ГОСТ Р 52828-2007. Национальный стандарт Российской Федерации. Вина и виноматериалы. Определение содержания охратоксина А. Метод тонкослойной хроматографии
(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 27.12.2007 № 455-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности алкогольной продукции» (ТР ЕАЭС 047/2018) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 17.05.2022 № 80). Документ введен в действие с 1 января 2009 года.
Утвержден и введен в действие
Приказом Федерального
агентства по техническому
регулированию и метрологии
от 27 декабря 2007 г. № 455-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОХРАТОКСИНА А. МЕТОД ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Wines and winestocks. Determination of ohratoxin A content. Method of thin-layer chromatography
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».
1. Разработан ГНУ «Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства» Россельхозакадемии, г. Краснодар.
2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».
3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 27 декабря 2007 г. № 455-ст.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
Настоящий стандарт распространяется на вина и виноматериалы и устанавливает метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) определения массовой концентрации охратоксина А в диапазоне измерений от 0,1 до 1,0 мкг/см3.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ Р 51144-98 Продукты винодельческой промышленности. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021-75 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603-79 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3760-79 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия
ГОСТ 5955-75 Реактивы. Бензол. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9805-84 Спирт изопропиловый. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 24861-91 Шприцы инъекционные однократного применения
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
Отбор проб — по ГОСТ Р 51144.
Метод основан на сорбции охратоксина А из анализируемых проб вина и виноматериалов концентрирующим патроном Диапак С16М или аналогичным патроном с гидрофобным сорбентом с привитыми гексадецильными С16 группами, десорбции ацетонитрилом с последующим определением его методом ТСХ.
Идентификацию и количественное определение охратоксина А следует проводить методом сканирующей денситометрии.
5. Метрологические характеристики
5.1 Диапазон измерения
Диапазон измерений массовой концентрации охратоксина А методом ТСХ в вине и виноматериалах находится в пределах от 0,1 до 1,0 мкг/см3.
5.2 Прецизионность метода
Показатели прецизионности метода определены в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2 и представлены в таблице 1.
определения охратоксина А
Расхождение между результатами двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, может превышать предел повторяемости r не более одного раза из двадцати.
Расхождение двух результатов анализа, полученных в условиях промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности (разное время, разные операторы, разное оборудование), может превышать предел промежуточной прецизионности R_{I(TOE)} не более одного раза из двадцати.
6. Требования к условиям выполнения измерений
6.1. Подготовку лабораторных проб и определение охратоксина А проводят при температуре окружающего воздуха (23 +/- 5) °C, атмосферном давлении от 87 до 107 кПа, относительной влажности воздуха не более 80%, частоте переменного тока (50,0 +/- 0,4) Гц, напряжении в сети 220 В.
7.1. При проведении работ необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
7.2. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.018 и ГОСТ 12.1.019, а также требованиям, изложенным в инструкции по эксплуатации денситометра.
7.3. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021; содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать нормы, установленные ГОСТ 12.1.005, а также должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
7.4 Требования к квалификации оператора
К работе допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное химическое образование и владеющие техникой выполнения анализов с применением ТСХ.
материалы и реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001.
Система для ТСХ с денситометром [1] <*>.
<*> Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение денситометра «Сорбфил».
Денситометр с соответствующей системой обработки данных, включающей программное обеспечение, способный рассчитывать любую хроматограмму, видимую в дневном или ультрафиолетовом свете с длинами волн 254 и 365 нм.
Камера хроматографическая под пластины 10 x 10 см.
Аппликатор механический в комплекте с нагревательным устройством УСП-1М и микрошприцем М-10Н.
Трафарет, предназначенный для предварительной разметки хроматографических пластин или для прямого нанесения проб на пластины.
Пластины для ТСХ на полимерной основе (полиэтилентерефталат) или алюминиевой подложке размером 10 x 10 см.
Сушильный шкаф с диапазоном температур в рабочей камере от 40 °C до 200 °C и основной погрешностью стабилизации температуры +/- 1 °C.
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2, 4-100-2 по ГОСТ 1770.
Стакан В-1-25 ТХС или Н-1-25 ТХС по ГОСТ 25336.
Пипетки градуированные 3-2-2-1, 3-2-2-5 по ГОСТ 29227.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Концентрирующий патрон Диапак С16М (одноразовый), Диапак С16МТ (используемый до пяти раз) в виде разъемных капсул с фиксированным слоем сорбента объемом 1 см3 и/или в виде колонок объемом 10 см3, частично заполненных сорбентом объемом обычно 3 см3.
Шприцы медицинские инъекционные по ГОСТ 24861 вместимостью 5 и 10 см3.
Термометр жидкостный стеклянный с диапазоном измерения от 0 °C до 50 °C и ценой деления 1 °C по ГОСТ 28498.
Стандартный образец состава раствора охратоксина А ГСО 7941 в смеси бензола и уксусной кислоты (объемное соотношение 99:1) номинального значения массовой концентрации 50 мкг/см3 и погрешностью аттестованного значения не более +/- 5%.
Ацетонитрил ОП-3, ос.ч., с массовой долей основного вещества не менее 99,90%.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Аммиак водный по ГОСТ 3760, ч.д.а.
Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805.
Бензол по ГОСТ 5955.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже вышеуказанных в разделе 8.
9.1 Подготовка анализируемой пробы к испытанию
Анализируемую пробу вина или виноматериала в объеме 10 см3 набирают инъекционным шприцем однократного применения, соединяют шприц с концентрирующим патроном Диапак С16М или Диапак С16МТ, подготовленными по 9.7. Пропускают пробу через патрон по одной капле со скоростью от 10 до 20 капель в минуту. Затем для десорбции охратоксина А через патрон пропускается 1 см3 ацетонитрила со скоростью от 10 до 20 капель в минуту. Элюат собирают в стакан вместимостью 25 см3. Элюат анализируемой пробы используют в хроматографическом анализе.
9.2 Приготовление элюента для тонкослойной хроматографии
Состав элюента для определения охратоксина А состоит из двух реактивов: изопропилового спирта и водного раствора массовой долей аммиака 25%, которые отбирают мерными пипетками в соотношении объемов 4:1.
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят мерными пипетками индивидуально для каждого реактива 4 см3 изопропилового спирта и 1 см3 водного раствора аммиака. Колбу закрывают стеклянной пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор готовят непосредственно перед его использованием.
9.3 Приготовление градуировочного раствора
Для приготовления градуировочных растворов массовой концентрацией охратоксина А 1, 2, 3, 5 мкг/см3 ампулу со стандартным образцом вскрывают, отбирают мерными пипетками 0,5, 1, 1,5 и 2,5 см3 раствора стандартного образца и вносят в четыре мерные колбы вместимостью 25 см3. Доводят объем раствора в мерной колбе до метки растворителем, приготовленным из бензола и уксусной кислоты в соотношении 99:1 при температуре окружающей среды 20 °C.
Значение концентрации приготовленного раствора охратоксина А C, мкг/см3, рассчитывают по формуле
где A — аттестованное значение ГСО, мкг/см3;
V_{1} — объем раствора, отмеряемый мерной пипеткой, см3;
V_{2} — объем мерной колбы, см3.
Градуировочные растворы хранят не более 10 дней при температуре не выше 5 °C в защищенном от света месте.
9.4 Подготовка хроматографической камеры
В хроматографическую камеру вносят элюент, подготовленный по 9.2, толщина слоя которого должна составлять 4 — 5 мм.
В камеру помещают два куска фильтровальной бумаги размером 10 x 10 см, которыми закрывают переднюю и заднюю стенки камеры, начиная с ее дна.
Камеру закрывают крышкой для насыщения объема парами элюента. Через 20 — 30 мин камера готова к проведению хроматографического разделения.
9.5 Подготовка хроматографических пластин
Перед проведением анализа пластины активируют в сушильном шкафу при температуре 90 °C — 100 °C в течение 1 ч.
При дальнейшей подготовке пластины учитывают направление хроматографирования, перпендикулярное к рискам-царапинам на обратной стороне подложки пластины (пленка на фольге).
Для обеспечения равномерного подъема фронта элюента перед выполнением анализа срезают углы в нижней части пластины на 6 — 8 мм под углом 45°.
Для повышения точности анализа и эффективности пластин проводят их очистку концентрированным раствором аммиака или ацетона. Для очистки пластину помещают и выдерживают в хроматографической камере, заполненной раствором аммиака или ацетона на 8 — 10 мм, до тех пор, пока фронт элюента не достигнет верхнего края пластины. После этого пластину необходимо высушить, а верхний загрязненный край срезать на 10 — 12 мм.
9.6 Подготовка денситометра к выполнению измерений
Денситометр включают и подготавливают к работе в соответствии с его описанием и руководством по эксплуатации.
9.7 Подготовка концентрирующих патронов
Для подготовки концентрирующего патрона Диапак к работе с него снимают заглушки и пропускают через него с помощью инъекционного шприца одноразового применения последовательно по 5 см3 ацетонитрила и воды. Заглушают оба конца патрона. Подготовленный таким образом патрон может храниться в течение суток при температуре не выше 20 °C.
10.1 Нанесение анализируемой пробы на хроматографическую пластину
Подготовленные по 9.1 элюат анализируемой пробы и градуировочные растворы, приготовленные по 9.3, наносят на хроматографическую пластину, подготовленную по 9.5.
В отсутствие механического или автоматического дозатора на пластину на расстоянии 10 мм от нижнего края графитовым карандашом наносят тонкую стартовую линию, на которую через каждые 10 мм в порядке слева направо наносят микрошприцем М-10Н аликвоты 5 мм3 элюата анализируемой пробы и градуировочных растворов с диаметром точки нанесения не более 4 мм. Не следует наносить элюат анализируемой пробы в точки, расположенные ближе 10 мм от края пластины.
10.2 Хроматографическое разделение
Хроматографическую пластину с нанесенной пробой и градуировочным раствором по 10.1 помещают нижним краем на дно хроматографической камеры, подготовленной по 9.4, и закрывают крышку камеры. Движение элюента по пластине вверх приводит к хроматографическому разделению компонентов пробы и градуировочного раствора. Хроматографирование заканчивают по достижении расстояния между стартовой линией и центром пятна не более 70 — 80 мм.
Пластину вынимают из камеры и сушат на воздухе в вытяжном шкафу в течение 5 мин при комнатной температуре.
В результате хроматографирования должны быть получены пятна с четкой границей диаметром не более 4 мм, для чего следует применять дробное нанесение элюата анализируемой пробы микрошприцем М-10Н с помощью аппликатора и подсушку нанесенных проб с применением нагревательного устройства УСП-1М.
10.3 Экспонирование и обработка изображения хроматограмм
После проведения процедур по 10.2 пластину помещают в осветительную камеру денситометра и освещают лучом света в УФ диапазоне при длине волны 365 нм. Регистрируют изображение хроматограммы в виде сигналов флюоресценции проявленных пятен охратоксина А.
11.1 Подтверждение наличия охратоксина А
Идентификацию охратоксина А проводят по R_{f} определяемого вещества, где R_{f} — расстояние от линии старта до центра пятна по 10.2.
Надежной идентификации охратоксина А соответствует совпадение его значения R_{f} и R_{f} градуировочного раствора при максимальной разности между ними не более 2 мм.
11.2 Количественное определение содержания охратоксина А
Количественное определение охратоксина А в исследуемой пробе вина или виноматериала проводят методом сканирующей денситометрии в результате сравнения пятен охратоксина А пробы и градуировочного раствора по разделу 10.
Массовую концентрацию охратоксина А X в вине и виноматериалах, мкг/см3, вычисляют с использованием программы оценки и расчета параметров хроматограмм по формуле
где M_{\text{вых}} — масса охратоксина А в проявленном пятне пластины ТСХ, нг;
V_{1} — объем ацетонитрила, используемого для десорбции охратоксина А, полученного по 9.1, см3;
V_{2} — объем анализируемого раствора охратоксина А пробы, нанесенного на пластину ТСХ по 10.1, мм3;
V — объем пробы анализируемого вина или виноматериала, взятой для анализа, равный 10 см3.
За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений массовой концентрации охратоксина А, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости
где X_{1} , X_{2} — результаты двух параллельных измерений массовой концентрации охратоксина А в пробе, кг/см3;
X_{\text{ср}} — среднее значение двух параллельных измерений массовой концентрации охратоксина А в пробе, мкг/см3;
r — значение предела повторяемости (см. таблицу 1), %.
Результат анализа представляют в виде: (X_{\text{ср}} \pm \Delta) при P = 0,95, мкг/см3,
где X_{\text{ср}} — среднеарифметическое значение двух определений массовой концентрации охратоксина А в пробе, признанных приемлемыми, мкг/см3;
\Delta — границы абсолютной погрешности определения, мкг/см3, при доверительной вероятности P = 0,95.
Границы абсолютной погрешности А вычисляют по формуле
где \delta — границы относительной погрешности измерения (см. таблицу 1), %;
X — массовая концентрация охратоксина А в вине или виноматериале, мкг/см3;
100 — коэффициент пересчета абсолютной погрешности, мкг/см3.
Числовое значение результата определения должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение границы абсолютной погрешности.
[1] Государственный реестр Тип приборов для тонкослойной хроматографии средств измерений с денситометром "Сорбфил"
N 23965-02