ГОСТ Р 51116-97. Государственный стандарт Российской Федерации. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина)

(принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25.12.1997 № 426)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 51116-97"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-51116-97" "ГОСТ Р 51116-97. Государственный стандарт Российской Федерации. Комбикорма, зерно, продукты его переработки. Метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) (принят и "
  n1["ГОСТ Р 51116-2017"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-r-51116-2017" "ГОСТ Р 51116-2017. Национальный стандарт Российской Федерации. Комбикорма, зерно и продукты его переработки. Определение содержания дезоксиниваленола методом высокоэффективной... ("
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 25 декабря 1997 г. № 426

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КОМБИКОРМА, ЗЕРНО, ПРОДУКТЫ ЕГО ПЕРЕРАБОТКИ

МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА)

Compound feeds, grain and grain by-products. Method for determination of desoxinivalenol (vomitoxin) content

ГОСТ Р 51116-97

Предисловие

1. Разработан и внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 «Комбикорма, БВД, премиксы», АООТ «Всероссийский научно-исследовательский институт комбикормовой промышленности» (АООТ «ВНИИКП»).

2. Принят и введен в действие Постановлением Госстандарта России от 25 декабря 1997 г. № 426.

3. Введен впервые.

1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящий стандарт распространяется на зерно (пшеницу, кукурузу, ячмень, овес), продукты его переработки (муку, крупу, отруби и др.), комбикорма и устанавливает метод определения содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) с использованием жидкостного хроматографа «Милихром».

Сущность метода заключается в экстракции дезоксиниваленола (вомитоксина) из испытуемой пробы смесью ацетонитрила с водой, очистке экстракта на двух последовательных колонках с активированным углем и количественном определении дезоксиниваленола (вомитоксина) с помощью жидкостного хроматографа «Милихром» со спектрофотометрическим детектором на ультрафиолетовую область (далее с УФ-детектором) в двухволновом режиме.

Пределы определения в пробе — 0,2 — 4,0 мг/кг, в растворе — 1 - 20 нг/мкдм3.

2. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

В настоящем стандарте использованы ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия

ГОСТ 5556-81 Вата медицинская гигроскопическая. Технические условия

ГОСТ 6995-77 Метанол-яд. Технические условия

ГОСТ 13496.0-80 Комбикорма, сырье. Методы отбора проб

ГОСТ 13586.3-83 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 24104-88 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26312.1-84 Крупа. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 27668-88 Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб

ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

3. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Весы лабораторные общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г по ГОСТ 24104.

Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 20 г по ГОСТ 24104.

Мельница лабораторная электрическая типа ЭМ-3А, обеспечивающая измельчение пробы до прохода без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С, обеспечивающий частоту встряхивания 200 колебаний в минуту.

Хроматограф жидкостный «Милихром» с УФ-детектором со спектральным диапазоном 190 — 360 нм, обеспечивающий одновременное измерение на не менее двух длинах волн, уровень шумов не более 10^{- 4} единиц оптической плотности (е. о. п.).

Спектрофотометр типа СФ-26, СФ-46 со спектральным диапазоном 186 — 1100 нм, основная погрешность измерений коэффициента пропускания не более 1%, градуировки длин волн в УФ-области — не более 0,1 нм.

Колонка аналитическая хроматографическая для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) размером 80 x 2 мм, заполненная сорбентом диабонд С 16 с эффективностью не ниже 5000 теоретических тарелок (далее — т. т.).

Колонки хроматографические для жидкостной хроматографии (ЖХ) размером 100 x 5 мм с оттянутым концом и шарообразной верхней частью вместимостью 25 см3.

Баллон с азотом.

Сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Испаритель ротационный марки ИР-2М или насос водоструйный.

Колбы мерные 1(2)-25(50, 100)-2 по ГОСТ 1770.

Цилиндры мерные 1(3)-25(100, 250) по ГОСТ 1770.

Колбы 0-25(50)-14/23 ТС по ГОСТ 25336.

Пробирки типа П1 по ГОСТ 25336.

Пипетки 1-1-2-0,5(1, 2, 5, 10) по ГОСТ 29227.

Колбы плоскодонные конические с притертыми стеклянными или полиэтиленовыми пробками вместимостью 500 см3.

Склянки из темного стекла с притертыми пробками.

Уголь активированный марки ФАС размером частиц от 0,08 до 0,10 мм по НД [1].

Фильтры бумажные обеззоленные марки ФОМ по НД [2].

Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.

Метанол-яд по ГОСТ 6995.

Ацетонитрил для хроматографии с содержанием основного вещества не менее 99,5% (оптическая плотность ацетонитрила при длине волны 210 нм относительно воды должна быть не более 0,3 е. о. п.)

Дезоксиниваленол (вомитоксин) кристаллический массовой долей основного вещества не менее 90%.

Вода бидистиллированная электрическим сопротивлением не менее 12 МОм.

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.

4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

4.1. Отбор проб по ГОСТ 13496.0, ГОСТ 13586.3, ГОСТ 26312.1, ГОСТ 27668.

Масса средней пробы исследуемого продукта должна быть не менее 2 кг.

4.2 Подготовка пробы к испытанию

Из средней пробы исследуемого продукта методом квартования выделяют часть пробы массой не менее 100 г и измельчают на лабораторной мельнице до такого состояния, чтобы она проходила без остатка через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Выделенную часть размолотой пробы тщательно перемешивают.

Выделенную часть пробы муки используют для анализа без предварительного размалывания.

4.3 Приготовление элюирующих растворов

Приготавливают смеси ацетонитрила и воды в объемных соотношениях: 0,05:1; 0,125:1; 0,5:1; 1:1.

4.4 Приготовление исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина)

Навеску кристаллического дезоксиниваленола (вомитоксина) массой (10 +/- 0,01) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем раствора бидистиллированной водой до метки.

Для определения массовой концентрации дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе 3 см3 исходного раствора переносят в пробирку. Растворитель испаряют в токе азота или при вакууме с помощью водоструйного насоса при нагревании не выше 60 °C досуха. К остатку добавляют 3 см3 метилового спирта и измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 218 нм в кюветах толщиной просвечиваемого слоя 10 мм относительно метилового спирта.

Массовую концентрацию дезоксиниваленола (вомитоксина) в исходном растворе c_{\text{и}} , нг/мкдм3, вычисляют по формуле

где D — оптическая плотность исходного раствора дезоксиниваленола (вомитоксина), е. о. п.;

296 — молекулярная масса дезоксиниваленола (вомитоксина), г;

4500 — коэффициент молярной экстинкции дезоксиниваленола (вомитоксина), дм3/моль x см;

10^{9} — коэффициент пересчета г в нг;

10^{6} — коэффициент пересчета дм3 в мкдм3.

4.5 Приготовление градуировочных растворов дезоксиниваленола (вомитоксина)

В мерные колбы вместимостью 100 см3 переносят исходный раствор дезоксиниваленола (вомитоксина) в объемах, указанных в таблице 1. Объем жидкости в колбах доводят до метки дистиллированной водой.

Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном месте при температуре около 0 °C не более года.

4.6 Подготовка колонок для жидкостной хроматографии (ЖХ) для очистки экстракта

На дно двух хроматографических колонок (ЖХ) помещают промытые ацетонитрилом ватные тампоны. В одну колонку вносят (0,2 +/- 0,05) г (далее колонка 1), в другую — (0,1 +/- 0,05) г (далее колонка 2) активированного угля. Уплотняют при осторожном постукивании до высоты слоя, не изменяющейся при дальнейшее постукивании.

4.7 Кондиционирование ВЭЖХ колонки

Перед первыми анализами колонку кондиционируют, проводя 3 — 4 холостых опыта, т.е. проводят градиентное элюирование по 5.3 без введения в колонку пробы.

4.8 Градуировка прибора

Для градуировки прибора в колонку (ВЭЖХ) вводят по 4 мкдм3 градуировочных растворов и проводят хроматографирование по 5.3. Каждый градуировочный раствор вводят 3 раза. Для каждого пика определяют время удерживания ( t_{i} , мин), измеряют высоту пика ( h_{i} , мм) или е. о. п.

По полученным результатам устанавливают время удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) и погрешность времени удерживания. Среднее время удерживания \overline{t} , мин, вычисляют по формуле

где t_{i} — время удерживания для i-го градуировочного раствора, мин;

n — количество введенных в хроматограф градуировочных растворов (n = 9).

Среднее квадратическое отклонение значения времени удерживания S, мин, вычисляют по формуле

Границы абсолютной погрешности значения времени удерживания \pm \Delta_{t} , мин, вычисляют по формуле

где t — критерий Стьюдента для числа степеней свободы f = n — 1 (P = 0,95). Записывают интервал, в котором могут находиться с вероятностью P = 0,95 значения времени удерживания дезоксиниваленола (вомитоксина) от (\overline{t} - \Delta_{t}) до (\overline{t} + \Delta_{t}) .

По результатам хроматографирования градуировочных растворов определяют значение градуировочного коэффициента. Для этого сначала вычисляют для каждого градуировочного раствора значение градуировочного коэффициента K_{i} , нг/мм или нг/е. о. п., по формуле

где m_{i} — масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с i-ым градуировочным раствором, нг (по данным таблицы 1);

h_{i} — высота пика i-го градуировочного раствора, мм или е. о. п.

Среднее арифметическое значение градуировочного коэффициента \overline{K} , нг/мм или нг/е. о. п., вычисляют по формуле

где n — количество градуировочных растворов, введенных в хроматограф (n = 9).

Значение градуировочного коэффициента контролируют не реже одного раза в месяц. Для этого вводят в хроматограф один из градуировочных растворов и вычисляют для него градуировочный коэффициент K_{i} . Если при этом |K_{i} - \overline{K}| \leq 0,1\overline{K} , прибор не подлежит переградуировке. В противном случае прибор должен быть отградуирован заново согласно 4.8.

5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

5.1 Экстракция дезоксиниваленола (вомитоксина) из исследуемого продукта

Навеску исследуемого продукта массой (25 +/- 0,05) г помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 500 см3, приливают 20 см3 бидистиллированной воды и затем 105 см3 ацетонитрила. Колбу закрывают пробкой и встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный складчатый фильтр в колбу с притертой пробкой.

5.2 Очистка экстракта

5 см3 фильтрата (5.1) переносят в колонку 1 (ЖХ) (4.6) и элюируют в остродонную колбу вместимостью 50 см3 со скоростью не более 0,5 см3/мин. С целью ускорения элюирование можно проводить с помощью вакуума водоструйного насоса. Не допуская осушения сорбента, через колонку пропускают 15 см3 ацетонитрила, собирая элюат в ту же остродонную колбу.

По окончании элюирования из колбы с помощью ротационного вакуумного испарителя при температуре не более 60 °C полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку добавляют 1 см3 бидистиллированной воды. Колбу закрывают пробкой и ее стенки осторожно споласкивают находящейся в ней жидкостью. Содержимое колбы с помощью пипетки переносят в колонку 2 (4.6). Стенки колбы повторно обмывают 1 см3 бидистиллированной воды, которую также переносят в колонку 2. Колонку 2 промывают 2 см3 бидистиллированной воды и элюат отбрасывают.

Из колонки 2 дезоксиниваленол элюируют 7,5 см3 ацетонитрила в остродонную колбу вместимостью 25 см3. Собранный элюат упаривают досуха с помощью ротационного вакуумного испарителя. Остаток растворяют в 0,2 см3 метилового спирта. Полученный раствор используют для хроматографического анализа (далее — испытуемый раствор).

5.3 Выполнение измерений

5.3.1 Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих условиях:

а) разделение компонентов проводят на колонке размером 80 x 2 мм;

б) сорбент — диабонд С 16 с эффективностью не менее 5000 т. т.;

в) рабочие длины волн УФ-детектора — 230 и 276 нм (230 нм — опорная длина волны, 276 нм — длина волны для контроля чистоты экстракта);

г) скорость элюирования — 100 мкдм3/мин.

Элюирование проводят в градиентном режиме. Для этого в шприце насоса готовят элюент с переформированным градиентом. Насос устанавливают в перевернутое положение и набирают последовательно:

600 мкдм3 воды;

500 мкдм3 раствора ацетонитрил — вода (0,05:1);

600 мкдм3 раствора ацетонитрил — вода (0,125:1);

100 мкдм3 раствора ацетонитрил — вода (0,5:1);

100 мкдм3 раствора ацетонитрил — вода (1:1);

700 мкдм3 ацетонитрила;

д) объем анализируемого раствора — 4 мкдм3;

е) чувствительность — 0,1 е. о. п. при 100 милливольтах шкалы самописца.

На приборе устанавливают следующие параметры:

количество образцов — 3;

объем ступеней, мкдм3: 1-600, 2-500, 3-600, 4-100, 5-100, 6-700;

объем регенерации, мкдм3 — 200, буфера — 15, пробы — 4, буфера — 10;

расход элюента — 100 мкдм3/мин;

скорость набора — 800 мкдм3/мин.

5.3.2 Проведение измерений испытуемого раствора

Допускается проведение анализа методом внешнего стандарта.

Если прибор предварительно отградуирован по 4.8, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм3 испытуемого раствора, полученного по 5.2. По показаниям прибора при двух длинах волны — 230 и 276 нм оценивают чистоту испытуемого раствора согласно инструкции к прибору. Идентификацию пика дезоксиниваленола (вомитоксина) проводят по времени удерживания (t), которое должно находиться в интервале, установленном при градуировке: (\overline{t} - \Delta_{t}) \leq t \leq (\overline{t} + \Delta_{t}) . Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина).

Если прибор предварительно не градуировали, в колонку хроматографа вводят три раза по 4 мкдм3 испытуемого раствора и градуировочных растворов. Измеряют высоту пиков дезоксиниваленола (вомитоксина) испытуемого раствора и того градуировочного раствора, высота пиков которого наименее отличается от высоты пиков испытуемого раствора.

6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

6.1. В том случае, когда одновременно с испытуемыми растворами хроматографируют и градуировочные растворы, массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) X, нг/г, в испытуемой пробе вычисляют по формуле

где m_{i} — масса дезоксиниваленола (вомитоксина), введенная в хроматограф с i-ым градуировочным раствором, высота пика которого наименее отличается от высоты пика испытуемого раствора, нг (определяется по данным таблицы 1);

h_{\text{обр}.} — среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков испытуемого раствора, мм или е. о. п.;

h_{i} — среднее арифметическое значение трех измерений высоты пиков i-го градуировочного раствора, мм или е. о. п.;

0,2 — объем испытуемого раствора дезоксиниваленола (вомитоксина) из образца, см3;

4 — объем испытуемого раствора, введенный в хроматограф, мкдм3;

125 — объем экстракта испытуемой пробы, см3;

5 — объем экстракта испытуемой пробы, взятый для очистки, см3;

25 — масса навески испытуемой пробы, г;

87 — степень извлечения дезоксиниваленола (вомитоксина) из пробы, %;

1000 — коэффициент пересчета см3 в мкдм3.

6.2. Массовую долю дезоксиниваленола (вомитоксина) X, нг/г, в испытуемой пробе с использованием градуировочного коэффициента вычисляют по формуле

где K — градуировочный коэффициент, нг/мм или нг/е. о. п.

6.3. При анализе каждой испытуемой пробы выполняют два параллельных определения, начиная со взятия навески испытуемой пробы по 5.1.

Если расхождение между результатами параллельных определений не превышает |X_{1} - X_{2}| \leq 0,01d\overline{X} , где X_{1} , X_{2} и \overline{X} — результаты первого и второго параллельных определений и их среднее арифметическое соответственно, то среднее арифметическое X принимают за результат анализа. В противном случае анализ повторяют. Значение норматива (d) приведено в таблице 2.

По полученному результату анализа и значению относительной погрешности ( \sigma , таблица 2) рассчитывают абсолютную погрешность \Delta , нг/г, по формуле

Результат анализа представляют в виде: (X \pm \Delta)\text{нг}/\text{г} при P = 0,95. Числовое значение результата анализа и его погрешность должны оканчиваться цифрой одного и того же разряда.

7. КОНТРОЛЬ ТОЧНОСТИ АНАЛИЗОВ

Внутренний оперативный контроль (ВОК) точности анализов включает контроль сходимости, воспроизводимости и точности результатов анализов. При превышении нормативов ВОК точности проводят повторные анализы. При повторном превышении указанных нормативов анализы приостанавливают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

7.1. Сходимость параллельных определений контролируют для каждой анализируемой пробы согласно 6.3.

7.2. Для проведения ВОК воспроизводимости используют рабочие пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, получая два результата анализа в разных лабораториях или в одной, причем в этом случае максимально варьируют условия проведения анализа, т.е. используют разные наборы мерной посуды, анализы выполняют в разные дни или два различных аналитика.

Воспроизводимость контрольных анализов, а также воспроизводимость результатов анализа рабочих проб, выполненных за период, в течение которого условия проведения анализа принимают за стабильные и соответствующие условиям проведения контрольных анализов, признают удовлетворительной, если |\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}| \leq 0,01D\overline{X} , где \overline{X_{1}} , \overline{X_{2}} и \overline{X} — результаты анализа одной и той же пробы, полученные при варьирующих условиях в одной лаборатории или разных лабораториях, и их среднее арифметическое значение соответственно; D — значение норматива ВОК воспроизводимости (таблица 2).

Периодичность проведения ВОК воспроизводимости не реже одного раза в две недели.

7.3. Для проведения ВОК точности используют рабочие пробы с известной добавкой дезоксиниваленола (вомитоксина). Пробу делят на две равные части, первую из которых анализируют в соответствии с методикой, а во вторую вводят известную добавку дезоксиниваленола (вомитоксина), а затем анализируют в соответствии с методикой. Добавка должна составлять 50 — 150% содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в анализируемой пробе. Результаты получают по возможности в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Точность контрольных анализов признают удовлетворительной, если |\overline{X^{1}} - \overline{x} - C| \leq 0,01 \cdot K \cdot \overline{X} , где \overline{X^{1}} , \overline{X} и C — результаты контрольных анализов пробы с известной добавкой, без добавки и значение добавки соответственно; K — значение норматива ВОК точности при использовании метода добавок (таблица 2).

Контроль точности анализа проводят не реже одного раза в месяц, а также при смене реактивов и после длительного перерыва в работе.

7.4 Результаты ВОК заносят в специальный журнал контроля.

1. ТУ 6-16-3096-89 Уголь активированный

2. ТУ 6-09-1678-86 Фильтры обеззоленные (белая, красная, синяя ленты)

------------------------------------------------------------------