ГОСТ Р 51197-98 (ИСО 4133-79). Государственный стандарт Российской Федерации. Мясо и мясные продукты. Метод определения глюконо-дельта-лактона

(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 28.08.1998 № 335)

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МЯСО И МЯСНЫЕ ПРОДУКТЫ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОНО- \delta -ЛАКТОНА

Meat and meat products. Method for determination of glucono- \delta -lactone content

ГОСТ Р 51197-98

1 января 2000 года

Предисловие

1. Разработан Московской государственной академией пищевых производств.

Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 335 «Методы испытаний агропромышленной продукции на безопасность».

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 28 августа 1998 г. № 335.

3. Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 4133-79 «Мясо и мясные продукты. Определение содержания глюконо- \delta -лактона» с дополнительными требованиями, отражающими потребности экономики страны (6.6, 6.8, 6.12, 7.1 и 9.1).

4. Введен впервые.

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения глюконо- \delta -лактона.

2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

ГОСТ 9792-73. Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 9793-74. Продукты мясные. Методы определения влаги.

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Массовая доля глюконо- \delta -лактона — массовая доля глюконо- \delta -лактона, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.

4. СУЩНОСТЬ МЕТОДА

Глюконо- \delta -лактон экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют, затем проводят гидролиз глюконо- \delta -лактона, содержащегося в фильтрате, гидроксида калия с образованием глюконата.

Преобразуют глюконат в 6-фосфоглюконат в ходе реакции с аденозин-5-трифосфатом (АТФ) в присутствии глюконаткиназы (ГК):

Восстанавливают 6-фосфоглюконатом эквивалентное количество никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) в присутствии 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГДГ):

Измеряют массовую долю образовавшейся восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) на спектрофотометре при длине волны 365 нм.

5. РЕАКТИВЫ

Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2), должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тщательно вымытой и пропаренной или стерилизованной.

Вода, используемая для приготовления растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.

Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.

Примечание. Однократно дистиллированная вода может содержать ионы металлов, которые снижают активность ферментов, а деминерализованная вода может содержать микроорганизмы, увеличивающие неспецифическую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анализа.

Препарат НАДФ должен содержать не менее 90% основного вещества.

Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия их качества требованиям настоящего стандарта.

5.1 Раствор хлорной кислоты c(HClO_{4}) = 0,4\text{моль}/\text{дм}^{3}

17,3 см3 раствора хлорной кислоты массовой доли 70% и плотности 1,67 г/см3 помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доводят объем раствора до метки водой.

Примечание. При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемого для осаждения белков.

5.2 Раствор гидроксида калия c (КОН) = 2 моль/дм3

Растворяют 56,1 г гидроксида калия в воде, доводят объем раствора до 500 см3.

5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,0 pH

Растворяют 2,64 г глицилглицина (C_{4}H_{8}N_{2}O_{3}) и 0,284 г хлорида магния гексагидрата (MgCl_{2} \cdot 6H_{2}O) в 150 см3 воды. Устанавливают активную кислотность раствора 8,0 pH при 20 °C раствором гидроксида калия (5.2), используя для измерений pH-метр. Доводят объем раствора до 200 см3.

Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °C.

5.4 Раствор НАДФ

Растворяют 50 мг динатриевой соли никотинамидадениндинуклеотидфосфорной кислоты (НАДФ- Na_{2} ) в 5,0 см3 воды.

Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °C.

5.5 Раствор аденозин-5-трифосфата (АТФ)

Растворяют 250 мг динатриевой соли аденозин-5-трифосфорной кислоты (АТФ- Na_{2} ) и 250 мг гидрокарбоната натрия (NaHCO_{3}) в 5,0 см3 воды.

Раствор устойчив не менее 1 мес при температуре 4 °C.

5.6 Суспензия 6-ФГДГ

Используют поставляемую в готовом виде суспензию 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из дрожжей, содержащую 6-ФГДГ концентрации 2,0 мг/см3 и удельной активности не менее 220 E/см3, а также глюконаткиназу и НАДФН-оксидазу массовых долей не более 0,05% каждого.

Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 °C.

5.7 Суспензия ГК

Используют поставляемую в готовом виде суспензию глюконаткиназы из E.coli, содержащую ГК концентрации 1,0 мг/см3 и удельной активности не менее 26 E/см3 и НАДФН массовой доли не более 0,05%.

Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 °C.

6. СРЕДСТВА КОНТРОЛЯ И ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА

Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1 - 6.11.

6.1. Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.

6.2 Миксер лабораторный.

6.3. Центрифуга лабораторная с пробирками номинальной вместимостью 50 или 100 см3.

6.4. Иономер или pH-метр диапазоном измерений 1 — 14 pH и допускаемой погрешностью +/- 0,05 pH.

6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.

6.6. Колбы мерные вместимостью 100, 200 и 250 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 0,2%.

6.7. Дозаторы пипеточные объемами доз 25 и 100 см3 и относительной погрешностью дозирования +/- 1%.

6.8. Пипетки градуированные вместимостью 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 и 2,5 см3 и допускаемой относительной погрешностью +/- 1%.

6.9. Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.

6.10. Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 нм; интервал измерений оптической плотности — от 0,000 до 2,000; погрешность установки длины волны — +/- 3 нм; среднее квадратическое отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0,15%.

6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.

6.12. Весы лабораторные общего назначения наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью +/- 0,001 г.

7. ПОРЯДОК ПОДГОТОВКИ К ПРОВЕДЕНИЮ ИЗМЕРЕНИЯ

7.1 Отбор проб — по ГОСТ 9792.

7.2. Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.

8. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ИЗМЕРЕНИЙ

8.1 Подготовка пробы к проведению измерений

Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.

Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху, герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.

8.2 Навеска для проведения анализа

Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помещают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).

8.3 Приготовление экстракта

8.3.1. К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см3 охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.

8.3.2. Часть гомогенизата помещают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000\text{мин}^{- 1} , затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см3. Первые 10 см3 фильтрата выбрасывают.

8.3.3. 50 см3 подготовленного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см3 и доводят активную кислотность раствора до 10 pH раствором гидроксида калия (5.2).

8.3.4. Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем раствора до метки водой.

8.3.5. Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см3 фильтрата.

8.3.6. 25 см3 фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят объем фильтрата до метки водой.

Примечание. Объем фильтрата может быть иным. Его выбирают так, чтобы концентрация D-(+)-глюконата была приблизительно 0,40 г/дм3.

8.4 Определение

8.4.1. Для проведения ферментативной реакции берут две фотометрические кюветы (6.11), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:

• 2,50 см3 буферного раствора (5.3);
• 0,10 см3 раствора НАДФ (5.4);
• 0,10 см3 раствора АТФ (5.5).

Затем в одну кювету вносят 0,20 см3 экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,20 см3 воды, получая контрольный раствор.

В каждую кювету вносят по 0,05 см3 суспензии 6-ФГДГ (5.6) и тщательно перемешивают содержимое пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).

Содержимое кювет выдерживают 5 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 365 нм: A_{1} — оптическая плотность исследуемого раствора, A_{1k} — оптическая плотность контрольного раствора.

8.4.2. В обе кюветы вносят по 0,01 см3 суспензии ГК (5.7), содержимое кювет перемешивают пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).

Растворы выдерживают от 10 до 15 мин при комнатной температуре. Затем измеряют оптические плотности, повторяя измерения каждые 2 мин до достижения постоянных значений.

Строят графики зависимости оптических плотностей растворов от времени и экстраполируют их на момент внесения фермента ГК (Приложение А).

Получают экстраполированные значения оптических плотностей исследуемого ( A_{2} ) и контрольного ( A_{2k} ) растворов.

8.5. Выполняют два параллельных определения в двух пробах из одного и того же образца (8.1).

9. ПРАВИЛА ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

9.1 Метод расчета

Массовую долю глюконо- \delta -лактона в пробе X, %, вычисляют по формуле

где \Delta A = (A_{2} - A_{1}) - (A_{2k} - A_{1k}) ;

196,1 — молярная масса D-(+)-глюконовой кислоты;

M — массовая доля влаги в пробе, определенная в соответствии с ГОСТ 9793;

m — масса навески (8.2), г;

k — микромолярный коэффициент оптической плотности НАДФН (k = 3,5 см2/мкмоль при длине волны 365 нм и k = 6,23 см2/мкмоль при длине волны 340 нм);

V — объем фильтрата, взятый на определение (8.3.6), см3.

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2.

Результат определяют с точностью 0,01%.

9.2 Сходимость

Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать 10% среднего арифметического значения.

10. ПРИМЕЧАНИЯ ПО МЕТОДИКЕ

10.1 Измерение может быть проведено также при длине волны 340 нм.

10.2. Неорганические соли (ионы фосфата, натрия, калия и аммония) могут замедлять ферментативную реакцию. В таких случаях увеличивают количество фермента. Практика показывает, что при анализе мясных продуктов, содержащих фосфаты, нет необходимости увеличивать количество добавляемого фермента.

10.3. Стабильность готовых суспензий ферментов, как правило, гарантируется производителем в течение гарантийного срока хранения, указанного на этикетке.

Препараты ферментов и буферный раствор должны храниться в холодильнике. Кроме того, растворы ферментов необходимо держать на лабораторном столе в охлажденном состоянии, для чего их помещают в перфорированную металлическую емкость, охлаждаемую льдом.

11. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ

В отчете об испытании должны быть указаны:

• используемый метод;
• полученные результаты;
• любые условия проведения испытаний, не установленные данным стандартом и касающиеся подробностей, которые могут повлиять на конечный результат.

В отчете должны быть все данные, необходимые для полной идентификации пробы.

---