .

Вычисляют содержание афлатоксина M_{1} в анализируемой пробе, как описано в разделе 10.

Если интенсивность флуоресценции пятна на #хроматограмме пробы# выше по сравнению с #рабочим стандартным# раствором афлатоксина M_{1} самой высокой #интенсивности флуоресценции, то# повторяют процедуру с очищенной пробой меньшего объема (см. 8.3), как описано в настоящем подразделе.

После анализа методом #тонкослойной хроматографии# оставшуюся очищенную пробу для анализа хранят в закрытом пузырьке или #морозильной камере# для дальнейшего количественного анализа или подтверждения идентичности.

#10. Обработка результатов#

10.1 Вычисление

Вычисляют массовую концентрацию или массовую долю афлатоксина M_{1} в пробе (см. 8.1 или 8.2), мкг/дм3 или мкг/кг, используя следующее уравнение:

W_{A} = \frac{v_{s}c_{s}v_{1}}{v_{2}m_{t}} , (2)

где v_{s} — численное значение объема рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2), сравнимое с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемое в вычислении, мм3;

c_{s} — массовая концентрация афлатоксина M_{1} используемого рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2), сравнимая с объемом анализируемой пробы (см. 9.1 или 9.2) и используемая в вычислении, нг/мм3;

v_{1} — объем растворенного остатка, мм3 (v_{1} = 100\text{мм}^{3}) ;

v_{2} — объем (см. 9.1 или 9.2) очищенной анализируемой пробы, сопоставимый с объемом рабочего стандартного раствора A или B (см. 5.5.2) и используемый в вычислении, мм3;

m_{t} — объем (см. 8.1) или масса (см. 8.2) пробы, см3 или г.

10.2. #Оценка результатов

За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений, округленное до двух значащих цифр.#

11. Прецизионность

11.1 Межлабораторные испытания

#Подробная информация о межлабораторных испытаниях# для определения прецизионности метода приведена в Приложении A. #Применение результатов межлабораторных испытаний возможно только для указанных в таблице A.1 уровней загрязнения афлатоксином M_{1} проб молока, сырого и сухого молока.#

11.2. #Пределы повторяемости и воспроизводимости

Значения пределов повторяемости (абсолютной разности между двумя независимыми результатами единичных испытаний, полученных одним и тем же оператором при использовании одного и того же оборудования в пределах короткого интервала времени) и воспроизводимости (абсолютной разности между двумя результатами испытаний, полученных одним и тем же методом на идентичном испытуемом материале в разных лабораториях) для доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.#

#Таблица 1#

(в мкг/дм3 для жидких проб и мкг/кг для твердых проб)#

В протоколе испытания должны быть указаны:

a) вся информация, необходимая для полной идентификации пробы;

b) метод отбора проб (если известен);

c) используемый метод испытания со ссылкой на #настоящий# стандарт;

d) все рабочие подробности, не установленные в этом стандарте или рассматриваемые как факультативные, с #особенностями#, которые могли повлиять на окончательный(е) результат(ы) испытания;

e) полученные результаты или, в случае проверки повторяемости, конечный объявленный результат.

В международных испытаниях проб жидкого молока участвовало девять лабораторий, проб сухого молока — одиннадцать лабораторий, испытания проводились на параллельных пробах. Пробы жидкого молока для анализа имели два уровня загрязнения: 0,13 мкг/дм3 (L1) и 0,68 мкг/дм3 (L2). Пробы сухого молока для анализа имели также два уровня загрязнения: 1,17 мкг/кг (P1) и 5,49 мкг/кг (P2). Статистический анализ проводился по нескорректированным результатам и по результатам, которые были скорректированы для #аналитического выхода#.

Испытания были организованы AFSSA-LERHQA (Франция). Содержание афлатоксина M_{1} в #пробах загрязненного молока, разосланных участникам#, определяли с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, описанного в ИСО 14501 [5].

#Для нахождения данных по прецизионности, приведенных в таблице A.1, полученные результаты подвергали статистическому анализу# согласно ГОСТ Р ИСО 5725-1 и ГОСТ Р ИСО 5725-2.

#[1] ТУ 6-09-3534-74 Ацетонитрил

2. ТУ 6-09-402-87 Спирт изопропиловый

3. AOAC 199549.3.02 (980.21 Method)

4. ИСО 707:1997 Молоко и молочные продукты. Руководящие указания по отбору проб

5. ИСО 14501:2007 Молоко и сухое молоко. Определение содержания афлатоксина M_{1} . Очистка с помощью иммуноаффинной хроматографии и определение с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии#

------------------------------------------------------------------