ГОСТ Р 51440-99 (ИСО 8128-2-93). Государственный стандарт Российской Федерации. Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью тонкослойной хроматографии
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22.12.1999 № 595-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень национальных стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения Федерального закона «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» и осуществления оценки соответствия (Распоряжение Правительства РФ от 19.05.2009 № 690-р).
от 22 декабря 1999 г. № 595-ст
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
СОК ЯБЛОЧНЫЙ, СОК ЯБЛОЧНЫЙ КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ И НАПИТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЯБЛОЧНЫЙ СОК
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПАТУЛИНА С ПОМОЩЬЮ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice. Method for determination of patulin content using thin-layer chromatography
1 января 2001 года
Предисловие
1. Разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП).
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 595-ст.
3 Стандарт содержит аутентичный текст международного стандарта ИСО 8128-2:1993 «Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Определение содержания патулина. Часть 2. Метод тонкослойной хроматографии», кроме Приложения «Библиография».
1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания патулина в яблочных соках, концентрированных яблочных соках и напитках, содержащих яблочный сок, с помощью тонкослойной хроматографии.
Предел обнаружения патулина настоящим методом составляет 25 мкг/дм3 при условии, что взятый для анализа объем пробы готового к употреблению сока составляет 50 см3.
2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Патулин экстрагируют из исследуемой пробы смесью этилацетата с хлороформом (3:2 по объему). Экстракт очищают на колонке с силикагелем. Количественный и качественный анализ экстракта проводят с помощью двумерной тонкослойной хроматографии (ТСХ) при проявлении пятен раствором гидрохлорида гидразона 3-метил-2-бензотиазолина (МБТГ).
3. РЕАКТИВЫ
Используют реактивы аналитической чистоты и воду квалификации «для хроматографии».
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. При работе с бензолом и хлороформом следует соблюдать особую осторожность, поскольку эти растворители токсичны и взрывоопасны.
3.1 Растворители: этилацетат, хлороформ и толуол.
3.2 Подвижные фазы для двумерной ТСХ:
бензол/метанол/уксусная кислота (массовой долей 80%) (19:2:1 по объему);
толуол/этилацетат/муравьиная кислота (массовой долей 90%) (5:4:1 по объему).
3.3. Силикагель для колоночной хроматографии с размером частиц от 0,063 до 0,2 мм.
3.4. Элюирующий раствор: смесь толуола с этилацетатом (75:25 по объему).
3.5 Стандартный раствор патулина (C_{7}H_{6}O_{4})
3.5.1 Приготовление стандартного раствора патулина
Навеску патулина массой 10,0 мг, взятую с точностью до 0,1 мг, растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 100 см3 в этилацетате (3.1). Объем содержимого в колбе доводят до отметки этилацетатом.
Пипеткой переносят 10,0 см3 приготовленного раствора в другую мерную колбу с одной отметкой вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят до отметки этилацетатом. Массовая концентрация патулина в приготовленном стандартном растворе составляет около 10 мкг/см3.
Измеряют оптическую плотность стандартного раствора при длине волны 276 нм на подходящем спектрофотометре с использованием кварцевых кювет рабочей длиной 10 мм.
3.5.2 Расчет концентрации стандартного раствора патулина
Концентрацию стандартного раствора патулина (3.5.1) \rho_{ps},\text{мгк}/\text{см}^{3} , рассчитывают по формуле
\rho_{ps} = \frac{AM1000C}{A_{276}} ,(1)
где A — оптическая плотность стандартного раствора патулина;
A_{276} — молярный показатель поглощения раствора патулина при длине волны 276 нм, \text{дм}^{3} \cdot \text{моль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1} (A_{276} = 14600) ;
M — молярная масса патулина, г/моль;
C — постоянная прибора (обычно C = 1).
3.6 Приготовление раствора гидрохлорида МБТГ
Навеску моногидрата гидрохлорида гидразона 3-метил-2-бензотиазолина (МБТГ) массой 0,5 г растворяют в 100 см3 воды.
Приготовленный раствор хранят в холодильнике. Срок годности раствора — 3 сут.
4. ПРИБОРЫ И ЛАБОРАТОРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
Перед использованием лабораторное оборудование промывают раствором гипохлорита натрия концентрации 10 г/см3.
Обычное лабораторное оборудование, в частности, следующее:
4.1. Хроматографическая колонка длиной 300 мм, внутренним диаметром 22 мм, с резервуаром вместимостью 250 см3 и запорным краном, снабженная с выходного конца пористым стеклянным диском.
4.2. Оборудование для ТСХ: стеклянные хроматографические камеры, длинноволновая ультрафиолетовая лампа (360 нм) и устройство для опрыскивания.
4.3 Флюороденситометр.
4.4. Пластинки для ТСХ размером 20 x 20 см, покрытые силикагелем (3.3) толщиной слоя 0,25 мм, без флюоресцентного индикатора.
4.5. Сушильный шкаф с принудительной вентиляцией, пригодный для работы при (130 +/- 1) °C.
5. ОТБОР ПРОБ
Проба, поступающая в лабораторию, должна быть представительной и без следов порчи или изменения свойств продукта при транспортировании и хранении.
6. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ
6.1 Приготовление испытуемого раствора
При испытании концентрированных яблочных соков их разводят водой 1:5 по объему. Дальнейшую процедуру проводят для всех продуктов одинаково, как описано ниже.
Пробу объемом 50 см3 экстрагируют порцией смеси этилацетата с хлороформом (3:2 по объему) объемом 50 см3 в течение не менее 1 мин. Экстракцию повторяют еще два раза той же смесью новыми порциями объемом по 50 см3. Экстракты объединяют и фильтруют на воронке с пористым стеклянным фильтром через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см, фильтрат собирают в отгонную колбу вместимостью 250 см3.
Экстракт упаривают на ротационном испарителе под вакуумом досуха, остаток количественно переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 см3, ополаскивая колбу четырьмя порциями этилацетата объемом по 5 см3. Объем содержимого в цилиндре доводят сначала до 25 см3 этилацетатом, затем до 100 см3 толуолом.
6.2 Колоночная хроматография
В основание колонки (4.1) помещают ватный тампон. В колонку вносят 25 см3 толуола и суспензию 15 г силикагеля (3.3) в 40 см3 толуола. После оседания силикагеля в колонку вносят 15 г безводного сульфата натрия и дают растворителю стечь до верхней кромки насыпного слоя. В колонку вносят экстракт из исследуемой пробы, после чего растворителю дают стечь до верхней кромки насыпного слоя, элюат отбрасывают. В колонку вносят 200 см3 элюирующего раствора (3.4) и проводят элюирование при скорости потока около 5 см3/мин, элюат собирают в градуированный цилиндр. Собранный элюат упаривают приблизительно до объема 2 см3.
Сконцентрированный элюат количественно переносят в пробирку вместимостью 20 см3 с помощью четырех порций этилацетата объемом около 4 см3 каждая и упаривают досуха в токе азота. Остаток немедленно растворяют в 0,5 см3 этилацетата, так как патулин нестабилен.
6.3 Тонкослойная хроматография
Пластинки для ТСХ, предварительно покрытые силикагелем (4.4), активируют при температуре 110 °C в течение 2 ч. С помощью капиллярной пипетки или микрошприца на пластинку в точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от нижнего края, наносят аликвотную часть очищенного экстракта из пробы (6.2) объемом 0,020 см3. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от правого края и 2 см от нижнего края пластинки, наносят 0,005 см3 стандартного раствора патулина (3.5). В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края и 2 см от верхнего края пластинки, наносят также 0,005 см3 стандартного раствора патулина. В точку, находящуюся на расстоянии 2 см от левого края пластинки и 4 см от верхнего края пластинки, наносят 0,010 см3 стандартного раствора патулина (см. рисунок 1).
Рисунок 1. Двумерная тонкослойная хроматография
Хроматограмму развивают в направлении I (рисунок 1), используя подвижную фазу бензол/метанол/уксусная кислота (3.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры, высушивают на воздухе, после чего развивают хроматограмму в направлении II (рисунок 1), используя подвижную фазу толуол/этилацетат/муравьиная кислота (3.2), до прохождения фронтом растворителя расстояния 14 см. Пластинку вынимают из камеры и высушивают при комнатной температуре. Пластинку опрыскивают раствором гидрохлорида МБТГ (3.6), после чего высушивают в течение 15 мин в сушильном шкафу (4.5) при температуре 130 °C.
6.4 Определение количества патулина в экстракте
Количество патулина в экстракте определяют сравнением интенсивности флюоресценции пятна патулина из экстракта с пятнами патулина из стандартного раствора при облучении пластинки длинноволновым ультрафиолетовым светом. Пятно патулина из экстракта ищут на пересечении перпендикулярных линий, соединяющих пятна патулина из стандартного раствора. Если интенсивность флюоресценции пятна патулина из 0,020 см3 экстракта выше интенсивности флюоресценции пятен патулина из стандартного раствора, экстракт разводят этилацетатом и повторяют процедуру ТСХ-анализа по 6.3. Если интенсивность флюоресценции пятна патулина из экстракта сравнима с интенсивностью флюоресценции одного из пятен патулина из стандартного раствора, то концентрация патулина в анализируемой пробе составляет 25 мкг/дм3 либо 50 мкг/дм3 соответственно.
При проведении анализа описанным методом достигается полное отделение патулина от оксиметилфурфурола (ОМФ), поэтому последний не влияет на результаты анализа.
7. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Содержание патулина в продукте \rho_{p},\text{мгк}/\text{см}^{3} , вычисляют по формуле
\rho_{p} = \frac{V_{2}\rho_{ps}V_{0}}{50V_{1}} \cdot 10^{3},(2)
где V_{0} — конечный объем, до которого доведен очищенный экстракт, см3;
V_{2} — объем стандартного раствора патулина (3.5), соответствующий пятну той же интенсивности флюоресценции, что и пятно патулина из экстракта, см3;
\rho_{ps} — концентрация патулина в стандартном растворе, мкг/см3;
8. ТОЧНОСТЬ МЕТОДА
8.1 Сходимость результатов
s_{r} — среднее квадратическое отклонение сходимости.
8.2 Воспроизводимость результатов
R = 41,0 мкг/дм3; s_{r} = 35,8\text{мкг}/\text{дм}^{3} ,
где R — предел воспроизводимости;
s_{r} — среднее квадратическое отклонение воспроизводимости.
9. ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ
В протоколе испытаний указывают:
- метод испытаний;
- результат испытаний;
- окончательный результат с оценкой сходимости, если была проверена сходимость результатов. Также следует отметить особенности проведения испытаний, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные, с побочными обстоятельствами, способными повлиять на результат испытаний.
Протокол испытаний должен содержать информацию, необходимую для полной идентификации образца.