ГОСТ Р 51423-99 (ИСО 6655-97). Государственный стандарт Российской Федерации. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Метод определения массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте
(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22.12.1999 № 578-ст)
от 22 декабря 1999 г. № 578-ст
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ РАСТВОРИМОГО АЗОТА ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ПЕПСИНОМ В РАЗВЕДЕННОЙ СОЛЯНОЙ КИСЛОТЕ
Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. Method for determination of soluble nitrogen fraction of total mass after treatment with pepsin in dilute hydrochloric acid
1 января 2001 года
Предисловие
1. Разработан Творческим коллективом с участием представителей Технического комитета по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы».
Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы».
2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. № 578-ст.
3. Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 6655-97 «Корма для животных. Определение содержания растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте», за исключением 2, 6.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма и комбикормовое сырье и устанавливает метод определения массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте.
Настоящим методом определяется суммарная массовая доля белкового и небелкового азота.
1. Значения, получаемые настоящим методом, не связаны напрямую с показателем перевариваемости in vivo.
2. Если массовую долю небелкового азота нужно исключить из результата испытания, ее следует определить соответствующим методом.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте используют ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 13496.0-80 <*>. Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
<*> Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе ИСО 6497 [1].
ГОСТ Р 51417-99 (ИСО 5983-97). Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Определение массовой доли азота и расчет массовой доли сырого протеина. Метод Кьельдаля
ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98). Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб.
3. Сущность метода
Инкубация пробы в растворе пепсина в разведенной соляной кислоте при 40 °C в течение 48 ч. Фильтрование суспензии и определение массовой доли азота в фильтрате или в осадке на фильтре методом Кьельдаля по ИСО 5983. В последнем случае дополнительно проводят определение массовой доли азота в пробе в соответствии с ИСО 5983.
4. Реактивы
Используют реактивы квалификации х.ч. или ч.д.а., во всех реактивах (за исключением стандартных материалов) должны отсутствовать азотсодержащие компоненты.
4.1 Дистиллированная или деминерализованная вода.
4.2. Разведенная соляная кислота молярной концентрации c (HCl) = 0,075 моль/дм3.
4.3. Пепсин активностью 2,0 единиц/мг в соответствии с определением, данным в Приложении А.
4.4. Раствор пепсина в соляной кислоте активностью пепсина около 400 единиц/дм3.
Растворяют (0,2 +/- 0,001) г пепсина в 1 дм3 разведенной соляной кислоты. Раствор готовят непосредственно перед использованием.
Если активность пепсина отклоняется от 2,0 единиц/мг, регулируют массу пепсина таким образом, чтобы получить раствор активностью пепсина 400 единиц/дм3.
4.5. Соляная кислота молярной концентрации c (HCl) = 7,5 моль/дм3 (\rho_{20} = 1,125\text{г}/\text{см}^{3}) .
5. Оборудование и материалы
Используют обычное лабораторное оборудование.
5.1. Водяная баня или инкубатор для поддержания температуры (40 +/- 1) °C.
5.2 Колбы Кьельдаля соответствующей вместимости.
5.3 Фильтровальная бумага, быстро фильтрующая, кислотостойкая.
5.4 Оборудование для перегонки и фильтрации.
6. Отбор проб
6.1 Отбор проб — по ГОСТ 13496.0.
Проба, получаемая лабораторией, должна быть действительно представительной и защищена от изменений своих качеств при транспортировании и хранении.
7. Подготовка испытуемых проб
7.1 Подготовка испытуемых проб — по ГОСТ Р 51419.
Если массовая доля жира в пробе превышает 10%, жир экстрагируют в соответствии с ГОСТ Р 51419 и учитывают это при расчете (раздел 9).
8. Проведение испытания
8.1 Взятие навески
Берут навеску подготовленной пробы массой около 2 г с точностью до 0,001 г.
8.2 Инкубация
Навеску пробы помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, добавляют 450 см3 раствора пепсина, предварительно подогретого до 40 °C. Содержимое колбы перемешивают для предотвращения агломерации. Проверяют pH суспензии, которая должна быть ниже 1,7. Колбу помещают на водяную баню или в инкубатор, установленный на 40 °C, и выдерживают ее там в течение 48 ч. Содержимое колбы перемешивают через 8, 24 и 32 ч.
По истечении 48 ч в колбу вносят 15 см3 соляной кислоты, c (HCl) = 7,5 моль/дм3, и охлаждают содержимое до 20 °C. Объем в колбе доводят водой до метки, содержимое перемешивают и фильтруют через фильтровальную бумагу. Дальнейшее испытание проводят по 8.3 или 8.4.
8.3 Определение массовой доли азота в фильтрате
8.3.1 Минерализация
Отбирают 250 см3 фильтрата и переносят его в колбу Кьельдаля. В колбу добавляют реактивы, необходимые для минерализации, как указано в ГОСТ Р 51417, 8.2.1. Содержимое колбы доводят до кипения.
Примечание. Рекомендуется внести в колбу реактив, предотвращающий пенообразование.
Содержимое колбы выпаривают при интенсивном кипении почти до полного испарения воды. Остаток воды удаляют с осторожностью, снижая интенсивность нагрева. После того, как жидкость в колбе станет прозрачной, нагревание продолжают еще в течение 1 ч, затем колбу охлаждают.
8.3.2 Отгонка и титрование
Отгонку аммиака и титрование проводят по ГОСТ Р 51417, 8.2.2 и 8.2.3.
8.3.3 Контрольный опыт
Контрольный опыт проводят, выполняя те же операции с использованием тех же реактивов, за исключением навески пробы. Обработку результатов проводят в соответствии с разделом 9.
8.4 Определение массовой доли азота в осадке после фильтрации
8.4.1 Минерализация осадка после фильтрации
Фильтр и осадок на нем промывают теплой водой до полного удаления кислоты. Фильтр с осадком переносят в колбу Кьельдаля и дальнейшее испытание проводят по 8.3.1 настоящего стандарта.
8.4.2. Отгонка и титрование — по ГОСТ Р 51417, 8.2.2 и 8.2.3.
8.4.3 Определение массовой доли азота в пробе
Массовую долю азота в подготовленной пробе определяют в соответствии с ГОСТ Р 51417.
8.4.4 Контрольный опыт
Контрольный опыт проводят, выполняя те же операции с использованием тех же реактивов, за исключением навески пробы.
9. Обработка результатов
9.1 Расчет массовой доли растворимого азота при выполнении испытания по 8.3
При условии, что для улавливания аммиака из пробы и в контрольном опыте использовались равные количества серной кислоты ГОСТ Р 51417, массовую долю растворимого азота в пробе W_{1} , г/кг, рассчитывают по формуле
где V_{0} — объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование в контрольном опыте ГОСТ Р 51417, 4.9.1, см3;
V_{1} — объем раствора гидроксида натрия, пошедший на титрование в опыте с пробой по 8.3.2 ГОСТ Р 51417, 4.9.1, см3;
c — молярная концентрация раствора гидроксида натрия, использованного на титрование, ГОСТ Р 51417, 4.9.1, моль/дм3;
M — молярная масса азота, г/моль (M = 14 г/моль);
Результат испытания округляют с точностью до 0,1 г/кг.
9.2 Расчет массовой доли растворимого азота при выполнении испытания по 8.4
При условии, что для улавливания аммиака из пробы и в контрольном опыте использовались равные количества серной кислоты по ГОСТ Р 51417, массовую долю растворимого азота в пробе W_{2} , г/кг, рассчитывают по формуле
где W_{N} — массовая доля азота в пробе, определенная по 8.4.3, г/кг.
Результат испытания округляют с точностью до 0,1 г/кг.
9.3 Расчет массовой доли растворимого сырого протеина
Массовую долю растворимого сырого протеина рассчитывают умножением массовой доли растворимого азота на 6,25.
10. Точность метода
10.1 Межлабораторное испытание
Результаты межлабораторного испытания точности метода приведены в Приложении Б. Полученные точностные характеристики применимы только для исследованных объектов в исследованном диапазоне концентраций анализируемого вещества.
10.2 Сходимость
Абсолютная разница между двумя независимыми единичными результатами испытаний, полученными настоящим методом на одной и той же пробе, в одной лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования в течение короткого промежутка времени, превышает значения показателя r, приведенные в таблице 1, не более чем в 5% случаев.
Пределы сходимости r и воспроизводимости R
10.3 Воспроизводимость
Абсолютная разница между двумя единичными результатами испытаний, полученными настоящим методом на одной и той же пробе, в различных лабораториях, различными операторами, с использованием различного оборудования, превышает значения показателя R, приведенные в таблице 1, не более чем в 5% случаев.
11. Оформление результатов испытания
Отчет о результатах испытания должен содержать:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации образца;
- метод, в соответствии с которым произведен отбор проб (если известен);
- метод испытания;
- полученный результат испытания, представленный в виде содержания растворимого азота или растворимого сырого протеина (в последнем случае указывают коэффициент пересчета 6,25);
- если проверена сходимость, окончательный результат с оценкой сходимости;
- все подробности проведения испытания, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как несущественные вместе со всеми побочными обстоятельствами, которые могли влиять на результаты испытания.
(обязательное)
Настоящее приложение устанавливает метод определения активности пепсина, используемый при определении массовой доли растворимого азота после обработки пепсином в разведенной соляной кислоте.
В настоящем приложении использован следующий термин с соответствующим определением:
Единица активности пепсина: масса пепсина, необходимая для высвобождения за одну минуту при определенных условиях того количества оксиарильных групп, которое при взаимодействии с реактивом Фолина-Сиокалто дает оптическую плотность, эквивалентную 1 мкмоль тирозина в тех же условиях.
Обработка гемоглобина пепсином в разведенной соляной кислоте. Осаждение негидролизованной части белка трихлоруксусной кислотой. Фильтрация и добавление гидроокиси натрия и реактива Фолина-Сиокалто. Измерение оптической плотности этого раствора при длине волны 750 нм и определение соответствующей массы тирозина с помощью градуировочного графика.
Используют реактивы квалификации х.ч. или ч.д.а., дистиллированную или деминерализованную воду:
соляную кислоту молярной концентрации c (HCl) = 0,2 моль/дм3;
соляную кислоту молярной концентрации c (HCl) = 0,06 моль/дм3;
соляную кислоту молярной концентрации c (HCl) = 0,025 моль/дм3;
раствор трихлоруксусной кислоты массовой концентрации c(CCl_{3}CO_{2}H) = 50\text{г}/\text{дм}^{3} ;
раствор гидроокиси натрия молярной концентрации c (NaOH) = 0,5 моль/дм3;
В круглодонную колбу со шлифом вместимостью 2 дм3 помещают 100 г дигидрата вольфрамата натрия (Na_{2}WO_{4} \cdot 2H_{2}O) , 25 г дигидрата молибдата натрия (Na_{2}MoO_{4} \cdot 2H_{2}O) и 700 см3 воды. В колбу добавляют 50 см3 фосфорной кислоты, \rho(H_{3}PO_{4}) = 1,71\text{г}/\text{см}^{3} , и 100 см3 концентрированной соляной кислоты, \rho(HCL) = 1,19\text{г}/\text{см}^{3} . К колбе присоединяют обратный холодильник, раствор доводят до кипения и аккуратно кипятят в течение 10 ч. Затем колбу охлаждают, отсоединяют обратный холодильник, добавляют 175 г дигидрата сульфата лития (Li_{2}SO_{4} \cdot 2H_{2}O) , 50 см3 воды и 1 см3 брома. Содержимое колбы кипятят в течение 15 мин для удаления избытка брома.
Колбу охлаждают, раствор декантируют в мерную колбу вместимостью 1 дм3. Объем содержимого в колбе доводят до метки дистиллированной водой, раствор перемешивают и фильтруют. Остаточная зеленоватая окраска раствора не допускается.
Перед использованием один объем реактива разводят двумя объемами воды;
Берут навеску гемоглобино-протеинового субстрата около 2 г по методу Ансона, соответствующую 354 мг азота, и помещают ее в колбу со шлифом вместимостью 200 см3 и отметкой на уровне 100 см3.
Примечание. При необходимости определяют массовую долю азота в субстрате с помощью микрометода Кьельдаля. Ожидаемая массовая доля азота составляет 17,7%.
В колбу с субстратом вносят небольшое количество разведенной соляной кислоты, c (HCl) = 0,06 моль/дм3, подсоединяют колбу к вакуумному насосу и перемешивают содержимое до полного растворения гемоглобина. После этого спускают вакуум и, при постоянном перемешивании, добавляют в колбу разведенную соляную кислоту той же молярной концентрации до отметки на уровне 100 см3.
Раствор готовят непосредственно перед использованием;
стандартный раствор тирозина молярной концентрации c(C_{9}H_{11}NO_{3}) = 0,2\text{ммоль}/\text{дм}^{3} .
Для приготовления основного раствора в мерной колбе вместимостью 1 дм3 растворяют 181,2 мг тирозина в разведенной соляной кислоте, c (HCl) = 0,06 моль/дм3, доводят его объем содержимого в колбе до метки.
20 см3 основного раствора переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем содержимого в колбе до метки разведенной соляной кислотой, c (HCl) = 0,06 моль/дм3.
Молярная концентрация тирозина в приготовленном стандартном растворе составляет 0,2 мкмоль/см3 (0,2 ммоль/дм3).
Используют обычное лабораторное оборудование:
водяную баню для поддержания температуры (25 +/- 1) °C;
спектрофотометр для проведения измерений при длине волны 750 нм;
хронометр для измерения времени с точностью до 1 с;
pH-метр для измерения pH с точностью до 0,1 единицы;
стеклянную палочку, один конец которой толще другого.
А.6.1. Приготовление раствора пепсина
Навеску пепсина массой 150 мг (или массу, необходимую для получения оптической плотности 0,35 +/- 0,035) растворяют в 100 см3 разведенной соляной кислоты, c (HCl) = 0,06 моль/дм3.
2 см3 приготовленного раствора переносят пипеткой в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят объем содержимого в колбе разведенной соляной кислотой, c (HCl) = 0,025 моль/дм3, до метки. Значение pH приготовленного раствора должно быть 1,6 +/- 0,1.
Колбу с раствором погружают в водяную баню температурой 25 °C.
В пробирку с помощью пипетки переносят 5,0 см3 раствора гемоглобина и нагревают на водяной бане до 25 °C. В пробирку вносят 1,0 см3 раствора пепсина; содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой, совершая около 10 возвратно-поступательных движений. Пробирку выдерживают на водяной бане при (25 +/- 1) °C в течение 10 мин +/- 1 с, отсчитывая время с момента внесения раствора пепсина. Необходимо точно соблюдать продолжительность и температуру инкубации. По окончании инкубации в пробирку добавляют 10,0 см3 раствора трихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25 +/- 1) °C, содержимое пробирки перемешивают и фильтруют через сухую фильтровальную бумагу.
А.6.3. Проведение цветной реакции и измерение оптической плотности
5,0 см3 фильтрата переносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 50 см3. В колбу добавляют 10,0 см3 раствора гидроокиси натрия и, при постоянном перемешивании, 3,0 см3 разбавленного реактива Фолина-Сиокалто. Через 5 — 10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 750 нм в кювете рабочей длиной 1 см. В качестве раствора сравнения используют воду.
Контрольное испытание проводят при каждом определении.
5,0 см3 раствора гемоглобина переносят пипеткой в пробирку, подогревают на водяной бане до (25 +/- 1) °C, добавляют 10,0 см3 раствора трихлоруксусной кислоты, предварительно подогретого до (25 +/- 1) °C. Содержимое пробирки перемешивают и вносят 1,0 см3 раствора пепсина. Раствор в пробирке перемешивают стеклянной палочкой. Пробирку выдерживают на водяной бане при температуре (25 +/- 1) °C в течение 10 мин +/- 1 с, после чего раствор фильтруют через сухую фильтровальную бумагу. Дальнейшее испытание выполняют по А.6.3.
А.6.5. Построение градуировочного графика
В шесть конических колб вместимостью 50 см3 помещают 0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 см3 стандартного раствора тирозина, что соответствует 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 и 1,0 мкмоль тирозина. В колбы добавляют разведенную соляную кислоту, c (HCl) = 0,2 моль/дм3, в таком количестве, чтобы объем содержимого в каждой колбе составил 5,0 см3.
В каждую колбу вносят по 10,0 см3 раствора гидроокиси натрия и, при постоянном перемешивании, 3,0 см3 разбавленного реактива Фолина-Сиокалто. Измеряют оптическую плотность растворов в соответствии с А.6.3.
Строят градуировочный график зависимости оптической плотности от массы тирозина в микромолях.
По градуировочному графику определяют массу тирозина в микромолях, соответствующую оптической плотности окрашенного раствора, скорректированной с результатом контрольного испытания.
Активность пепсина a, мкмоль/г в минуту при (25 +/- 1) °C, рассчитывают по формуле
m — масса пепсина, взятая в А.6.1, мг;
t — продолжительность реакции, мин (t = 10 мин).
Примечание. Две единицы активности пепсина на миллиграмм, полученные настоящим методом, соответствуют 3,64 миллиединицам Ансона на миллиграмм (в микромолях тирозина на миллиграмм в минуту при 35,5 °C) или 36400 коммерческим единицам на грамм (в микромолях тирозина на грамм за 10 мин при 35,5 °C).
Точность настоящего метода установлена в результате межлабораторного испытания, проведенного на международном уровне ИСО/ТК 34/ПК 10. В этом испытании принимали участие 19 лабораторий, каждая из которых провела по три параллельных определения шести образцов.
(справочное)
[1] ИСО 6497. Корма для животных. Методы отбора проб.