ГОСТ Р 51435-99 (ИСО 8128-1-93). Государственный стандарт Российской Федерации. Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Метод определения содержания патулина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22.12.1999 № 590-ст)

от 22 декабря 1999 г. № 590-ст

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОК ЯБЛОЧНЫЙ, СОК ЯБЛОЧНЫЙ КОНЦЕНТРИРОВАННЫЙ И НАПИТКИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЯБЛОЧНЫЙ СОК

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ПАТУЛИНА С ПОМОЩЬЮ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Apple juice, apple juice concentrates and drinks containing apple juice. Method for determination of patulin content using high performance liquid chromatography

ГОСТ Р 51435-99 (ИСО 8128-1-93)

Предисловие

1. Разработан Всероссийским научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП).

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей».

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 590-ст.

3. Стандарт содержит аутентичный текст международного стандарта ИСО 8128-1-93 «Сок яблочный, сок яблочный концентрированный и напитки, содержащие яблочный сок. Определение содержания патулина. Часть 1. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии», кроме приложения «Библиография».

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания патулина в яблочном соке, концентрированных яблочных соках и напитках, содержащих яблочный сок, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Предел обнаружения патулина настоящим методом составляет 10 мкг/дм3 при условии, что взятый для анализа объем пробы готового к употреблению сока составляет 5 см3.

2. Сущность метода

Метод основан на экстракции патулина из исследуемой пробы этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в водный раствор карбоната натрия и количественном и качественном анализе экстракта с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием спектрофотометрического детектора в ультрафиолетовой области.

3. Реактивы

Используют реактивы аналитической чистоты и воду квалификации «для ВЭЖХ».

3.1 Растворитель: этилацетат.

3.2. Подвижная фаза — раствор ацетонитрила в воде объемной концентрации 10%.

3.3. Экстрагирующий раствор — водный раствор безводного карбоната натрия концентрации 14 г/дм3.

3.4 Ацетатный буфер, pH 4.

Смешивают 16,4 см3 уксусной кислоты [c(CH_{3}COOH) = 0,2\text{моль}/\text{дм}^{3}] с 3,6 см3 раствора ацетата натрия [c(CH_{3}COONa) = 0,2\text{моль}/\text{дм}^{3}] .

3.5 Уксусная кислота, ледяная.

3.6 Стандартный раствор патулина (C_{7}H_{6}O_{4}) .

3.6.1 Приготовление стандартного раствора

Навеску патулина массой 10,0 мг, взятую с точностью до 0,1 мг, растворяют в мерной колбе с одной отметкой вместимостью 100 см3 в ацетатном буфере (3.4). Объем содержимого в колбе доводят до метки ацетатным буфером.

Пипеткой переносят 10,0 см3 приготовленного раствора в другую мерную колбу с одной отметкой вместимостью 100 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки ацетатным буфером. Массовая концентрация патулина в приготовленном стандартном растворе составляет около 10 мкг/см3.

Измеряют оптическую плотность стандартного раствора при длине волны 276 нм на подходящем спектрофотометре с использованием кварцевых кювет рабочей длиной 10 мм.

3.6.2 Расчет концентрации стандартного раствора патулина

Концентрацию стандартного раствора патулина (3.6.1) \rho_{ps} , мкг/см3, вычисляют по формуле

\rho_{ps} = \frac{AM1000C}{A_{276}} , (1)

где A — оптическая плотность стандартного раствора патулина;

A_{276} — молярный показатель поглощения раствора патулина при длине волны 276 нм, \text{дм}^{3} \cdot \text{моль}^{- 1} \cdot \text{см}^{- 1} (A_{276} = 14600) ;

C — постоянная прибора (обычно C = 1).

4. Приборы и лабораторное оборудование

Перед использованием лабораторное оборудование промывают раствором гипохлорита натрия концентрации 10 г/дм3.

Обычное лабораторное оборудование, в частности следующее:

4.1. Жидкостный хроматограф, снабженный спектрофотометрическим детектором в ультрафиолетовой области (пригодным для работы при длине волны 276 нм) и самописцем или интегратором.

4.2 Обращенно-фазовая колонка ODS <1> или другая аналогичная колонка со следующими параметрами:

• эффективность не менее 35000 теоретических тарелок на метр;
• длина 250 мм;
• внутренний диаметр 4,6 мм;
• неподвижная фаза размером частиц 5 мкм.

---

<1> ODS — октадецилсилан.

5. Отбор проб

Проба, поступающая в лабораторию, должна быть представительной и без следов порчи или изменения свойств продукта при транспортировании и хранении.

6. Проведение испытаний

6.1 Приготовление испытуемого раствора

При испытаниях концентрированных яблочных соков их разводят водой 1:5 по объему. Дальнейшую процедуру проводят для всех продуктов одинаково, как описано ниже.

6.1.1. Пробу объемом 5,0 см3 экстрагируют порцией этилацетата объемом 5,0 см3 (3.1) в течение не менее 1 мин. Экстракцию повторяют еще два раза новыми порциями этилацетата объемом по 5,0 см3. Этилацетатные фазы объединяют и экстрагируют раствором карбоната натрия (3.3) объемом 2,0 см3.

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Экстракцию раствором карбоната натрия проводят как можно быстрее, например, в течение 1 — 2 мин, из-за нестабильности патулина в щелочной среде.

6.1.2. Карбонатную фазу (6.1.1) экстрагируют свежей порцией этилацетата объемом 5,0 см3, экстракт объединяют с предыдущими порциями. Карбонатную фазу отбрасывают. К экстракту добавляют 5 капель уксусной кислоты (3.5), смесь перемешивают и упаривают на ротационном испарителе до объема 1 — 2 см3.

6.1.3. Полученный таким образом раствор количественно переносят во флакон вместимостью около 5 см3 с помощью нескольких порций этилацетата объемом около 1 см3 каждая. Раствор упаривают досуха в токе азота при температуре 40 °C. Остаток растворяют в 0,5 см3 подвижной фазы (3.2) или ацетатного буфера (3.4).

6.2 Построение градуировочного графика

Порции стандартного раствора патулина (3.6.1) объемом 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 и 7,5 см3 переносят пипеткой в пять мерных колб с одной отметкой вместимостью 10 см3, объем содержимого в колбах доводят до метки ацетатным буфером (3.4); получают градуировочные растворы.

Устанавливают скорость потока подвижной фазы через колонку жидкостного хроматографа около 1 см3/мин. Чувствительность детектора хроматографа устанавливают таким образом, чтобы оптической плотности 0,01 соответствовал сигнал величиной на полную шкалу регистрирующего устройства.

В хроматограф (4.1) вводят от 0,010 до 0,030 см3 каждого градуировочного раствора.

Градуировочный график строят, откладывая по оси абсцисс концентрацию патулина в микрограммах на кубический сантиметр, по оси ординат — соответствующие величины высоты или площади пиков.

6.3 Проведение определения

В хроматограф вводят от 0,010 см3 до 0,030 см3 испытуемого раствора (6.1.3) при тех же условиях, что и при построении градуировочного графика.

Идентификацию пика патулина в испытуемом растворе проводят сравнением с пиками патулина в градуировочных растворах. Следует отличать пик патулина от пика оксиметилфурфурола (ОМФ).

7. Обработка результатов

Концентрацию патулина в испытуемом растворе определяют непосредственно по градуировочному графику (6.2). Содержание патулина в продукте \rho_{p} , мкг/дм3, вычисляют по формуле

где \rho_{pt} — концентрация патулина в испытуемом растворе, определенная по градуировочному графику, мкг/см3.

V_{1} — объем, до которого сконцентрирован этилацетатный экстракт, см3;

8. Точность метода

8.1 Сходимость результатов

где r — предел сходимости;

s_{r} — среднеквадратическое отклонение сходимости.

8.2 Воспроизводимость результатов

R = 47,5 мкг/дм3; S_{R} = 22,6\text{мкг}/\text{дм}^{3} ,

где R — предел воспроизводимости;

S_{R} — среднеквадратическое отклонение воспроизводимости.

9. Протокол испытаний

В протоколе испытаний указывают:

---