---
title: "\"ГОСТ Р 51758-2001. Государственный стандарт Российской Федерации. Среды питательные для ветеринарных целей. Методы биологических испытаний\""
number: "ГОСТ Р 51758-2001"
issuer: "Государственный комитет Российской Федерации по стандартизации и метрологии"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/gost-r-51758-2001"
---

## "ГОСТ Р 51758-2001. Государственный стандарт Российской Федерации. Среды питательные для ветеринарных целей. Методы биологических испытаний"

# "ГОСТ Р 51758-2001. Государственный стандарт Российской Федерации. Среды питательные для ветеринарных целей. Методы биологических испытаний"

(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 13.06.2001 N 230-ст)

> [!IMPORTANT]
> КонсультантПлюс: примечание.
> С 1 июля 2003 года до вступления в силу технических регламентов акты федеральных органов исполнительной власти в сфере технического регулирования носят рекомендательный характер и подлежат обязательному исполнению только в части, соответствующей целям, указанным в пункте 1 статьи 46 Федерального закона от 27.12.2002 N 184-ФЗ.
> Документ [введен](#p100009) в действие с 1 июля 2002 года.


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Принят и введен в действие<br>
Постановлением Госстандарта России<br>
от 13 июня 2001 г. N 230-ст

</div>


<a id="p100002"></a>**ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ**

<a id="p100003"></a>**СРЕДЫ ПИТАТЕЛЬНЫЕ ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ ЦЕЛЕЙ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ**

<a id="p100005"></a>Nutrient media for veterinary purposes.
Methods of biological testing

<div align="right">

<a id="p100006"></a>**ГОСТ Р 51758-2001**

<a id="p100007"></a>Группа Р39

<a id="p100008"></a>ОКС 07.100.10;<br>
ОКСТУ 9291

<a id="p100009"></a>Дата введения

</div>

1 июля 2002 года


### <a id="p100010"></a>Предисловие


1. <a id="p100011"></a>Разработан Всероссийским государственным научно-исследовательским институтом контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов РФ.
<a id="p100012"></a>Внесен Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России.
2. <a id="p100013"></a>Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 13 июня 2001 г. N 230-ст.
3. <a id="p100014"></a>Введен впервые.


### 1. <a id="p100015"></a>Область применения


<a id="p100016"></a>Настоящий стандарт распространяется на питательные среды для микроорганизмов и культур клеток, а также основные компоненты питательных сред: белковые экстракты и гидролизаты (далее - питательные среды) и устанавливает методы определения:
- <a id="p100017"></a>ростовых свойств питательных сред для микроорганизмов:
<a id="p100018"></a>ростовых свойств питательной среды по интенсивности роста тест-штаммов микроорганизмов;
<a id="p100019"></a>чувствительности питательной среды к разным видам микроорганизмов;
<a id="p100020"></a>эффективности плотной питательной среды для роста микроорганизмов;
<a id="p100021"></a>влияния среды на типичность микроорганизмов;
- <a id="p100022"></a>пригодности питательных сред для токсинообразования микроорганизмов по силе образуемого токсина:
<a id="p100023"></a>силы токсина на белых мышах;
<a id="p100024"></a>силы токсина по индексу ингибирования микробной тест-культуры;
- <a id="p100025"></a>ростовых свойств питательных сред для культур клеток:
<a id="p100026"></a>ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток;
<a id="p100027"></a>токсичности питательных сред для первичных культур клеток;
<a id="p100028"></a>ростовых свойств питательных сред для клеточных линий;
<a id="p100029"></a>ростовых свойств белковых гидролизатов для клеточных линий.
<a id="p100030"></a>Применяемые в настоящем стандарте термины и определения приведены в [Приложении А](#p100670).


### 2. <a id="p100031"></a>Нормативные ссылки


<a id="p100032"></a>В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:
<a id="p100033"></a>ГОСТ 427-75 Линейки измерительные, металлические. Технические условия
<a id="p100034"></a>[ГОСТ 975-88](https://bukva.ai/docs/gost-975-88) Глюкоза кристаллическая гидратная. Технические условия
<a id="p100035"></a>[ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
<a id="p100036"></a>ГОСТ 3118-77 Кислота соляная. Технические условия
<a id="p100037"></a>[ГОСТ 3164-78](https://bukva.ai/docs/gost-3164-78) Масло вазелиновое медицинское. Технические условия
<a id="p100038"></a>[ГОСТ 4159-79](https://bukva.ai/docs/gost-4159-79) Йод кристаллический. Технические условия
<a id="p100039"></a>[ГОСТ 4201-79](https://bukva.ai/docs/gost-4201-79) Натрий углекислый кислый. Технические условия
<a id="p100040"></a>[ГОСТ 4232-74](https://bukva.ai/docs/gost-4232-74) Калий йодистый. Технические условия
<a id="p100041"></a>ГОСТ 4233-77 Натрий хлористый. Технические условия
<a id="p100042"></a>ГОСТ 4328-77 Натрия гидроокись. Технические условия
<a id="p100043"></a>ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
<a id="p100044"></a>ГОСТ 8074-82 Микроскопы инструментальные. Типы, основные параметры и размеры. Технические требования
<a id="p100045"></a>[ГОСТ 9284-75](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9284-75) Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия
<a id="p100046"></a>[ГОСТ 10652-73](https://bukva.ai/docs/gost-10652-73) Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты 2-водная (трилон Б). Технические условия
<a id="p100047"></a>ГОСТ 10733-98 Часы наручные и карманные механические. Общие технические условия
<a id="p100048"></a>ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
<a id="p100049"></a>[ГОСТ 13739-78](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13739-78) Масло иммерсионное для микроскопии. Технические требования. Методы испытания
<a id="p100050"></a>[ГОСТ 13805-76](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13805-76) Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия
<a id="p100051"></a>[ГОСТ 17206-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-gost-17206-96) Агар микробиологический. Технические условия
<a id="p100052"></a>ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
<a id="p100053"></a>ГОСТ 20729-75 Питательные среды. Вода мясная (для ветеринарных целей). Технические условия
<a id="p100054"></a>[ГОСТ 20730-75](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20730-75-gosstandart-sssr) Питательные среды. Бульон мясопептонный (для ветеринарных целей). Технические условия
<a id="p100055"></a>ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия
<a id="p100056"></a>ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
<a id="p100057"></a>ГОСТ 25706-83 Лупы. Типы, основные параметры. Общие технические требования
<a id="p100058"></a>ГОСТ 27987-88 Анализаторы жидкости потенциометрические ГСП. Общие технические условия
<a id="p100059"></a>[ГОСТ 28085-89](https://bukva.ai/docs/gost-28085-89) Препараты биологические. Метод бактериологического контроля стерильности
<a id="p100060"></a>[ГОСТ 28498-90](https://bukva.ai/docs/gost-28498-90) Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
<a id="p100061"></a>ГОСТ 29112-91 Среды питательные плотные (для ветеринарных целей). Общие технические условия
<a id="p100062"></a>[ГОСТ 29227-91](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
<a id="p100063"></a>ГОСТ 29311-92 Гидролизаты панкреатические для бактериальных питательных сред. Общие технические условия
<a id="p100064"></a>ГОСТ Р 51232-98 Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества.


### 3. <a id="p100065"></a>Обозначения и сокращения


<a id="p100066"></a>В настоящем стандарте применяют следующие обозначения и сокращения:
<a id="p100067"></a>ГЛА - гидролизат лактальбумина фирмы Дифко;
<a id="p100068"></a>ИП - индекс пролиферации;
<a id="p100069"></a>КОЕ - колониеобразующая единица;
<a id="p100070"></a>МПА - мясопептонный агар - питательная среда;
<a id="p100071"></a>МПБ - мясопептонный бульон - питательная среда;
<a id="p100072"></a>ПК - почка крольчонка - линия клеток;
<a id="p100073"></a>ПП - почка поросенка - линия клеток;
<a id="p100074"></a>ПТ - почка теленка - линия клеток;
<a id="p100075"></a>ССО - сухой стандартный образец (питательной среды);
<a id="p100076"></a>ФГМС - ферментативный гидролизат мышц, сухой;
<a id="p100077"></a>ФЭК - фибробласты куриных эмбрионов - первичная культура клеток;
<a id="p100078"></a>ФЭП - фибробласты перепелиных эмбрионов - первичная культура клеток;
<a id="p100079"></a>DLM - минимальная летальная доза.


### 4. <a id="p100080"></a>Методы определения ростовых свойств питательных сред для микроорганизмов



#### <a id="p100081"></a>4.1 Методы определения ростовых свойств питательной среды по интенсивности роста тест-штаммов микроорганизмов


##### <a id="p100082"></a>4.1.1 Бактериологический метод

<a id="p100083"></a>Сущность метода заключается в выращивании бактериальной культуры в испытуемой питательной среде, приготовлении разведенных суспензий полученной исходной культуры, высеве разведенных суспензий на МПА и подсчете количества КОЕ в 1 см3 исходной культуры.

###### <a id="p100084"></a>4.1.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100085"></a>Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 3-го класса точности.
<a id="p100086"></a>Анализатор жидкости потенциометрический по ГОСТ 27987, диапазоном измерения pH от 4 до 8 и погрешностью измерения +/- 0,1.
<a id="p100087"></a>pH-электрод стеклянный типа ЭСЛ-41 Г.
<a id="p100088"></a>Термометр ртутный стеклянный по [ГОСТ 28498](https://bukva.ai/docs/gost-28498-90), диапазоном измерения от 0 до 100 °C и погрешностью измерения +/- 0,5 °C.
<a id="p100089"></a>Часы наручные механические по ГОСТ 10733, 4-ой группы, 2-го класса, средним суточным ходом от минус 20 до плюс 55 с/сут.
<a id="p100090"></a>Пипетки по [ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91), вместимостью 0,5; 1; 2; 10 и 25 см3, 2-го класса точности.
<a id="p100091"></a>Цилиндры по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74), вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3.
<a id="p100092"></a>Термостат, обеспечивающий температуру нагрева (37,0 +/- 0,5) °C.
<a id="p100093"></a>Баня водяная.
<a id="p100094"></a>Автоклав.
<a id="p100095"></a>Чашки Петри по ГОСТ 25336, стерильные.
<a id="p100096"></a>Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.
<a id="p100097"></a>Шпатель стеклянный или палочка с резиновым наконечником.
<a id="p100098"></a>Петля платиновая.
<a id="p100099"></a>Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026, средней фильтрации, марки II.
<a id="p100100"></a>Вода мясная по ГОСТ 20729.
<a id="p100101"></a>Бульон мясопептонный по [ГОСТ 20730](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20730-75-gosstandart-sssr).
<a id="p100102"></a>Агар мясопептонный по ГОСТ 29112.
<a id="p100103"></a>Пептон сухой ферментативный по [ГОСТ 13805](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13805-76).
<a id="p100104"></a>Натрий хлористый по ГОСТ 4233, кристаллический и раствор изотонический массовой доли 0,85%.
<a id="p100105"></a>Натрия гидроокись по ГОСТ 4328; раствор массовой доли 10%.
<a id="p100106"></a>Кислота соляная по ГОСТ 3118; раствор массовой доли 10%.
<a id="p100107"></a>Культуры тест-штаммов аэробных микроорганизмов:
<a id="p100108"></a>Staphylococcus aureus (S.aureus) штамм Лоссманов; Shigella flexneri (S.flexneri) штамм 1a 8516; Escherichia coli (E.coli) штамм 675;
<a id="p100109"></a>Corynebacterium xerosis (C.xerosis) штамм 1911 и Enterococcus faecalis (E.faecalis) штамм 6783 - или другие виды микроорганизмов, показательные для испытуемой среды.
<a id="p100110"></a>Допускается применять другие средства измерения с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы и среды по качеству не ниже указанных.

###### <a id="p100111"></a>4.1.1.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100112"></a>4.1.1.2.1 Приготовление питательных сред

<a id="p100113"></a>Испытание гидролизатов
<a id="p100114"></a>В гидролизатах определяют массовые доли аминного азота и пептидов по ГОСТ 29311, после чего готовят раствор гидролизата в деминерализованной воде (бульон) массовыми долями аминного азота от 0,15 до 0,18% и пептидов - не менее 1,5%. Недостаток пептидов компенсируют добавлением сухого ферментативного пептона. В приготовленный бульон добавляют хлористый натрий из расчета 0,5 г на 100 см3 бульона.
<a id="p100115"></a>Устанавливают pH среды по потенциометрическому анализатору в диапазоне 7,4 - 7,6, добавляя растворы гидроокиси натрия или соляной кислоты, и кипятят в течение 5 - 7 мин. Среду охлаждают и проверяют pH. Если требуется, pH корректируют, после каждой коррекции нагревая среду до кипения. После охлаждения среды pH должен быть от 7,4 до 7,6.
<a id="p100116"></a>Среду фильтруют, разливают в пробирки по 6 - 8 см3. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и пергаментными колпачками. Среду стерилизуют в автоклаве при 120 °C в течение 30 мин. После стерилизации pH среды должен быть от 7,2 до 7,6.
<a id="p100117"></a>Испытание мясной воды
<a id="p100118"></a>Мясную воду фильтруют. К 100 см3 фильтрата добавляют 1 г сухого ферментативного пептона по [ГОСТ 13805](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13805-76) или другого, используемого в качестве стандартного образца, и 0,5 г хлористого натрия. Устанавливают pH среды (МПБ), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют, как при испытании гидролизатов.
<a id="p100119"></a>Испытание пептона
<a id="p100120"></a>Готовят МПБ так же, как при испытании мясной воды. При этом к 100 см3 мясной воды по ГОСТ 20729 добавляют вместо пептона по [ГОСТ 13805](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13805-76) 1 г испытуемого пептона.
<a id="p100121"></a>Устанавливают pH среды, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют, как при испытании гидролизатов.

###### <a id="p100122"></a>4.1.1.2.2 Подготовка чашек Петри с МПА

<a id="p100123"></a>МПА по ГОСТ 29112 расплавляют в кипящей водяной бане, охлаждают до температуры от 55 до 45 °C, асептически разливают в стерильные чашки Петри толщиной слоя около половины высоты чашки и оставляют при комнатной температуре до застывания.

###### <a id="p100124"></a>4.1.1.2.3 Хранение и реактивация культур тест-штаммов микроорганизмов

<a id="p100125"></a>Культуры тест-штаммов микроорганизмов хранят в лиофилизированном состоянии в ампулах или пробирках с питательными средами. Пробирки закрывают резиновыми или ватно-марлевыми пробками. Ватно-марлевые пробки парафинируют. Лиофилизированные культуры в ампулах хранят при температуре ниже 5 °C, в пробирках - при температуре от 4 до 6 °C.
<a id="p100126"></a>Перед употреблением культуры реактивируют: из ампул и пробирок дважды пересевают в МПБ и культивируют в термостате при (37 +/- 1) °C в течение 20 - 24 ч. Для последующей работы возможны еще два пересева в жидкие питательные среды.

###### <a id="p100127"></a>4.1.1.3 Проведение испытания

<a id="p100128"></a>В пробирку с испытуемой питательной средой, приготовленной по [4.1.1.2.1](#p100112), вносят 0,2 см3 20 - 24-часовой бактериальной культуры, подготовленной по [4.1.1.2.3](#p100124).
<a id="p100129"></a>Пробу инкубируют 20 - 24 ч при (37,0 +/- 0,5) °C, после чего из полученной исходной культуры делают серию десятикратных разведений:
<a id="p100130"></a>в ряд пробирок (от 5 до 7) наливают по 4,5 см3 стерильного изотонического раствора хлористого натрия;
<a id="p100131"></a>в первую пробирку с раствором хлористого натрия пипеткой вносят 0,5 см3 культуры и тщательно перемешивают - разведение в 10 раз, показатель разведения - $10^{1}$ ;
<a id="p100132"></a>во вторую пробирку из первого разведения чистой пипеткой переносят 0,5 см3 суспензии и перемешивают - разведение в 100 раз, показатель разведения - $10^{2}$ ;
<a id="p100133"></a>аналогично делают последующие разведения суспензий.
<a id="p100134"></a>Из двух разведенных суспензий показателями разведения $10^{5}$ и $10^{6}$ или $10^{6}$ и $10^{7}$ (в зависимости от интенсивности роста микроорганизмов), начиная с последней, отбирают из каждой по 0,1 см3 в пять чашек Петри с МПА, подготовленных по [4.1.1.2.2](#p100122), и равномерно распределяют по поверхности среды.
<a id="p100135"></a>Дают жидкости впитаться, после чего чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат температурой (37,0 +/- 0,5) °C на 20 - 24 ч. Затем подсчитывают количество выросших колоний во всех чашках.

###### <a id="p100136"></a>4.1.1.4 Обработка результатов

<a id="p100137"></a>Вычисляют количество КОЕ в 1 см3 исходной культуры $X_{1}$ , клетки/см3, по формуле

<div align="center">

<a id="p100138"></a> $X_{1} = \frac{\sum_{i = 1}^{i = n} (N_{i}R_{i})}{nV_{i}}$ , (1)

</div>


<a id="p100139"></a>где $\sum^{i = n} i = 1$ - суммарное количество колоний в n чашках, КОЕ;
<a id="p100140"></a> $N_{i}$ - количество колоний в i-й чашке, КОЕ;
<a id="p100141"></a> $R_{i}$ - показатель разведения для i-й чашки (от $10^{5}$ до $10^{7}$ );
<a id="p100142"></a>n - количество чашек, в которых производили подсчет количества колоний, шт.;
<a id="p100143"></a> $V_{i}$ - объем разведенных суспензий, вносимых в каждую i-ю чашку, см3.

##### <a id="p100144"></a>4.1.2 Турбидиметрический метод

<a id="p100145"></a>Сущность метода заключается в выращивании тест-штаммов микроорганизмов в жидкой или на плотной питательной среде и фотометрическом измерении оптической плотности культуральной суспензии: жидкой культуры или смыва культуры с плотной среды.

###### <a id="p100146"></a>4.1.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100147"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [4.1.1.1](#p100084).
<a id="p100148"></a>Фотоэлектроколориметр для определения при длинах волн 520 - 560 или 630 - 670 нм, погрешностью измерений коэффициента пропускания +/- 1%.
<a id="p100149"></a>Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 5 мм.
<a id="p100150"></a>Оптический стандарт мутности ОСО 42-28-29-86, эквивалентный 10 международным единицам.
<a id="p100151"></a>Агар микробиологический по [ГОСТ 17206](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-gost-17206-96).
<a id="p100152"></a>Среда Китт-Тароцци.
<a id="p100153"></a>Масло вазелиновое по [ГОСТ 3164](https://bukva.ai/docs/gost-3164-78).
<a id="p100154"></a>Культура тест-штамма анаэробных микроорганизмов Clostridium oedematiens 198 (C.oedematiens).
<a id="p100155"></a>Допускается применять другие средства измерения с метрологическими характеристиками и оборудование с техническими характеристиками не хуже, а также реактивы и среды по качеству не ниже указанных.

###### <a id="p100156"></a>4.1.2.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100157"></a>4.1.2.2.1 Приготовление питательных сред

<a id="p100158"></a>Жидкие питательные среды готовят по [4.1.1.2.1](#p100112).
<a id="p100159"></a>Жидкую питательную среду для анаэробной культуры разливают в пробирки по 10 см3, на столб жидкости сверху наслаивают 1 см3 вазелинового масла и стерилизуют по [4.1.1.2.1](#p100112). Перед использованием среду регенерируют: пробирки со средой выдерживают в кипящей водяной бане от 10 до 20 мин и остужают до температуры не выше 37 °C.
<a id="p100160"></a>Плотные питательные среды готовят из жидких сред, для чего к 100 см3 жидкой среды по [4.1.1.2.1](#p100112) добавляют порошкообразный или мелко нарезанный агар от 1 до 2,5 г (в зависимости от его качества) и кипятят среду до полного растворения агара. Если требуется, приготовленную среду фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр, далее разливают в пробирки и стерилизуют по [4.1.1.2.1](#p100112).
<a id="p100161"></a>Для работы с плотной питательной средой ее разливают в чашки Петри по методу [4.1.1.2.2](#p100122) или используют непосредственно в пробирках. В последнем случае производят "скашивание" питательной среды. С этой целью пробирки со средой кипятят в водяной бане до полного расплавления агара, после чего пробирки укладывают на наклонную плоскость с углом наклона примерно 10 - 20° и выдерживают до застывания среды.

###### <a id="p100162"></a>4.1.2.2.2 Реактивация микробных культур

<a id="p100163"></a>Перед употреблением культуры реактивируют.
<a id="p100164"></a>Реактивация аэробных культур - по [4.1.1.2.3](#p100124).
<a id="p100165"></a>Культуру анаэробного тест-штамма C.oedematiens 198 реактивируют двукратным пересевом в пробирки с предварительно регенерированной средой Китт-Тароцци и инкубированием в течение 20 - 24 ч при (37 +/- 1) °C.

###### <a id="p100166"></a>4.1.2.2.3 Построение градуировочного графика

<a id="p100167"></a>Готовят концентрированную суспензию бактериальной культуры с известным содержанием микробных клеток и делают из нее разведения изотоническим раствором хлористого натрия или питательной средой одним из следующих методов:
<a id="p100168"></a>а) на плотную среду в пробирке или в чашке Петри высевают культуру тест-штамма, например E.coli, объемом от 0,1 до 0,2 см3, культивируют 20 - 24 ч в термостате, после чего смывают культуру небольшим количеством изотонического раствора хлористого натрия. Мутность полученной концентрированной суспензии визуально сравнивают с мутностью оптического стандарта. Доводят мутность суспензии до мутности оптического стандарта добавлением изотонического раствора или бактериальной взвеси. Количество микробных клеток в полученной суспензии оценивают на основании технического документа (ТД) на оптический стандарт мутности. Обычно оно соответствует примерно 1 млрд./см3.
<a id="p100169"></a>Из суспензии делают несколько разведений в соответствии с таблицей 1 (количество микробных клеток в разведенных суспензиях рассчитано для содержания количества микробных клеток в концентрированной суспензии, равного 1 млрд./см3);
<a id="p100170"></a>б) в пробирке с жидкой питательной средой выращивают культуру тест-штамма (например E.coli) и определяют в ней количество микробных клеток бактериологическим методом по [4.1.1](#p100082).

<div align="right">

<a id="p100171"></a>Таблица 1

</div>


<div align="center">

<a id="p100172"></a>Приготовление разведений

</div>



| <a id="p100173"></a>Объем концентрированной суспензии, см3 | <a id="p100174"></a>Объем изотонического раствора, см3 | <a id="p100175"></a>Количество микробных клеток в 1 см3 суспензии |
| --- | --- | --- |
| <a id="p100176"></a>4 | <a id="p100177"></a>1 | <a id="p100178"></a>800000 |
| <a id="p100179"></a>3 | <a id="p100180"></a>2 | <a id="p100181"></a>600000 |
| <a id="p100182"></a>2 | <a id="p100183"></a>3 | <a id="p100184"></a>400000 |
| <a id="p100185"></a>1 | <a id="p100186"></a>4 | <a id="p100187"></a>200000 |


<a id="p100188"></a>Далее из исходной культуры делают разведения, как это указано в [таблице 1](#p100172), используя вместо изотонического раствора питательную среду. Количество клеток в 1 см3 каждой разведенной суспензии рассчитывают с учетом показателя разведения (отношения взятого объема концентрированной суспензии к общему объему разведенной суспензии).
<a id="p100189"></a>Измеряют оптические плотности концентрированной и разведенных суспензий на фотоэлектроколориметре при длине волны 630 - 670 нм (красный светофильтр) или 520 - 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с рабочей длиной 5 мм. В качестве оптического контроля используют изотонический раствор или питательную среду.
<a id="p100190"></a>Строят градуировочный график: по оси абсцисс откладывают количества микробных клеток в 1 см3 суспензий, по оси ординат - соответствующие им оптические плотности.

###### <a id="p100191"></a>4.1.2.3 Проведение испытания


###### <a id="p100192"></a>4.1.2.3.1 Испытание жидкой питательной среды

<a id="p100193"></a>В две-три пробирки с испытуемой питательной средой вносят культуру тест-штамма, подготовленную по [4.1.2.2.2](#p100162): по 0,2 см3 культуры аэробного тест-штамма по 0,5 - 1 см3 под слой вазелинового масла - анаэробного. Пробы инкубируют 20 - 24 ч при (37,0 +/- 0,5) °C.
<a id="p100194"></a>Пробирки с 20 - 24-часовыми культурами встряхивают, пробы заливают в кюветы фотоэлектроколориметра и измеряют оптические плотности суспензий относительно испытуемой среды в качестве оптического контроля при длине волны 630 - 670 или 520 - 560 нм.

###### <a id="p100195"></a>4.1.2.3.2 Испытание плотной питательной среды

<a id="p100196"></a>В две-три чашки Петри с испытуемой плотной средой вносят по 0,5 см3 20 - 24-часовой культуры тест-штамма по [4.1.2.2.2](#p100162) и равномерно распределяют по поверхности. Чашки закрывают и выдерживают в термостате при (37,0 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. Затем делают смыв культуры с плотной питательной среды в чашке 10 см3 изотонического раствора хлористого натрия. Для снятия культуры можно использовать стеклянный шпатель или палочку с резиновым наконечником, которые затем тщательно обмывают раствором хлористого натрия из того же объема.
<a id="p100197"></a>Интенсивность роста микроорганизмов определяют в смыве (при слабом росте) или в десятикратном разведении смыва (при сильном росте), для приготовления которого 0,5 см3 смыва вносят в пробирку с 4,5 см3 раствора хлористого натрия и тщательно перемешивают. Оптическую плотность суспензий измеряют на фотоэлектроколориметре при длинах волн 630 - 670 нм относительно раствора хлористого натрия в качестве оптического контроля.

###### <a id="p100198"></a>4.1.2.4 Обработка результатов

<a id="p100199"></a>Интенсивность роста микроорганизмов выражают как среднее арифметическое результатов двух-трех определений оптических плотностей суспензий (культуры или смыва) или как соответствующее ему количество клеток в 1 см3 культуры, определенное по градуировочному графику.

#### <a id="p100200"></a>4.2 Метод определения чувствительности питательной среды к разным видам микроорганизмов

<a id="p100201"></a>Метод заключается в получении концентрированной микробной суспензии, содержащей определенное количество микробных клеток, приготовлении из нее серии разведенных суспензий, высеве в испытуемую среду точных объемов разведенных суспензий и определении максимального разведения или минимального количества клеток, обеспечивающего рост микробной культуры.

##### <a id="p100202"></a>4.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100203"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [4.1.1.1](#p100084).
<a id="p100204"></a>Тест-штамм аэробных микроорганизмов Streptococcus haemolyticus Dick 1 или другие виды микроорганизмов, показательные для испытуемой среды.

##### <a id="p100205"></a>4.2.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100206"></a>4.2.2.1 Подготовка испытуемой среды и бактериальной культуры

<a id="p100207"></a>Испытуемую среду готовят по [4.1.2.2.1](#p100157), бактериальную культуру - по [4.1.2.2.2](#p100162).

###### <a id="p100208"></a>4.2.2.2 Приготовление суспензии тест-штамма

<a id="p100209"></a>Готовят исходную суспензию бактериальной культуры, содержащую $10^{9}$ клеток в 1 см3, сравнивая ее мутность с мутностью оптического стандарта [(4.1.2.2.3)](#p100166).
<a id="p100210"></a>Из полученной суспензии методом последовательных десятикратных разведений по [4.1.1.3](#p100127) получают пять - семь разведенных суспензий, в которых количество клеток уменьшается пропорционально показателю разведения. Расчетное количество клеток в разных объемах разведенных суспензий приведено в таблице 2.

<a id="p100211"></a>Таблица 2

<div align="right">

<a id="p100212"></a>Расчетное количество клеток

</div>



<table>
<colgroup><col width="34%"><col width="33%"><col width="33%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100213"></a>Показатель разведения</td><td colspan="2"><a id="p100214"></a>Количество клеток в объеме разведенной суспензии</td></tr>
<tr><td><a id="p100215"></a>0,1 см3</td><td><a id="p100216"></a>0,2 см3</td></tr>
<tr><td><a id="p100217"></a>$10^{4}$</td><td><a id="p100218"></a>10000</td><td><a id="p100219"></a>20000</td></tr>
<tr><td><a id="p100220"></a>$10^{5}$</td><td><a id="p100221"></a>1000</td><td><a id="p100222"></a>2000</td></tr>
<tr><td><a id="p100223"></a>$10^{6}$</td><td><a id="p100224"></a>100</td><td><a id="p100225"></a>200</td></tr>
<tr><td><a id="p100226"></a>$10^{7}$</td><td><a id="p100227"></a>10</td><td><a id="p100228"></a>20</td></tr>
</table>



##### <a id="p100229"></a>4.2.3 Проведение испытания

<div align="center">

<a id="p100230"></a>В пробирки с испытуемой средой пипеткой вносят по 0,1 или 0,2 см3 из трех-четырех разведенных суспензий бактериальной культуры, начиная с последней. Пробы инкубируют в термостате при (37,0 +/- 0,5) °C в течение 24 ч. Затем в них для разных разведений визуально определяют наличие роста микроорганизмов (в жидких средах - в виде их помутнения, образования осадка, пленки, газа или других проявлений; на плотных средах - по формированию колоний).

</div>


##### <a id="p100231"></a>4.2.4 Обработка результатов

<a id="p100232"></a>За чувствительность питательной среды принимают показатель максимального разведения культуры, дающего рост микроорганизма в испытуемой среде, или соответствующее ему количество микробных клеток, которое определяют по [таблице 2](#p100212) для внесенного объема бактериальной культуры.

#### <a id="p100233"></a>4.3 Метод определения эффективности плотной питательной среды для роста микроорганизмов

<a id="p100234"></a>Метод заключается в получении концентрированной микробной суспензии, содержащей определенное количество микробных клеток, приготовлении из нее разведенных суспензий, высеве на испытуемую плотную среду точных объемов разведенных суспензий, подсчете количеств выросших колоний и сравнении их с количествами высеянных клеток.

##### <a id="p100235"></a>4.3.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100236"></a>Аппаратура, материалы и реактивы - по [4.2.1](#p100202).

##### <a id="p100237"></a>4.3.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100238"></a>Подготовка культуры исходной суспензии тест-штамма и ее разведений с расчетным количеством клеток - по [4.2.2](#p100205).

##### <a id="p100239"></a>4.3.3 Проведение испытания

<a id="p100240"></a>В 10 чашек Петри с испытуемой питательной средой пипетками вносят по 0,1 или 0,2 см3 двух разведенных суспензий с расчетным количеством клеток 100 (или 200) и 10 (или 20), начиная с последней, по 5 чашек на каждое разведение. Суспензии равномерно распределяют по всей чашке, дают жидкости впитаться, после чего чашки переворачивают вверх дном и ставят в термостат температурой (37,0 +/- 0,5) °C на 20 - 24 ч.
<a id="p100241"></a>Подсчитывают количество колоний, выросших на чашках Петри с испытуемой средой из внесенного объема каждой разведенной суспензии.

##### <a id="p100242"></a>4.3.4 Обработка результатов

<a id="p100243"></a>Определяют среднее арифметическое подсчитанного количества колоний в каждом разведении (для пяти чашек), сравнивают его с расчетным количеством [(таблица 2)](#p100212) и выражают в процентах.
<a id="p100244"></a>За результат испытаний эффективности среды принимают среднее арифметическое результатов вычислений для обоих разведений, выраженное в процентах.

#### <a id="p100245"></a>4.4 Методы определения влияния питательной среды на типичность микроорганизмов

<a id="p100246"></a>Влияние питательной среды на типичность тест-штаммов микроорганизмов определяют сравнением со свойствами, приведенными в таблице 3.

<a id="p100247"></a>Таблица 3

<a id="p100248"></a>Морфологические и культурально-биохимические
свойства тест-штаммов


<table>
<colgroup><col width="15%"><col width="17%"><col width="17%"><col width="15%"><col width="18%"><col width="19%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100249"></a>Свойство тест-штамма</td><td colspan="5"><a id="p100250"></a>Характеристика тест-штамма микроорганизмов</td></tr>
<tr><td><a id="p100251"></a>E.coli</td><td><a id="p100252"></a>S.flexneri</td><td><a id="p100253"></a>S.aureus</td><td><a id="p100254"></a>E.faecalis</td><td><a id="p100255"></a>C.xerosis</td></tr>
<tr><td><a id="p100256"></a>Форма и размер клеток</td><td><a id="p100257"></a>Палочки длиной 0,3 - 0,4 мкм</td><td><a id="p100258"></a>Палочки длиной 0,3 - 0,4 мкм</td><td><a id="p100259"></a>Кокки диаметром<br>0,5 - 1 мкм</td><td><a id="p100260"></a>Овоидные, слегка вытянутые кокки диаметром<br>0,5 - 1 мкм</td><td><a id="p100261"></a>Короткие палочки, иногда булавовидной формы размерами<br>(0,3 - 0,8 x 1,5 - 8,0) мкм</td></tr>
<tr><td><a id="p100262"></a>Расположение клеток в мазке</td><td><a id="p100263"></a>Одиночные клетки</td><td><a id="p100264"></a>Одиночные клетки</td><td><a id="p100265"></a>Одиночные, иногда парами</td><td><a id="p100266"></a>Парами, иногда короткими цепями</td><td><a id="p100267"></a>Одиночные или парами</td></tr>
<tr><td><a id="p100268"></a>Окраска по Граму</td><td><a id="p100269"></a>-</td><td><a id="p100270"></a>-</td><td><a id="p100271"></a>+</td><td><a id="p100272"></a>+</td><td><a id="p100273"></a>+</td></tr>
<tr><td><a id="p100274"></a>Форма роста культуры в жидкой среде (МПБ)</td><td><a id="p100275"></a>Сильное равномерное помутнение, легко разбивающийся осадок</td><td><a id="p100276"></a>Слабое равномерное помутнение, легко разбивающийся осадок</td><td><a id="p100277"></a>Равномерное помутнение и образование осадка</td><td><a id="p100278"></a>Слабое равномерное помутнение, осадок в виде косички</td><td><a id="p100279"></a>Слабое помутнение, придонный рост с образованием осадка</td></tr>
<tr><td><a id="p100280"></a>Форма колоний на плотной среде (МПА)</td><td><a id="p100281"></a>Блестящие или полупрозрачные колонии<br>S-формы</td><td><a id="p100282"></a>Блестящие или полупрозрачные колонии<br>S-формы</td><td><a id="p100283"></a>Выпуклые округлые колонии, диаметром<br>1 - 4 мм, желтого цвета, S-, реже -<br>R-формы</td><td><a id="p100284"></a>Мелкие колонии, диаметром<br>0,5 - 1 мм, мутные серовато-белые; в газоне - кожистая пленка</td><td><a id="p100285"></a>Мелкие колонии, диаметром не более 1 - 3 мм, S- или R-формы</td></tr>
<tr><td><a id="p100286"></a>Сбраживание сахаров:</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100287"></a>глюкоза</td><td><a id="p100288"></a>+, газ</td><td><a id="p100289"></a>+</td><td><a id="p100290"></a>+</td><td><a id="p100291"></a>+</td><td><a id="p100292"></a>+/-</td></tr>
<tr><td><a id="p100293"></a>галактоза</td><td><a id="p100294"></a>+</td><td><a id="p100295"></a>+</td><td><a id="p100296"></a>+</td><td><a id="p100297"></a>+</td><td><a id="p100298"></a>+/-</td></tr>
<tr><td><a id="p100299"></a>лактоза</td><td><a id="p100300"></a>+, газ</td><td><a id="p100301"></a>+/-</td><td><a id="p100302"></a>+</td><td><a id="p100303"></a>+</td><td><a id="p100304"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100305"></a>мальтоза</td><td><a id="p100306"></a>+, газ</td><td><a id="p100307"></a>+</td><td><a id="p100308"></a>+</td><td><a id="p100309"></a>+</td><td><a id="p100310"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100311"></a>сахароза</td><td><a id="p100312"></a>-</td><td><a id="p100313"></a>+/-</td><td><a id="p100314"></a>+</td><td><a id="p100315"></a>+</td><td><a id="p100316"></a>+</td></tr>
<tr><td><a id="p100317"></a>раффиноза</td><td><a id="p100318"></a>+</td><td><a id="p100319"></a>+/-</td><td><a id="p100320"></a>-</td><td><a id="p100321"></a>-</td><td><a id="p100322"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100323"></a>ксилоза</td><td><a id="p100324"></a>+, газ</td><td><a id="p100325"></a>-</td><td><a id="p100326"></a>-</td><td><a id="p100327"></a>-</td><td><a id="p100328"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100329"></a>арабиноза</td><td><a id="p100330"></a>+, газ</td><td><a id="p100331"></a>+</td><td><a id="p100332"></a>-</td><td><a id="p100333"></a>-</td><td><a id="p100334"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100335"></a>сорбит</td><td><a id="p100336"></a>+, газ</td><td><a id="p100337"></a>+/-</td><td><a id="p100338"></a>+/-</td><td><a id="p100339"></a>+</td><td><a id="p100340"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100341"></a>маннит</td><td><a id="p100342"></a>+, газ</td><td><a id="p100343"></a>+</td><td><a id="p100344"></a>+/-</td><td><a id="p100345"></a>+</td><td><a id="p100346"></a>-</td></tr>
<tr><td colspan="6"><a id="p100347"></a>Примечание. Знаком "+" обозначают микроорганизмы, красящиеся по Граму или сбраживающие сахара; знаком "-" - не красящиеся по Граму или не сбраживающие сахара; знаком "+/-" - реакция вариабельна, в качестве теста не рекомендуется.</td></tr>
</table>


<a id="p100348"></a>4.4.1. Метод определения влияния питательной среды на морфологию клеток тест-штаммов микроорганизмов и характер их окраски по Граму
<a id="p100349"></a>Сущность метода заключается в посеве реактивированной микробной культуры тест-штамма в испытуемую жидкую или на плотную питательную среду, инкубировании посевов, трех-, пятикратных пересевах культуры на свежие порции той же питательной среды, приготовлении мазков из получаемых в каждом пассаже культур, окраске мазков по Граму, просмотре окрашенных мазков в оптическом микроскопе и оценке характера окраски по Граму и морфологии клеток в соответствии с [таблицей 3](#p100248).

###### <a id="p100350"></a>4.4.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100351"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [4.1.1.1](#p100084).
<a id="p100352"></a>Микроскоп световой биологический по ГОСТ 8074, обеспечивающий увеличение $70^{\times}$ .
<a id="p100353"></a>Стекла предметные для микропрепаратов по [ГОСТ 9284](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9284-75).
<a id="p100354"></a>Масло иммерсионное для микроскопии по [ГОСТ 13739](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13739-78).
<a id="p100355"></a>Горелка газовая или спиртовка.
<a id="p100356"></a>Вода питьевая по ГОСТ Р 51232 и [[1]](#p100709).
<a id="p100357"></a>Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
<a id="p100358"></a>Йод кристаллический по [ГОСТ 4159](https://bukva.ai/docs/gost-4159-79), раствор концентрации 50 г/дм3 в этиловом спирте.
<a id="p100359"></a>Калий йодистый по [ГОСТ 4232](https://bukva.ai/docs/gost-4232-74).
<a id="p100360"></a>Кристаллический фиолетовый.
<a id="p100361"></a>Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор концентрации 5 г/дм3.
<a id="p100362"></a>Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
<a id="p100363"></a>Фуксин кислый.
<a id="p100364"></a>Фуксин основной, раствор концентрации 50 г/дм3 в этиловом спирте.

###### <a id="p100365"></a>4.4.1.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100366"></a>4.4.1.2.1 Приготовление реактивов для окраски по Граму (модификация Г.П. Калины)

<a id="p100367"></a>Приготовление реактива 1
<a id="p100368"></a>В 100 см3 этилового спирта растворяют 0,5 г кристаллического фиолетового.
<a id="p100369"></a>Приготовление реактива 2
<a id="p100370"></a>5 г йодистого калия растворяют в 1 дм3 спирта в водяной бане при температуре (45 +/- 5) °C при постоянном перемешивании.
<a id="p100371"></a>К 96 см3 спиртового раствора йодистого калия добавляют 2 см3 спиртового раствора основного фуксина и 2 см3 спиртового раствора йода.

###### <a id="p100372"></a>4.4.1.2.2 Подготовка питательных сред и культур тест-штаммов

<a id="p100373"></a>Подготовка питательных сред и культур тест-штаммов - по [4.1.1.2](#p100111).

###### <a id="p100374"></a>4.4.1.3 Проведение испытания

<a id="p100375"></a>В пробирки или чашки Петри с испытуемой и контрольной (МПБ или МПА) питательными средами вносят по 0,2 см3 20 - 24-часовых культур тест-штаммов и инкубируют от 20 до 24 ч при температуре (37 +/- 1) °C. Из полученных культур на испытуемой и контрольной средах отбирают пробы для пересева на свежие порции питательных сред (второй пассаж). Аналогично делают еще один - три пересева 20 - 24-часовых культур на свежие порции питательных сред (всего три - пять пассажей).
<a id="p100376"></a>Из каждого пассажа на два чистых предметных стекла бактериальной петлей наносят по капле дистиллированной воды, вносят в нее петлей небольшое количество микробной культуры тест-штамма в испытуемой и контрольной среде и каплю реактива 1. Смесь распределяют петлей на участке площадью примерно 1 см2.
<a id="p100377"></a>Приготовленный мазок препарата подсушивают на воздухе, после чего фиксируют: быстро проводят два-три раза над верхней частью пламени горелки.
<a id="p100378"></a>Препарат промывают питьевой водой и тщательно просушивают фильтровальной бумагой.
<a id="p100379"></a>После просушивания на препарат наливают реактив 2 так, чтобы жидкость покрыла всю поверхность стекла, и выдерживают 0,5 - 1 мин. Раствор сливают. Предметное стекло ополаскивают проточной водой. Препарат просушивают фильтровальной бумагой.
<a id="p100380"></a>Мазки просматривают под микроскопом с иммерсионной системой.
<a id="p100381"></a>В результате окрашивания микроорганизмы, красящиеся по Граму (грамположительные), приобретают темно-фиолетовый цвет; не красящиеся по Граму (грамотрицательные) - ярко-малиновый или красный цвет.
<a id="p100382"></a>При микроскопии мазков одновременно оценивают морфологию клеток:
- <a id="p100383"></a>размеры;
- <a id="p100384"></a>форму: прямая (палочки), круглая и овоидная (кокки), изогнутая, спиральная, ветвящаяся, лентовидная, веретеновидная и т.д.;
- <a id="p100385"></a>наличие спор, жгутиков;
- <a id="p100386"></a>расположение в мазке (одиночное, парами, короткими или длинными цепочками, тетрадами, скоплениями, нитями и т.д.).

###### <a id="p100387"></a>4.4.1.4 Оценка результатов

<a id="p100388"></a>Морфология клеток тест-штаммов и отношение к окраске по Граму должны соответствовать характеристике по [таблице 3](#p100248), что свидетельствует об отсутствии влияния питательной среды на типичность микроорганизмов. При несоответствии морфологии клеток и окраски по Граму требованиям [таблицы 3](#p100248) в двух пассажах из пяти (или в одном из трех) испытание дважды повторяют с новыми пробами испытуемой питательной среды и при повторении несоответствия среду бракуют.
<a id="p100389"></a>При несоответствии морфологии клеток тест-штамма и характера окраски по Граму в контрольной среде опыт дважды повторяют с новыми пробами контрольной питательной среды. При несоответствии тех же свойств тест-штамма свойствам [таблицы 3](#p100248) в двух повторных определениях меняют исходную культуру тест-штамма как несоответствующую своему виду и типу.

##### <a id="p100390"></a>4.4.2 Метод определения влияния питательной среды на формы роста тест-штаммов в питательных средах

<a id="p100391"></a>Сущность метода заключается в посеве реактивированной микробной культуры тест-штамма в испытуемую жидкую или на плотную питательную среду, инкубировании посевов, трех-, пятикратных пересевах культуры на свежие порции той же питательной среды, визуальном просмотре выросших культур в жидких питательных средах, визуальном или при малом увеличении просмотре колоний - на плотных питательных средах и оценке форм их роста в соответствии с [таблицей 3](#p100248).

###### <a id="p100392"></a>4.4.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100393"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [4.1.1.1](#p100084).
<a id="p100394"></a>Лупа складная карманная по ГОСТ 25706.
<a id="p100395"></a>Микроскоп световой биологический по ГОСТ 8074, обеспечивающий увеличение $70^{\times}$ .

###### <a id="p100396"></a>4.4.2.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100397"></a>Подготовка тест-штаммов и питательных сред - по [4.1.1.2](#p100111).

###### <a id="p100398"></a>4.4.2.3 Проведение испытания

<a id="p100399"></a>4.4.2.3.1. Реактивированную культуру тест-штамма высевают на испытуемую и контрольную среду (МПБ или МПА), инкубируют посевы и делают от трех до пяти пересевов по [4.4.1.3](#p100374).
<a id="p100400"></a>В каждом пассаже на испытуемой и контрольной среде визуально оценивают формы роста микроорганизмов в жидких питательных средах; визуально, с помощью лупы или под малым увеличением микроскопа - формы колоний на плотных средах.

###### <a id="p100401"></a>4.4.2.3.2 В жидких питательных средах различают следующие формы роста микроорганизмов:

- <a id="p100402"></a>с равномерным помутнением среды при неизменной окраске или с изменением цвета,
- <a id="p100403"></a>придонный рост с образованием осадка разной консистенции (рыхлый, гомогенный, хлопьевидный, в виде косички, волокнистый, пастообразный или др.) на дне пробирки,
- <a id="p100404"></a>пристеночный - при прозрачной жидкой части культуры наличие рыхлых хлопьев или компактных зерен, прикрепленных к поверхности стенок пробирки,
- <a id="p100405"></a>поверхностный рост с образованием пленки (белой или окрашенной, тонкой, толстой, влажной, сухой кожистой или др.) на поверхности среды.

###### <a id="p100406"></a>4.4.2.3.3 На плотных питательных средах колонии различают по:

- <a id="p100407"></a>величине (диаметру);
- <a id="p100408"></a>форме (круглая, амебовидная или другая);
- <a id="p100409"></a>контуру края (ровный, волнистый, бахромчатый, расплывчатый и т.д.);
- <a id="p100410"></a>цвету;
- <a id="p100411"></a>рельефу (плоский, выпуклый);
- <a id="p100412"></a>консистенции (слизистая, кожистая, сухая и т.д.);
- <a id="p100413"></a>характеру поверхности (блестящая и гладкая - S-форма, шероховатая и матовая - R-форма).

###### <a id="p100414"></a>4.4.2.4 Оценка результатов

<a id="p100415"></a>Формы роста тест-штаммов в жидкой питательной среде и формы образуемых ими колоний - на плотной должны соответствовать характеристике в [таблице 3](#p100248), что свидетельствует об отсутствии влияния питательной среды на типичность микроорганизмов. Если наблюдают несоответствие установленным характеристикам, которое сохраняется вплоть до последнего пассажа, среду бракуют.
<a id="p100416"></a>При несоответствии форм роста тест-штамма в жидкой контрольной среде и форм колоний - на плотной опыт дважды повторяют с новыми пробами контрольных питательных сред. При несоответствии типичных свойств тест-штамма в повторных опытах меняют исходную культуру тест-штамма как диссоциированную или контаминированную другим микроорганизмом.
<a id="p100417"></a>4.4.3. Метод определения влияния питательной среды на сахаролитическую способность тест-штаммов (способность сбраживать сахара)
<a id="p100418"></a>Сущность метода заключается в посеве реактивированной микробной культуры тест-штамма на испытуемую питательную среду, инкубировании посевов, трех-, пятикратных пересевах на свежие порции той же питательной среды, пересевах из культур, выросших в каждом пассаже, в среды Гисса и визуальной оценке сбраживания сахаров по изменению цвета и образованию газа в соответствии с [таблицей 3](#p100248).

###### <a id="p100419"></a>4.4.3.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100420"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [4.4.1.1](#p100350).
<a id="p100421"></a>Пробирки с поплавками - трубочками, запаянными с одного конца, стерильные.
<a id="p100422"></a>Арабиноза.
<a id="p100423"></a>Галактоза.
<a id="p100424"></a>Глюкоза кристаллическая гидратная по ГОСТ 975.
<a id="p100425"></a>Ксилоза.
<a id="p100426"></a>Лактоза.
<a id="p100427"></a>Мальтоза.
<a id="p100428"></a>Маннит.
<a id="p100429"></a>Раффиноза.

<div align="center">

<a id="p100430"></a>Сахароза.<br>
<a id="p100431"></a>Сорбит.<br>
<a id="p100432"></a>Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, раствор концентрации 1 моль/дм3.

</div>


###### <a id="p100433"></a>4.4.3.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100434"></a>Подготовка тест-штаммов
<a id="p100435"></a>Тест-штаммы реактивируют по [4.1.1.2](#p100111).
<a id="p100436"></a>Приготовление индикатора Андредэ
<a id="p100437"></a>Растворяют 0,5 г кислого фуксина в 16 см3 раствора гидроокиси натрия концентрации 1 моль/дм3, прибавляют 100 см3 дистиллированной воды, выдерживают 24 ч при 37 °C, кипятят в течение 5 мин и фильтруют. Хранят во флаконах темного стекла. Готовый индикатор должен быть соломенно-желтого цвета.
<a id="p100438"></a>Приготовление сред Гисса
<a id="p100439"></a>К 100 см3 дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 г хлористого натрия и нагревают до растворения ингредиентов. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 7,0 - 7,4, прибавляют 0,5 - 1,0 г одного из сахаров (глюкозы, галактозы, лактозы, мальтозы, сахарозы, ксилозы, маннита или другого) и 1 см3 индикатора Андредэ. Готовую среду разливают в пробирки, стерилизованные вместе с поплавками, которые кладут запаянным концом вверх. Пробирки со средами трижды стерилизуют текучим паром при 112 °C по 20 - 30 мин.

###### <a id="p100440"></a>4.4.3.3 Проведение испытания

<a id="p100441"></a>В пробирки или чашки Петри с испытуемой и контрольной (МПБ или МПА) питательными средами вносят по 0,2 см3 20 - 24-часовых культур тест-штаммов и инкубируют от 20 до 24 ч при температуре (37 +/- 0,5) °C.
<a id="p100442"></a>В среды Гисса с различными сахарами, приготовленные по [4.4.3.2](#p100433) с соблюдением условий стерильности, вносят по 0,2 - 0,5 см3 20 - 24-часовой культуры тест-штамма микроорганизма в испытуемой и контрольной питательной среде. Пробы выдерживают при (37,0 +/- 0,5) °C и оценивают изменения питательных сред через 24 и 48 ч. Розовая окраска сред свидетельствует о процессе кислотного брожения сахара; появление пузырьков в поплавках - об образовании газа.

###### <a id="p100443"></a>4.4.3.4 Оценка результатов

<a id="p100444"></a>Тест-штаммы должны соответствовать характеристикам [таблицы 3](#p100248), что свидетельствует об отсутствии влияния испытуемой питательной среды на типичность микроорганизмов. В противном случае среду бракуют.
<a id="p100445"></a>При несоответствии сахаролитических свойств тест-штаммов в культурах, полученных в контрольных средах, опыт дважды повторяют с новыми пробами контрольных питательных сред. При несовпадении типичных свойств тест-штаммов данным [таблицы 3](#p100248) в повторных опытах меняют исходную культуру тест-штамма как несоответствующую виду и штамму.


### 5. <a id="p100446"></a>Методы определения пригодности питательных сред для токсинообразования микроорганизмов по силе образуемого токсина



#### <a id="p100447"></a>5.1 Метод определения силы токсина на белых мышах

<a id="p100448"></a>Сущность метода заключается в культивировании в испытуемой среде тест-штамма токсинообразующего микроорганизма, стерилизующей фильтрации культуры, приготовлении разведений фильтрата, содержащего токсин, определении максимального разведения фильтрата, вызывающего 100%-ную гибель белых мышей, и расчете силы токсина.

##### <a id="p100449"></a>5.1.1 Аппаратура и материалы

<a id="p100450"></a>Аппаратура и материалы по [4.1.1.1](#p100084).
<a id="p100451"></a>Установка для стерилизующей фильтрации с асбестовым стерилизующим или мембранным фильтром диаметром пор 0,22 мкм.
<a id="p100452"></a>Тест-штамм микроорганизмов: Clostridium perfringens (C.perfringens) типа С, ВТ - или культура другого вида токсинообразующих микроорганизмов, показательная для испытуемой среды.
<a id="p100453"></a>Белые мыши массой от 16 до 18 г.
<a id="p100454"></a>Шприц стерильный вместимостью 1 или 2 см3.
<a id="p100455"></a>Среда Китт-Тароцци.

##### <a id="p100456"></a>5.1.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100457"></a>Питательную среду готовят по [4.1.2.2.1](#p100157) (для анаэробной культуры).
<a id="p100458"></a>Тест-штамм C.perfringens реактивируют по [4.1.2.2.2](#p100162) (для анаэробного тест-штамма).

##### <a id="p100459"></a>5.1.3 Проведение испытания

<a id="p100460"></a>В две-три пробирки с испытуемой средой, приготовленной по [5.1.2](#p100456), вносят под слой вазелинового масла по 1 см3 20 - 24-часовой культуры C.perfringens по [5.1.2](#p100456). Инкубируют от 5 до 6 ч при температуре (37,0 +/- 0,5) °C, после чего выросшую культуру (без вазелинового масла) фильтруют через стерилизующие или мембранные фильтры. Фильтраты объединяют.
<a id="p100461"></a>Готовят ряд разведений фильтрата изотоническим раствором хлористого натрия: с шагом 10 - от двух до четырех разведений (показатели разведения: 10, $10^{2}$ , $10^{3}$ и $10^{4}$ ); с шагом 2 - для более детального анализа - от шести до десяти разведений (показатели разведения: 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 612 и 1224).
<a id="p100462"></a>По 0,5 см3 из каждого разведения вводят двум - шести белым мышам в вену хвоста или внутрибрюшинно. Проводят наблюдения за мышами от 1 ч до 4 сут и определяют максимальное разведение, которое вызывает 100%-ную гибель мышей.

##### <a id="p100463"></a>5.1.4 Обработка результатов

<a id="p100464"></a>Вычисляют силу токсина, DLM/см3, умножая показатель максимального разведения на коэффициент 2.

#### <a id="p100465"></a>5.2 Метод определения силы токсина по индексу ингибирования микробной тест-культуры

<a id="p100466"></a>Сущность метода заключается в культивировании в испытуемой среде тест-штамма токсинообразующего микроорганизма, стерилизующей фильтрации культуры, приготовлении разведений фильтрата токсина питательной средой (МПБ), инкубировании чувствительного тест-штамма микроорганизма (E.coli) в фильтрате токсина, его разведениях средой (МПБ) и в контрольных средах, определении оптических плотностей культур E.coli и вычислении степени ингибирования роста E.coli и силы токсина.

##### <a id="p100467"></a>5.2.1 Аппаратура и материалы

<a id="p100468"></a>Аппаратура и материалы по [5.1.1](#p100449).
<a id="p100469"></a>Фотоэлектроколориметр для измерения при длинах волн 630 - 670 нм, погрешностью измерений коэффициента пропускания +/- 1%.
<a id="p100470"></a>Кюветы фотометрические из оптического стекла или пластмассы толщиной поглощающего слоя 5 мм.

##### <a id="p100471"></a>5.2.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100472"></a>Тест-штамм C.perfringens реактивируют по [4.1.2.2.2](#p100162).

<div align="center">

<a id="p100473"></a>Тест-штамм E.coli реактивируют в МПБ по [4.1.1.2.3](#p100124).

</div>


##### <a id="p100474"></a>5.2.3 Проведение испытания

<a id="p100475"></a>5.2.3.1. В две-три пробирки с 10 см3 испытуемой среды вносят под слой вазелинового масла по 1 см3 20 - 24-часовой культуры C.perfringens по [5.2.2](#p100471). Инкубируют от 5 до 6 ч при температуре (37,0 +/- 0,5) °C, после чего выросшую культуру (без вазелинового масла) фильтруют через стерилизующие или мембранные фильтры. Фильтраты объединяют.
<a id="p100476"></a>Вносят фильтрат (токсин) в МПБ по [ГОСТ 20730](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20730-75-gosstandart-sssr) в разных соотношениях объемов фильтрата и МПБ, например, 3:1; 1:1; 1:3.
<a id="p100477"></a>5.2.3.2. В восемь стерильных пробирок вносят по 5 - 8 см3 проб неразведенного токсина и трех его разведений в МПБ, по две пробирки на каждую пробу, в которых объемные доли токсина составляют 100, 75, 50 и 25% соответственно.
<a id="p100478"></a>В другие двенадцать пробирок вносят по 5 - 8 см3 испытуемой среды (контроль для неразведенного токсина) и трех ее разведений мясопептонным бульоном (контрольные среды для разведенного токсина) - по три пробирки на каждую среду.
<a id="p100479"></a>В восемь пробирок с токсином и восемь пробирок с контрольными средами высевают по 0,2 см3 20 - 24-часовой культуры E.coli и инкубируют при 37 °C от 15 до 17 ч. Затем определяют оптические плотности всех инкубированных культур при длине волны от 630 до 670 нм относительно незасеянной контрольной среды (для каждой среды свой оптический контроль).
<a id="p100480"></a>5.2.3.3. Рассчитывают средние арифметические результатов двух параллельных определений оптических плотностей для каждой пробы.

##### <a id="p100481"></a>5.2.4 Обработка результатов

<a id="p100482"></a>5.2.4.1. Вычисляют степени ингибирования роста E.coli неразведенным токсином и его разведениями $I_{n}$ , %, по формуле

<div align="center">

<a id="p100483"></a> $I_{n} = \frac{A_{n}}{A_{k}} \times 100$ , (2)

</div>


<a id="p100484"></a>где $A_{n}$ - среднее арифметическое оптических плотностей культуры E.coli в фильтрате токсина или в его разведениях;
<a id="p100485"></a> $A_{k}$ - среднее арифметическое оптических плотностей культуры E.coli в соответствующей контрольной среде;
<a id="p100486"></a>100 - коэффициент пересчета в проценты.
<a id="p100487"></a>5.2.4.2. Строят график зависимости степени ингибирования от объемной доли токсина в среде культивирования, который имеет линейный характер. По оси абсцисс откладывают объемные доли токсина в среде E.coli в процентах: 100% (исходный фильтрат), 75; 50 и 25% (разведения фильтрата). По оси ординат откладывают соответствующие этим процентам степени ингибирования $I_{n}$ , %. По графику определяют объемную долю токсина, соответствующую 50%-ной степени ингибирования роста E.coli, и принимают ее за единицу ингибирования $(IU_{50})$ .

###### <a id="p100488"></a>5.2.4.3 Индекс ингибирования для исходного неразведенного фильтрата $X_{2}$ , $IU_{50}$ , вычисляют по формуле


<div align="center">

<a id="p100489"></a> $X_{2} = \frac{100}{C}$ , (3)

</div>


<a id="p100490"></a>где C - объемная доля токсина, соответствующая 50%-ной степени ингибирования роста E.coli, %;
<a id="p100491"></a>100 - объемная доля токсина в неразведенном фильтрате, %.


### 6. <a id="p100492"></a>Методы определения ростовых свойств питательных сред для культур клеток



#### <a id="p100493"></a>6.1 Метод определения ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток

<a id="p100494"></a>Сущность метода состоит в приготовлении концентрированной суспензии первичной культуры клеток фибробластов перепелиных или куриных эмбрионов, посеве приготовленных суспензий на испытуемую и контрольную среды, микроскопическом определении процента роста монослоя, расчете ростовых свойств среды в баллах и классификации среды.

##### <a id="p100495"></a>6.1.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100496"></a>Анализатор жидкости потенциометрический по ГОСТ 27987, диапазоном измерения pH от 4 до 8 и погрешностью измерения +/- 0,1.
<a id="p100497"></a>pH-электрод стеклянный типа ЭСЛ-41 Г.
<a id="p100498"></a>Кондуктометр, позволяющий проводить измерения от 0 до 5 мкСим с погрешностью +/- 0,1 мкСим.
<a id="p100499"></a>Термометр ртутный стеклянный по [ГОСТ 28498](https://bukva.ai/docs/gost-28498-90), диапазоном измерения от 0 до 100 °C и погрешностью измерения +/- 0,5 °C.
<a id="p100500"></a>Часы наручные механические по ГОСТ 10733, 4-й группы, 2-го класса, средним суточным ходом от минус 20 до плюс 55 с/сут.
<a id="p100501"></a>Пипетки по [ГОСТ 29227](https://bukva.ai/docs/gost-29227-91), вместимостью 0,5; 1; 2; 10 и 25 см3, 2-го класса точности.
<a id="p100502"></a>Цилиндры по [ГОСТ 1770](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74), вместимостью 25, 100, 500 и 1000 см3.
<a id="p100503"></a>Термостат, обеспечивающий температуру нагрева (37,0 +/- 0,5) °C.
<a id="p100504"></a>Микроскоп световой биологический по ГОСТ 8074, обеспечивающий увеличение $70^{\times}$ .
<a id="p100505"></a>Центрифуга частотой вращения от 1000 до $3000\text{мин}^{- 1}$ .
<a id="p100506"></a>Камера Горяева рабочим объемом 0,9 мм3.
<a id="p100507"></a>Ножницы глазные.
<a id="p100508"></a>Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.
<a id="p100509"></a>Сосуды культуральные рабочей площадью 40 см2.
<a id="p100510"></a>Стекла предметные для микропрепаратов по [ГОСТ 9284](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9284-75).
<a id="p100511"></a>Флаконы вместимостью 500 см3.
<a id="p100512"></a>Чашки Петри по ГОСТ 25336.
<a id="p100513"></a>Калий йодистый по [ГОСТ 4232](https://bukva.ai/docs/gost-4232-74), раствор массовой доли 2% в этиловом спирте.
<a id="p100514"></a>Масло иммерсионное для микроскопии по [ГОСТ 13739](https://bukva.ai/docs/standart-gost-13739-78).
<a id="p100515"></a>Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
<a id="p100516"></a>Сыворотка крови крупного рогатого скота, предварительно тестированная (референс-сыворотка), нативная без консерванта.
<a id="p100517"></a>Раствор Хенкса сбалансированный солевой.
<a id="p100518"></a>Трипсин, раствор массовой доли 0,25%.
<a id="p100519"></a>Синь трипановая, раствор массовой доли 0,1%.
<a id="p100520"></a>Кристалл-виолета, раствор массовой доли 0,1%.
<a id="p100521"></a>Динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты (трилон Б, версен) по [ГОСТ 10652](https://bukva.ai/docs/gost-10652-73), раствор массовой доли 0,02%.
<a id="p100522"></a>Натрий углекислый кислый по [ГОСТ 4201](https://bukva.ai/docs/gost-4201-79), раствор массовой доли 7,5%, для культур клеток.
<a id="p100523"></a>Яйца с эмбрионами куриные или перепелиные.
<a id="p100524"></a>Среды питательные гидролизные - образцы сухие стандартные ССО-ФГМС и ССО-ГЛА.

##### <a id="p100525"></a>6.1.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100526"></a>6.1.2.1 Приготовление тест-культуры тканей

<a id="p100527"></a>Перепелиные или куриные яйца из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям, инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °C от 9 до 10 сут. Яйца с хорошо развитыми подвижными эмбрионами помещают в металлические лотки пугой вверх и двукратно погружают в раствор йодистого калия. В боксе поверхность яиц фламбируют и вскрывают по окружности пути глазными ножницами. Стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают хорионаллантоисную оболочку и извлекают эмбрион в чашку Петри. У эмбриона удаляют голову и внутренние органы. Тушку измельчают ножницами на фрагменты длиной не менее 0,5 мм, помещают во флаконы, добавляют раствор Хенкса температурой от 18 до 25 °C и объемом, равным двух-, трехкратному объему измельченной ткани. После отстаивания смеси надосадочную жидкость сливают. В суспензию вносят такой же объем свежей порции раствора Хенкса и после отстаивания надосадочную жидкость также сливают. Промывают ткань три-четыре раза до полного осветления надосадочной жидкости.
<a id="p100528"></a>Во флаконы с измельченной тканью добавляют раствор трипсина температурой 37 °C: три объема на один объем ткани. Флаконы выдерживают при температуре от 18 до 25 °C от 30 до 45 мин, постоянно перемешивая их содержимое. Надосадочную жидкость сливают. К осадку добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5% от объема осадка. Суспензию центрифугируют 10 мин при частоте вращения $1000\text{мин}^{- 1}$ . Надосадочную жидкость удаляют. К осадку добавляют два - четыре объема раствора Хенкса, осадок ресуспендируют и получают концентрированную суспензию.

###### <a id="p100529"></a>6.1.2.2 Подсчет количества клеток в концентрированной суспензии

<a id="p100530"></a>Отбирают пробу суспензии и разводят ее в 10 раз: к одному объему концентрированной суспензии (0,3 - 0,5 см3) добавляют девять объемов раствора Хенкса (2,7 - 4,5 см3). К 2 - 3 см3 полученной суспензии добавляют равный объем раствора трипановой сини и перемешивают. Каплю клеточной суспензии помещают на край покровного стекла так, чтобы она заполнила камеру Горяева.
<a id="p100531"></a>По всей камере под микроскопом подсчитывают общее количество клеток (окрашенных и неокрашенных) и количество жизнеспособных (неокрашенных). Конгломераты считают за одну клетку. Подсчет проводят трижды и за результат принимают среднее арифметическое результатов определений, полученных для общего количества клеток и количества жизнеспособных клеток в камере.
<a id="p100532"></a>Количество жизнеспособных клеток в 1 см3 концентрированной суспензии $X_{3}$ , тыс./см3, вычисляют по формуле

<a id="p100533"></a> $X_{3} = \frac{AB1000}{0,9}$ , (4)

<a id="p100534"></a>где A - среднее арифметическое результатов определений количества жизнеспособных клеток, клетки;

<div align="center">

<a id="p100535"></a>B - показатель разведения суспензии растворами Хенкса и трипановой сини;

</div>

<a id="p100536"></a>0,9 - объем камеры Горяева, мм3;
<a id="p100537"></a>1000 - коэффициент пересчета кубических миллиметров в кубические сантиметры.
<a id="p100538"></a>Общее количество клеток в 1 см3 суспензии $X_{4}$ , тыс./см3, вычисляют по формуле

<a id="p100539"></a> $X_{4} = \frac{CB1000}{0,9}$ , (5)

<a id="p100540"></a>где C - среднее арифметическое результатов определений общего количества клеток, клетки;
<a id="p100541"></a>остальные величины - по [формуле 4](#p100533).

###### <a id="p100542"></a>6.1.2.3 Приготовление контрольных питательных сред из стандартных образцов

<a id="p100543"></a>Стандартные образцы питательных сред ССО-ГЛА или ССО-ФГМС растворяют в 400 см3 стерильной деминерализованной воды электропроводностью не более 0,5 мкСим во флаконах вместимостью 500 см3. Флаконы закрывают резиновыми пробками. Растворы хранят не более 2 мес при температуре от 6 до 10 °C.
<a id="p100544"></a>Перед использованием растворов ССО в качестве контрольных сред корректируют pH до 7,0 - 7,4 добавлением раствора кислого углекислого натрия (около 3 см3).

##### <a id="p100545"></a>6.1.3 Проведение испытания

<a id="p100546"></a>Исходную концентрированную суспензию клеток разбавляют исследуемой или контрольной средой для получения рабочих суспензий, содержащих 0,6 млн. жизнеспособных клеток в 1 см3 суспензий в соответствии с таблицей 4. Для этого во флаконы с исследуемой и контрольной средами предварительно вносят референс-сыворотку объемом 2% объема среды.

<div align="center">

<a id="p100547"></a>Таблица 4

<a id="p100548"></a>Приготовление рабочих суспензий клеток<br>
из концентрированной суспензии

</div>



| <a id="p100549"></a>Количество жизнеспособных клеток в 1 см3 исходной суспензии, млн./см3 | <a id="p100550"></a>Объем исходной суспензии клеток, необходимый для получения 20 см3 рабочей суспензии, см3 |
| --- | --- |
| <a id="p100551"></a>9,0 | <a id="p100552"></a>1,33 |
| <a id="p100553"></a>10,0 | <a id="p100554"></a>1,20 |
| <a id="p100555"></a>11,0 | <a id="p100556"></a>1,09 |
| <a id="p100557"></a>12,0 | <a id="p100558"></a>1,00 |


<a id="p100559"></a>Затем в два стерильных культуральных сосуда наливают из флаконов указанные в [таблице 4](#p100548) объемы исходной суспензии и доливают до общего объема 20 см3: первый сосуд - исследуемой средой, второй - контрольной средой. Получают две рабочие суспензии.
<a id="p100560"></a>Из каждой рабочей суспензии готовят рабочие образцы с количеством клеток в 1 см3: 0,5; 0,4; 0,3; 0,2 и 0,1 млн./см3, для чего к одному объему рабочих суспензий добавляют следующие объемы тех же сред: 0,2; 0,5; 1; 2 и 5 соответственно.
<a id="p100561"></a>Из рабочих суспензий клеток и каждого рабочего образца высевают по 1 см3 в четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной питательной средой. Выращивают культуры клеток при температуре (37,0 +/- 0,5) °C без смены питательной среды в течение 7 сут. Процент роста монослоя определяют через 7 сут микроскопированием образцов пробирочных культур (увеличение $70^{\times}$ ).

##### <a id="p100562"></a>6.1.4 Оценка результатов

<a id="p100563"></a>Ростовые свойства питательных сред в зависимости от процента роста монослоя оценивают по четырехбалльной системе: монослойные образцы культур - в 4 балла; образцы с 25, 50 и 75% роста - соответственно в 1, 2 и 3 балла.
<a id="p100564"></a>По общей сумме баллов во всех 24 пробирочных культурах питательную среду классифицируют следующим образом: 1-й класс - 65 - 96 баллов; 2-й класс - 33 - 64 балла и 3-й класс - 16 - 32 балла. Испытуемые среды, получившие менее 16 баллов, бракуют как неактивные.
<a id="p100565"></a>Испытуемые среды оценивают в том случае, если контрольная среда ССО-ГЛА или ССО-ФГМС обеспечивает рост тест-культур при посевном количестве клеток в 1 см3 от 0,1 до 0,2 млн./см3 и имеет не менее 65 баллов. В противном случае испытания проводят с другим образцом контрольной среды. Примеры расчета ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток приведены в таблице 5.

<div align="center">

<a id="p100566"></a>Таблица 5

<a id="p100567"></a>Примеры расчета ростовых свойств питательных сред

</div>



<table>
<colgroup><col width="18%"><col width="30%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="20%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100568"></a>Номер питательной среды</td><td rowspan="2"><a id="p100569"></a>Посевное количество жизнеспособных клеток в 1 см3 суспензии, млн./см3</td><td colspan="2"><a id="p100570"></a>Оценка роста, баллы</td><td rowspan="2"><a id="p100571"></a>Класс питательной среды</td></tr>
<tr><td><a id="p100572"></a>в пробирке</td><td><a id="p100573"></a>общая</td></tr>
<tr><td><a id="p100574"></a>1</td><td><a id="p100575"></a>0,6<br>0,5<br>0,4<br>0,3<br>0,2<br>0,1</td><td><a id="p100576"></a>4444<br>4444<br>4444<br>4444<br>4444<br>0000</td><td><a id="p100577"></a>80</td><td><a id="p100578"></a>1</td></tr>
<tr><td><a id="p100579"></a>2</td><td><a id="p100580"></a>0,6<br>0,5<br>0,4<br>0,3<br>0,2<br>0,1</td><td><a id="p100581"></a>4444<br>4444<br>4444<br>3212<br>0000<br>0000</td><td><a id="p100582"></a>56</td><td><a id="p100583"></a>2</td></tr>
<tr><td><a id="p100584"></a>3</td><td><a id="p100585"></a>0,6<br>0,5<br>0,4<br>0,3<br>0,2<br>0,1</td><td><a id="p100586"></a>4444<br>3322<br>1111<br>1100<br>0000<br>0000</td><td><a id="p100587"></a>32</td><td><a id="p100588"></a>3</td></tr>
<tr><td><a id="p100589"></a>Контроль</td><td><a id="p100590"></a>0,6<br>0,5<br>0,4<br>0,3<br>0,2<br>0,1</td><td><a id="p100591"></a>4444<br>4444<br>4444<br>4444<br>4444<br>2222</td><td><a id="p100592"></a>88</td><td><a id="p100593"></a>1</td></tr>
</table>



#### <a id="p100594"></a>6.2 Метод определения токсичности питательных сред для первичных культур клеток

<a id="p100595"></a>Сущность метода состоит в приготовлении концентрированной суспензии первичной культуры клеток фибропластов перепелиных или куриных эмбрионов, посеве приготовленных суспензий на испытуемую и контрольную среды, микроскопическом наблюдении за посевами с целью определения времени образования монослоя, индекса пролиферации, признаков деструкции монослоя и наличия дегенеративных изменений клеток.

##### <a id="p100596"></a>6.2.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100597"></a>Аппаратура, материалы и реактивы - по [6.1.1](#p100495).

##### <a id="p100598"></a>6.2.2 Подготовка к испытанию

<a id="p100599"></a>Подготовка к испытанию - по [6.1.2](#p100525).

##### <a id="p100600"></a>6.2.3 Проведение испытания

<a id="p100601"></a>В четыре пробирки с испытуемой и четыре пробирки с контрольной средой вносят по 1 см3 суспензии клеток с посевным количеством клеток 0,6 млн., приготовленной по [6.1.2.1](#p100526). Затем ежедневно в течение 7 сут проводят микроскопию двух пробирочных культур в каждой среде с целью определения времени образования монослоя; через 7 сут роста монослоя оценивают наличие или отсутствие деструкции монослоя и дегенеративных изменений клеток в сравнении с каталогом [[2]](#p100710).
<a id="p100602"></a>Из двух других пробирок с клеточной культурой в каждой среде через 24 ч после образования монослоя удаляют питательную среду, вносят в пробирки по 1 см3 раствора версена (для снятия клеток) и инкубируют при (37,0 +/- 0,5) °C в течение 15 - 20 мин.
<a id="p100603"></a>Затем трижды подсчитывают общее количество снятых клеток в 1 см3 каждой суспензии по [6.1.2.2](#p100529). За результат испытания каждой суспензии принимают среднее арифметическое результатов шести определений.

##### <a id="p100604"></a>6.2.4 Обработка результатов


###### <a id="p100605"></a>6.2.4.1 Определение индекса пролиферации

<div align="center">

<a id="p100606"></a>Индекс пролиферации $X_{5}$ вычисляют по формуле

</div>


<a id="p100607"></a> $X_{5} = \frac{A}{B}$ , (6)

<a id="p100608"></a>где A - общее количество выросших клеток в 1 см3 снятой суспензии, тыс./см3;
<a id="p100609"></a>B - количество посаженных клеток в 1 см3 посевной суспензии, тыс./см3.

###### <a id="p100610"></a>6.2.4.2 Оценка результатов

<a id="p100611"></a>Среды считают нетоксичными, если они обеспечивают образование монослойной культуры в те же сроки, что и контрольные - не позже 48 ч, без признаков деструкции монослоя и дегенерации клеток в культуре через 7 сут и с индексом пролиферации не менее 0,5. При появлении дегенеративных изменений клеток в культуре и снижении количества выросших клеток более чем на 30% по сравнению с контрольной средой питательную среду выбраковывают как токсичную.

#### <a id="p100612"></a>6.3 Метод определения ростовых свойств питательных сред для клеточных линий

<a id="p100613"></a>Сущность метода заключается в посеве тест-культур клеточных линий на испытуемую и контрольную среды, пересевах после образования монослоя на свежие порции питательных сред и определении времени формирования монослоя, индекса пролиферации, наличия или отсутствия дегенерации тест-культуры и деструкции монослоя.

##### <a id="p100614"></a>6.3.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100615"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [6.1.1](#p100495).
<a id="p100616"></a>Среда питательная 199, среда Игла, среда Игла МЕМ или другие, предварительно тестированные в качестве контрольных.
<a id="p100617"></a>Линии клеточные гетероплоидные: ВНК-21; VERO; СПЭВ, ЛЭК, ТЭБ или другие, адаптированные к испытуемой среде.
<a id="p100618"></a>Линии клеточные диплоидные: 4647; М-22, ЛЭЧ-240 или другие, адаптированные к испытуемой среде.

##### <a id="p100619"></a>6.3.2 Проведение испытания

<a id="p100620"></a>В два культуральных сосуда вносят испытуемую и контрольную среды объемом 1/10 их вместимости, добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота от 2 до 10% объема среды и определенное количество клеток (посевную дозу) тест-линий (10 - 100 тыс./см3 в зависимости от линии клеток), определенное по [6.1.2](#p100525). Клетки культивируют при (37,0 +/- 0,5) °C. Ежесуточно проводят наблюдения за развитием монослоя микроскопией посевов и определяют время образования монослоя и состояние клеток (наличие или отсутствие дегенеративных изменений клеток) в сравнении с [[2]](#p100710).
<a id="p100621"></a>Через 1 - 2 сут после формирования монослоя клетки снимают раствором версена или трипсина и пересевают в новые культуральные сосуды со свежими порциями испытуемой и контрольной сред (второй пассаж). Снова проводят ежесуточные наблюдения под микроскопом за состоянием монослоя и через 1 - 2 сут после формирования нового монослоя клетки снимают и пересевают. Так повторяют еще два раза (всего пять пассажей).
<a id="p100622"></a>Из каждого пассажа отбирают пробу снятых клеток и ресуспендируют в объеме среды, равном 1/10 объема сосуда. Смешивают 1 см3 полученной суспензии с 1 см3 красителя (раствора трипановой сини или кристалл-виолета), смесью заполняют камеру Горяева и подсчитывают в ней количество клеток.

##### <a id="p100623"></a>6.3.3 Обработка результатов

<a id="p100624"></a>6.3.3.1. Для каждого пассажа вычисляют количество снятых клеток в 1 см3 суспензии, умножая подсчитанное количество клеток на коэффициент 1111.
<a id="p100625"></a>6.3.3.2. Для каждого пассажа вычисляют индекс пролиферации по [6.2.4.1](#p100605).

###### <a id="p100626"></a>6.3.3.3 Оценка результатов

<a id="p100627"></a>По ростовым свойствам среду оценивают как нетоксичную, если в каждом пассаже она обеспечивает формирование монослоя клеток через 3 - 4 сут после посева, имеет индекс пролиферации не ниже 2,0 - 4,0 (в зависимости от линии клеток) при условии, что клетки на протяжении всего срока культивирования сохраняют типичные, без дегенеративных изменений, черты линии в соответствии с каталогом [[2]](#p100710). В противном случае и при отсутствии тех же признаков токсичности контрольной среды испытуемая выбраковывается. Если контрольная среда проявляет признаки токсичности, оценивание испытуемой среды повторяют с новой контрольной пробой.

#### <a id="p100628"></a>6.4 Метод определения ростовых свойств белковых гидролизатов для клеточных линий

<a id="p100629"></a>Сущность метода заключается в приготовлении питательных сред с разным содержанием испытуемых гидролизатов в солевом растворе, высеве на полученные питательные среды культуры линии клеток, оценке состояния культуры (образование монослоя, наличие или отсутствие деструкции) на третьи и седьмые сутки инкубирования и определении оптимальной концентрации гидролизата в среде.

##### <a id="p100630"></a>6.4.1 Аппаратура, материалы и реактивы

<a id="p100631"></a>Аппаратура, материалы и реактивы по [6.1.1](#p100495) и [6.3.1](#p100614).
<a id="p100632"></a>Линии клеток ПП, ПК, ПТ или другие, адаптированные к росту на испытуемой среде.
<a id="p100633"></a>Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104, наибольшим пределом взвешивания 1 кг, 3-го класса точности.

##### <a id="p100634"></a>6.4.2 Подготовка к испытанию


###### <a id="p100635"></a>6.4.2.1 Подготовка питательных сред из гидролизата

<a id="p100636"></a>Испытуемый сухой гидролизат растворяют в солевом растворе Хенкса из расчета 0,5 г на 100 см3 раствора. Получают исходный концентрат массовой долей гидролизата 0,500%. Готовят три разведения концентрата, добавляя к одному объему концентрата один, три и семь объемов раствора Хенкса. Массовые доли гидролизата в разведениях составляют 0,250; 0,125 и 0,062% соответственно. Полученные среды (концентрат и его разведения) переносят в стерильные флаконы вместимостью 500 см3 и добавляют референс-сыворотку крови крупного рогатого скота объемом 5% объема среды.
<a id="p100637"></a>Среды во флаконах проверяют на стерильность по [ГОСТ 28085](https://bukva.ai/docs/gost-28085-89). Для дальнейших испытаний используют только стерильные пробы.

###### <a id="p100638"></a>6.4.2.2 Подготовка суспензии клеток

<a id="p100639"></a>Культуру клеток реактивируют пересевом на проверенный образец среды, аналогичный испытуемой, в четырех культуральных сосудах. Культуру клеток снимают раствором версена, подогретым до 35 - 37 °C, объем которого составляет 3 - 5% вместимости сосудов. Сосуды с растворами оставляют при комнатной температуре на 5 - 20 мин до появления в монослое "окон" (начало отделения клеток от стекла). Затем основную массу растворов осторожно сливают, оставляя по 3 - 7 см3, культуральные сосуды (матрасы) переворачивают вниз монослоем и культуру дополнительно выдерживают до полного отделения клеток от стекла. В матрасы вносят питательные среды (исходный концентрат и три разведения) по [6.4.2.1](#p100635) объемами 3 - 5% их вместимости, энергично встряхивают и отбирают пробы для подсчета общего количества клеток в камере Горяева по [6.1.2.2](#p100529).
<a id="p100640"></a>Суспензии разводят соответствующей питательной средой до получения количества клеток в 1 см3 80 - 100 тыс./см3. Объем питательной среды рассчитывают с учетом показателя разведения (отношение количества клеток в исходной и разведенной суспензии).

##### <a id="p100641"></a>6.4.3 Проведение испытания

<a id="p100642"></a>Суспензии клеток, приготовленные по [6.4.2](#p100634), вносят в 20 культуральных сосудов (по 5 на каждое разведение гидролизата), заполняя их на 1/10 вместимости. Сосуды с суспензиями клеток помещают в термостат при (36 +/- 1) °C и просматривают пробы под микроскопом на 3 и 7 сут инкубирования, наблюдая рост монослоя и наличие или отсутствие его деструкции. Одновременно определяют массовую долю гидролизата в среде (оптимальную), при которой монослой образуется через 3 сут и сохраняется в течение 7 сут культивирования.
<a id="p100643"></a>Проводят два последовательных пересева клеток в пять сосудов со средой, имеющей оптимальную массовую долю гидролизата, и наблюдают в них рост монослоя, а также наличие или отсутствие его деструкции на 3 и 7 сут культивирования.

##### <a id="p100644"></a>6.4.4 Обработка результатов


###### <a id="p100645"></a>6.4.4.1 Определение пригодности гидролизата к практическому применению

<a id="p100646"></a>Определяют ростовые свойства питательной среды для каждой массовой доли гидролизата в пяти повторностях. За результат испытания для каждой массовой доли гидролизата принимают данные, которые повторяются не менее трех раз. Результаты регистрируют в соответствии с таблицей 6.

<div align="right">

<a id="p100647"></a>Таблица 6

</div>


<a id="p100648"></a>*Пример* регистрации ростовых свойств гидролизата


<table>
<colgroup><col width="33%"><col width="34%"><col width="34%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100649"></a>Массовая доля гидролизата в испытуемой среде, %</td><td colspan="2"><a id="p100650"></a>Оценка роста клеток в испытуемой среде за время наблюдения</td></tr>
<tr><td><a id="p100651"></a>3 сут</td><td><a id="p100652"></a>7 сут</td></tr>
<tr><td><a id="p100653"></a>0,500</td><td><a id="p100654"></a>Монослой, начало деструкции</td><td><a id="p100655"></a>Частичная или полная деструкция монослоя</td></tr>
<tr><td><a id="p100656"></a>0,250</td><td><a id="p100657"></a>Монослой</td><td><a id="p100658"></a>Монослой или начало деструкции</td></tr>
<tr><td><a id="p100659"></a>0,125</td><td><a id="p100660"></a>Частичный или полный монослой</td><td><a id="p100661"></a>Монослой</td></tr>
<tr><td><a id="p100662"></a>0,062</td><td><a id="p100663"></a>Частичный монослой</td><td><a id="p100664"></a>Частичный или полный монослой</td></tr>
</table>


<div align="right">

<a id="p100665"></a>Гидролизат считают пригодным для практического применения, если в средах массовой доли гидролизата от 0,125 до 0,500% он обеспечивает образование монослоя через 3 сут, а в средах массовой доли от 0,062 до 0,250% монослой сохраняется на 7 сут выращивания.

</div>


###### <a id="p100666"></a>6.4.4.2 Оценка оптимальной массовой доли гидролизата в питательной среде

<a id="p100667"></a>Оценивают результаты посевов культуры клеток на среды оптимальной массовой доли гидролизата в двух дополнительных пересевах.
<a id="p100668"></a>Если в обоих пересевах на 3 сут наблюдают образование монослоя, который сохраняется на 7 сут выращивания, гидролизат рекомендуют использовать в составе питательных сред в оптимальной массовой доле. В противном случае определение оптимальной массовой доли гидролизата повторяют.





<a id="p100669"></a>Приложение А
(справочное)

<a id="p100670"></a>**ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ**

<a id="p100671"></a>А.1. Методы определения ростовых свойств питательных сред для микроорганизмов
<a id="p100672"></a>Ростовые свойства питательной среды для микроорганизмов: свойства питательной среды обеспечивать рост микроорганизмов (интенсивность роста микроорганизмов, чувствительность к данному виду микроорганизмов; эффективность роста микробных культур) и типичность морфологии микробных клеток и культурально-биохимических свойств микроорганизмов.
<a id="p100673"></a>А.1.1. Методы определения ростовых свойств питательной среды по интенсивности роста тест-штаммов микроорганизмов
<a id="p100674"></a>Интенсивность роста тест-штаммов микроорганизмов на питательной среде: характеристика питательной среды, определяемая количеством выросших в ней микробных клеток тех или иных видов микроорганизмов, или оптической плотностью культуры, выросшей в жидкой среде, или смыва культуры с поверхности плотной среды.
<a id="p100675"></a>А.1.2. Метод определения чувствительности питательной среды к разным видам микроорганизмов
<a id="p100676"></a>Чувствительность среды к микроорганизму: характеристика питательной среды, определяемая минимальным количеством посевного материала данного вида микроорганизмов, который вызывает их рост, и выраженная через показатель разведения или минимальное количество внесенных клеток.
<a id="p100677"></a>А.1.3. Метод определения эффективности плотной питательной среды для роста микроорганизмов
<a id="p100678"></a>Эффективность плотной питательной среды: количество выросших на плотной питательной среде колоний микроорганизмов в сравнении с расчетным, выраженное в процентах.
<a id="p100679"></a>А.1.4. Методы определения влияния питательной среды на типичность микроорганизмов
<a id="p100680"></a>Типичность микроорганизма: соответствие совокупности свойств микроорганизма, выросшего на испытуемой среде, установленным свойствам типа, вида и штамма: тип дыхания, морфология, окраска по Граму, формы роста в питательных средах и биохимические свойства.
<a id="p100681"></a>А.2. Методы определения пригодности питательных сред для токсинообразования микроорганизмов по силе образуемого токсина
<a id="p100682"></a>Пригодность питательной среды для токсинообразования микроорганизмов: способность среды обеспечивать образование токсина при культивировании микроорганизма, характеризующаяся силой токсина.
<a id="p100683"></a>А.2.1. Метод определения силы токсина на белых мышах
<a id="p100684"></a>Сила токсина: показатель разведения токсина, 1 см3 которого приводит к 100%-ной гибели белых мышей, выраженный в единицах DLM на 1 см3 фильтрата культуры, содержащего токсин.
<a id="p100685"></a>А.2.2. Метод определения силы токсина по индексу ингибирования микробной тест-культуры
<a id="p100686"></a>Сила токсина (индекс ингибирования): отношение объемных долей токсина в неразведенном фильтрате культуры токсинообразующего микроорганизма и в разведении фильтрата, вызывающем 50%-ную степень ингибирования роста (E.coli). Выражается количеством единиц ингибирования $(IU_{50})$ .
<a id="p100687"></a>Степень ингибирования: отношение оптической плотности культуры E.coli, выросшей в среде с токсином, к оптической плотности культуры E.coli, выросшей в контрольной среде.
<a id="p100688"></a>Единица ингибирования $(IU_{50})$ : объемная доля токсина в среде культивирования, соответствующая 50%-ной степени ингибирования роста E.coli.
<a id="p100689"></a>А.3. Методы определения ростовых свойств питательных сред для культур клеток
<a id="p100690"></a>Ростовые свойства питательных сред для культур клеток: способность питательных сред обеспечивать, стимулировать, поддерживать или тормозить рост культур клеток - первичных и перевиваемых (соответственно, ростобеспечивающие, ростстимулирующие, ростподдерживающие или токсические свойства). Характеризуются временем образования и процентом роста монослоя, индексом пролиферации, появлением дегенеративных изменений клеток и деструкцией монослоя.
<a id="p100691"></a>Культура клеток (первичная и перевиваемая): клетки, растущие in vitro без образования ткани.
<a id="p100692"></a>Первичная культура клеток: культура из клеток тканей или органов, взятых непосредственно из организма.
<a id="p100693"></a>Перевиваемая культура клеток (линия клеток или клеточная линия): культура клеток, поддерживаемая путем многократных пересевов клеток ткани.
<a id="p100694"></a>А.3.1. Метод определения ростовых свойств питательных сред для первичных культур клеток
<a id="p100695"></a>Монослой: клетки, растущие на поверхности в один слой.
<a id="p100696"></a>Процент роста монослоя: визуальная оценка полноты заполнения поля зрения при микроскопии культуры клеток, выраженная в процентах.
<a id="p100697"></a>А.3.2. Метод определения токсичности питательных сред для первичных культур клеток
<a id="p100698"></a>Токсичность питательной среды для первичных культур клеток: характеристика питательной среды, выражаемая торможением роста первичной культуры клеток, дегенеративными изменениями клеток и деструкцией монослоя и определяемая временем образования монослоя, индексом пролиферации, признаками деструктивных изменений монослоя и дегенерации клеток.
<a id="p100699"></a>Пролиферация: разрастание ткани путем новообразования (размножения) клеток.
<a id="p100700"></a>Пролиферация культуры клеток: размножение клеток in vitro.
<a id="p100701"></a>Индекс пролиферации: отношение количества выросших клеток к количеству посаженных.
<a id="p100702"></a>Деструкция монослоя: нарушения монослоя, "окна" в монослое, связанные с гибелью клеток или отсутствием их размножения (пролиферации).
<a id="p100703"></a>Дегенеративные изменения клеток: внутриклеточные патологические изменения, появление включений (симпластов, вакуолей и др.), зернистости.
<a id="p100704"></a>А.3.3. Метод определения ростовых свойств питательных сред для клеточных линий
<a id="p100705"></a>Линия диплоидных клеток: линия клеток, в которой не менее 75% клеток имеют диплоидный набор хромосом (кариотип клеток исходного вида).
<a id="p100706"></a>Линия гетероплоидных клеток: линия клеток, в которой менее 75% клеток имеют диплоидный набор хромосом.





<div align="right">

<a id="p100707"></a>Приложение Б

</div>


<div align="center">

<a id="p100708"></a>**БИБЛИОГРАФИЯ**

</div>



1. <a id="p100709"></a>[СанПиН 2.1.4.559-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-26-goskomsanepidnadzor-rossii). Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству
   воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества
2. <a id="p100710"></a>Каталог Российской коллекции клеточных культур. РККК. Санкт-Петербург -
   Омск, 1999.
   <a id="p100711"></a>------------------------------------------------------------------