ГОСТ ISO 7889-2015. Межгосударственный стандарт. Йогурт. Подсчет характерных микроорганизмов. Методика подсчета колоний микроорганизмов после инкубации при температуре 37 °C
(введен в действие Приказом Росстандарта от 08.07.2016 № 824-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 26.05.2014 № 80). Документ введен в действие с 1 июля 2017 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 июля 2016 г. № 824-ст
ПОДСЧЕТ ХАРАКТЕРНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДИКА ПОДСЧЕТА КОЛОНИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ ПОСЛЕ ИНКУБАЦИИ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ 37 °C
Yogurt. Enumeration of characteristic microorganisms. Colony-count technique after incubation at 37 °C
(ISO 7889:2003/IDF 117:2003 — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at 37 °C, IDT)
07.100.30
Дата введения 1 июля 2017 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
1 ПОДГОТОВЛЕН научно-производственным республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт стандартизации и сертификации» (БелГИСС) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 февраля 2015 г. № 75-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 июля 2016 г. № 824-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 7889-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 7889:2003/IDF 117:2003 «Йогурт. Подсчет характеристических микроорганизмов. Метод определения количества колоний при 37 °C» («Yogurt — Enumeration of characteristic microorganisms — Colony-count technique at 37 °C», IDT).
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 5 «Молоко и молочные продукты» Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO) и Международной молочной федерацией (IDF) совместно с Международной ассоциацией химиков-аналитиков (AOAC International).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий межгосударственный стандарт, и международного стандарта, на который дана ссылка, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).
В разделе «Нормативные ссылки» и тексте стандарта ссылки на международный стандарт актуализированы.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт устанавливает метод подсчета характерных микроорганизмов в йогурте посредством подсчета колоний микроорганизмов при температуре 37 °C.
Метод применим к йогуртам, в которых присутствуют жизнеспособные микроорганизмы (видов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophillus).
Для применения настоящего стандарта необходимы следующие ссылочные стандарты. Для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения).
ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination — Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятикратных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятикратных разведений)
ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs — General requirements and guidance for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)
ISO 8261:2001|IDF 122:2001 <1> Milk and milk products — General guidance for the preparation of test samples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination (Молоко и молочные продукты. Общее руководство по подготовке образцов для испытания, исходных суспензий и децимолярных растворов для микробиологического исследования)
<1> Действует только для применения настоящего стандарта.
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 характерные микроорганизмы в йогурте (characteristic microorganisms in yogurt): Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophillus, обнаруживаемые в условиях, описанных в настоящем стандарте.
3.2 Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus: Термофильный микроорганизм, образующий чечевицеобразные часто заостренные колонии диаметром 1 — 3 мм на подкисленной среде (MRS) в условиях, описанных в настоящем стандарте.
Примечание - Под микроскопом эти микроорганизмы выглядят как палочки, обычно короткие, но иногда имеют удлиненную форму. Они не образуют спор, грамположительные, неподвижные и каталазонегативные.
3.3 Streptococcus thermophillus: Термофильный микроорганизм, образующий чечевицеобразные колонии диаметром 1 — 2 мм в среде M17 в условиях, описанных в настоящем стандарте.
Примечание - Под микроскопом эти микроорганизмы выглядят как сферические или овоидные клетки (диаметром 0,7 — 0,9 мкм), располагаемые парами или длинными цепочками. Грамположительные и каталазонегативные.
4.1 Десятикратное разведение исследуемого образца инокулируют в:
a) подкисленную среду (MRS), далее инкубируют в аэробных условиях при температуре 37 °C +/- 1 °C в течение 72 ч, подсчитывают количество Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus;
b) полную среду (M17) далее инкубируют в аэробных условиях при температуре 37 °C +/- 1 °C в течение 48 ч, подсчитывают количество Streptococcus thermophillus.
4.2 Колонии подсчитывают и подтверждают полученные результаты посредством проведения соответствующих испытаний.
4.3 Число характерных микроорганизмов на грамм образца рассчитывают, исходя из количества колоний, полученных на чашках, при таких уровнях разведения, которые дают значимый результат.
5 Питательная среда, разбавители и реактивы
Используют только признанные аналитически чистые реактивы, дистиллированную или деминерализованную воду или воду эквивалентной чистоты по ISO 6887-1 и ISO 8261/IDF 122.
5.1 Разбавитель
Разбавитель по ISO 6887-1 и ISO 8261/IDF 122.
5.2 Питательная среда
Используют свежеприготовленную питательную среду (MRS и M17), которую нельзя подвергать воздействию прямого солнечного света.
Если приготовленные питательные среды используют не сразу, то их охлаждают и хранят при температуре 2 — 4 °C не более 1 недели в условиях, которые не изменяют их состава.
Условия хранения установлены в ISO 7218.
5.2.1 Окисленная среда MRS (см. [7])
5.2.1.1 Состав
| Пептон 1 (триптический гидролизат казеина), г | 10,0 |
|---|---|
| Мясной экстракт, г | 10,0 |
| Дрожжевой экстракт (сухой), г | 5,0 |
| Глюкоза (C6H12O6), г | 20,0 |
| Твин 80 (сорбитан моноолеат), см3 | 1,0 |
| Двузамещенный фосфорнокислый калий (K2HPO4), г | 2,0 |
| Натрия ацетат тригидрат (CH3CO2Na·3H2O), г | 5,0 |
| Цитрат диаммония [C6H6O7(NH4)2], г | 2,0 |
| Гептагидрат сульфата магния (MgSO4·7H2O), г | 0,2 |
| Сульфат марганца тетрагидрат (MnSO4·4H2O), г | 0,05 |
| Агар, г <1> | 9,0 — 18,0 |
| Вода в объеме до, см3 | 1000 |
<1> В зависимости от устойчивости геля в агаре или согласно указаниям изготовителя.
5.2.1.2 Приготовление
Каждый компонент растворяют отдельно на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до температуры 50 °C. Используя уксусную кислоту (5.3.3), корректируют уровень pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 5,4 +/- 0,1 ед. pH при измерении при помощи pH-метра (6.8) при температуре 25 °C +/- 1 °C. Среду переносят по 100 см3 во флаконы вместимостью 150 см3 (6.10) или по 200 см3 во флаконы вместимостью 250 см3 (6.10). Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121 °C +/- 1 °C.
1 Среда MRS высокочувствительна к тепловой обработке, которая может вызвать различия в зависимости от используемого автоклава.
2 Сличительные испытания показали, что коммерчески доступные среды MRS могут дать число микроорганизмов, которое меньше числа, наблюдаемого в среде MRS, приготовленной согласно настоящему стандарту. Поэтому в случае использования коммерчески доступной среды MRS ее следует проверить в сравнении со средой, приготовленной согласно настоящему стандарту.
До начала проведения бактериологического исследования полностью расплавляют необходимое количество среды на водяной бане (6.7) при температуре кипения или путем обработки паром в закрытом контейнере. Затем охлаждают на другой водяной бане (6.7).
5.2.2 Среда M17 (см. [8])
5.2.2.1 Основная среда
5.2.2.1.1 Состав
| Пептон 1 (триптический гидролизат казеина), г | 2,5 |
|---|---|
| Пептон 2 (пептический гидролизат мяса), г | 2,5 |
| Пептон 3 (папаиновый гидролизат сои), г | 5,0 |
| Дрожжевой экстракт (сухой), г | 2,5 |
| Мясной экстракт, г | 5,0 |
| \beta - \text{глицерофосфат} (динатриевая соль) (C3H7O6PNa2), г | 19,0 |
| Гептагидрат сульфата магния (MgSO4·7H2O), г | 0,25 |
| Аскорбиновая кислота (C6H8O6), г | 0,50 |
| Агар, г <1> | 9,0 — 18,0 |
| Вода в объеме до, см3 | 950 |
<1> В зависимости от устойчивости геля в агаре или согласно указаниям изготовителя.
5.2.2.1.2 Приготовление
Отдельно растворяют каждый компонент на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до 50 °C. Корректируют уровень pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял 6,8 +/- 0,1 ед. pH при температуре 25 °C +/- 1 °C, используя реактив (5.3) и проверяют уровень pH при помощи pH-метра (6.8). Среду переносят по 95 см3 во флаконы вместимостью 150 см3 (6.10). Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121 °C +/- 1 °C.
5.2.2.2 Раствор лактозы
5.2.2.2.1 Состав
| Лактоза (C12H22O11), г | 10,0 |
|---|---|
| Вода в объеме до, см3 | 100 |
5.2.2.2.2 Приготовление
Растворяют лактозу в воде. Разводят водой до 100 см3. Стерилизуют в течение 15 мин. в автоклаве при температуре 121 °C +/- 1 °C.
5.2.2.3 Полная среда (M17)
5.2.2.3.1 Состав
| Основная среда (5.2.2.1), см3 | 95,0 |
|---|---|
| Раствор лактозы (5.2.2.2), см3 | 5,0 |
5.2.2.3.2 Приготовление
Непосредственно перед использованием расплавляют основную среду на водяной бане (6.7) при температуре кипения. Охлаждают на другой водяной бане (6.7) до температуры 50 °C. Предварительно нагревают раствор лактозы на водяной бане (6.7), установленной на температуру 50 °C. Добавляют раствор лактозы в основную среду и перемешивают вихревыми движениями. Охлаждают среду на водяной бане до температуры 44 — 47 °C.
Примечание - Полная среда M17 доступна в продаже, но может показать результаты, существенно отличающиеся в зависимости от поставщика. Поэтому в случае использования коммерчески доступной среды M17 ее следует проверить в сравнении со средой, приготовленной согласно настоящему стандарту.
5.3 Реактивы для корректировки pH
5.3.1 Раствор гидроокиси натрия, c(NaOH) = приблизительно 0,1 моль/дм3.
5.3.2 Разведенная соляная кислота, c(HCl) = приблизительно 0,1 моль/дм3.
5.3.3 Уксусная кислота (CH3COOH), 100% (ледяная).
5.4 Реактив для окрашивания, этиловый раствор метиленового синего, 6 г/дм3.
5.5 Реактив для очистки поверхности контейнера, этанол 70% (объемная доля).
Стерилизацию оборудования, контактирующего с исследуемым образцом, разбавителем, разведениями или питательной средой, проводят согласно требованиям ISO 8261|IDF 122. Лабораторная посуда должна быть устойчивой к многократной стерилизации.
Применяют обычное микробиологическое лабораторное оборудование (см. ISO 7218) для приготовления исследуемых образцов и разведений, указанное в ISO 8261|IDF 122, в частности указанное ниже.
6.1 Инкубатор, поддерживающий температуру 37 °C +/- 1 °C.
6.2 Камера для анаэробной инкубации или анаэростаты, поддерживающие температуру 37 °C +/- 1 °C, обеспечивающие атмосферу с 90% азота и 10% углекислого газа.
6.3 Смеситель перистальтический (стомахер) со стерильными пластиковыми пакетами или роторный, работающий при минимальной частоте вращения 20000 об/мин, со стерильными круглодонными центрифужными пробирками из упрочненного стекла вместимостью 200 см3 или металлическими контейнерами соответствующей емкости.
6.4 Мешалка для пробирок, например, вортекс.
6.5 Прибор для подсчета колоний, указанный в ISO 7218.
6.6 Лупа с увеличением от x8 до x10.
6.7 Водяные бани, способные поддерживать температуру 44 — 47 °C, 45 °C +/- 1 °C, 50 °C +/- 1 °C и работать в режиме кипения.
6.8 Прибор для измерения pH, способный обеспечивать измерения с точностью до +/- 0,1 ед. pH при температуре 25 °C +/- 1 °C (см. ISO 7218).
6.9 Флаконы для разведения вместимостью 50 — 250 см3 или пробирки для испытаний диаметром и длиной 18 x 180 мм, с подходящими уплотнительными колпачками или пробками из резины или синтетического материала.
6.10 Колбы или флаконы с резиновыми пробками или крышками вместимостью 150 — 250 см3.
6.11 Пробирки для испытаний с резиновыми пробками или крышками вместимостью 20 см3 для питательной среды.
6.12 Градуированные пипетки для бактериологического использования, стерилизованные, с одной меткой (выдувные), с широкими отверстиями, номинальной вместимости (1 +/- 0,02) см3 и (10 +/- 0,2) см3 (см. ISO 6887-1).
6.13 Чашки Петри из прозрачного бесцветного стекла или пластика диаметром 90 — 140 мм, с внутренней глубиной не менее 10 мм. Дно не должно иметь неровностей, которые могли бы помешать подсчету колоний.
6.14 Палочка стеклянная или металлическая, стерилизованная.
В лабораторию должна быть доставлена представительная проба. Во время транспортирования и хранения не допускаются какое-либо ее изменение или порча.
Отбор проб не является частью метода, установленного в настоящем стандарте. Рекомендуемый метод отбора проб приведен в [1].
8 Подготовка пробы для испытания
Пробу для испытания готовят согласно ISO 8261.
Перед открытием упаковки с йогуртом необходимо соблюдение следующих мер предосторожности. Очищают внешнюю поверхность, окружающую ту область, из которой будет взята проба, с целью удаления любого вещества, которое может загрязнить пробу. Этот участок протирают 70% этанолом (5.5) с целью предотвращения дальнейшего загрязнения. Контейнер открывают в асептических условиях.
9.1 Приготовление навески
9.1.1 Общие положения
Общие требования приведены в ISO 8261|IDF 122.
9.1.2 Йогурты без фруктовых наполнителей
Тщательно перемешивают содержимое упаковки с йогуртом, используя стерильную палочку (6.14). Взвешивают (10 +/- 0,1) г исследуемого образца в соответствующий контейнер [например, в круглодонную центрифужную пробирку из упрочненного стекла вместимостью 200 см3, или в чашу роторного смесителя, или в пластиковый контейнер перистальтического смесителя (6.3)].
9.1.3 Йогурты с фруктовыми наполнителями
Перемешивают содержимое упаковки с йогуртом в течение 1 мин., используя смеситель (6.3). Отвешивают (10 +/- 0,1) г исследуемого образца в соответствующий контейнер согласно 9.1.2.
9.2 Микроскопическое исследование
Проводят микроскопическое исследование нескольких полей препарата, приготовленного из исследуемого образца (раздел 8) и предварительно окрашенного метиленовым синим (5.4), с целью определения количества двух видов бактерий (кокков и палочек) и выбора необходимого диапазона разведений, который будет использован для посева каждого вида бактерий.
9.3 Приготовление первого разведения
Операции, описанные в 9.3 - 9.6.4, не проводят под прямым солнечным светом.
К навеске (9.1.1 или 9.1.2) добавляют разбавитель (5.1) до получения массы навески и разбавителя 50 г. Перемешивают в течение 1 мин. на смесителе (6.3). Разводят до 100 г разбавителем до получения степени разведения 10-1.
9.4 Приготовление десятикратных разведений
9.5 Длительность процедуры
9.6 Инокуляция и инкубация
9.6.1 Стерильной пипеткой (6.12) переносят по 1 см3 каждого разведения в чашки Петри (6.13) отдельно для определения L. delbrueckii subsp. bulgaricus и S. thermophillus (по две чашки Петри на каждое испытание).
9.6.2 Чашки Петри (6.13) с инокулятом для определения L. delbrueckii subsp. bulgaricus заливают 15 см3 подкисленной среды MRS (5.2.1), выдержанной на водяной бане (6.7) при температуре 45 °C.
9.6.3 Чашки Петри (6.13) с инокулятом для определения S. thermophillus заливают 15 см3 среды M17 (5.2.2), нагретой на водяной бане (6.7) при температуре 44 — 47 °C.
9.6.4 Тщательно перемешивают инокулят со средой, вращая чашки Петри (9.6.2 или 9.6.3). Дают смеси затвердеть, оставив чашки Петри на горизонтальной холодной поверхности.
9.6.5 Инкубируют подготовленные чашки в перевернутом положении. Складывают не более шести в высоту. Стопки чашек должны быть отделены друг от друга, от стенок и от верха инкубатора (6.1).
9.6.6 Инкубируют чашки, которые будут использованы для подсчета L. delbrueckii subsp. bulgaricus, в камере для анаэробной инкубации или анаэростате (6.2) в инкубаторе (6.1), установленном на температуру 37 °C, в течение 72 ч.
9.6.7 Инкубируют чашки, которые будут использованы для подсчета S. thermophillus, в инкубаторе (6.1), установленном на температуру 37 °C, в течение 48 ч.
9.7 Подсчет колоний
9.7.1 После определенного периода инкубации (9.6.6 и 9.6.7) подсчитывают количество колоний со свойствами, характерными для каждого микроорганизма [Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (3.2) и Streptococcus thermophillus (3.3)] в чашках с 15 — 300 колониями (см. приложение A).
Примечание — В случае проблем с подсчетом L. delbrueckii subsp. bulgaricus при использовании среды MRS можно использовать среду LBA, разработанную в NIZO <1>; см. также приложение A.
<1> NIZO Food Research, Kernhemseweg 2, Postbus 20 6710 BA, Ede, The Netherlands (Нидерланды). 1 нм = 10 A. Эта информация дается для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой этого продукта.
9.7.2 Чашки исследуют при приглушенном свете. Для упрощения подсчета можно использовать соответствующее оборудование для подсчета колоний (6.5). Соблюдают осторожность, чтобы не принять частицы нерастворенного образца или осажденного вещества за обнаруженные колонии. Внимательно исследуют сомнительные объекты, используя линзы (6.6) с бо́льшим увеличением, с целью различения колоний и постороннего вещества.
9.8 Подтверждение
Для подсчета выбирают такое количество колоний, чтобы их число равнялось квадратному корню общего количества колоний. Окрашивают колонии по методу Грама и подтверждают, что палочки не образуют спор, являются грамположительными и каталазонегативными (в случае исследования колоний, выросших на MRS), грамположительными и каталазонегативными цепочками кокков или диплококков (в случае исследования колоний, выросших на M17) (см. ISO 7218).
Подлинность сомнительных штаммов можно проверить согласно [10].
10 Расчет и выражение результатов
10.1 Расчет
10.1.1 Для подсчета используют чашки, на которых выросло от 15 до 300 колоний, описанных в 9.7.1 или 9.7.2.
10.1.2 Рассчитывают количество каждого характерного микроорганизма в исследуемом образце по следующей формуле:
N = \frac{\Sigma\text{С}}{(n_{1} + 0,1n_{2})d} ,
где N — количество характерных микроорганизмов на грамм исследуемой пробы;
\Sigma\text{С} — общее количество колоний во всех чашках (10.1.1);
n1 — количество чашек, подсчитанных в первом разведении;
n2 — количество чашек, подсчитанных во втором разведении;
d — масса неразведенного исследуемого образца в чашке в первом разведении, г.
Пример - Коэффициент разведения 10-2 означает, что в чашку помещено 10-2 г или 10-2 мл неразведенного исследуемого образца (в разведенном состоянии).
Примечание - Первое разведение представляет собой разведение с бо́льшим содержанием исследуемого образца.
В случае трех разведений рассчитывают количество каждого характерного микроорганизма в каждом исследуемом образце по следующей формуле:
N = \frac{\Sigma\text{С}}{(n_{1} + 0,1n_{2} + 0,01n_{3})d} ,
где n3 — количество чашек, подсчитанных в третьем разведении.
10.2 Выражение результатов
10.2.1 Округляют результаты, полученные по 10.1.2, до двух значащих цифр. Что касается трехзначного числа, третью цифру (если она не равна 5) округляют с точностью до нуля. Если третья цифра равняется 5, то число округляют в меньшую сторону, если вторая цифра четная, и в бо́льшую сторону, если вторая цифра нечетная.
Пример — Округление 234 до 230;
10.2.2 Если все результаты подсчета меньше 10, количество микроорганизмов на грамм отражают как «менее 10 x 1/d» (d — значение, соответствующее наименьшему разведению).
10.2.3 Если все результаты подсчета больше 300, рассчитывают теоретическое количество в чашках с количеством микроорганизмов около 300 колоний и умножают на величину, обратную величине, соответствующей наивысшему разведению. Результаты представляют как «теоретическое минимальное количество микроорганизмов на грамм».
10.2.4 Результат должен быть выражен как число от 1,0 до 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени.
10.2.5 Общее количество характерных микроорганизмов № на грамм образца равняется:
где NL — количество L. delbrueckii subsp. bulgaricus на грамм, рассчитанное по 10.1.2;
NS — количество S. thermophillus на грамм, рассчитанное по 10.1.2.
10.3 Примеры расчетов
10.3.1 L. delbrueckii subsp. bulgaricus
Предположим, что получены следующие результаты для L. delbrueckii subsp. bulgaricus (инкубировали две чашки Петри на разведение):
N = \frac{\Sigma\text{С}}{(n_{1} + 0,1n_{2})d} = \frac{295 + 245 + 33 + 40}{(2 + 0,1 \cdot 2)10^{- 5}} = \frac{613}{2,2 \cdot 10^{- 5}} = 278,6 \cdot 10^{5} .
Согласно 10.2.1 количество равняется 280·105 на грамм. Теоретическое количество L. delbrueckii subsp. bulgaricus, выраженное согласно 10.2.4, составляет 2,8·107 на грамм.
Аналогичным образом теоретическое количество S. thermophillus на грамм йогурта составило 4,9·108.
Таким образом, количество характерных микроорганизмов составляет:
N = (2,8·107) + (4,9·108) = 5,18·108 на грамм,
в результате округления согласно 10.2.4 получается:
11.1 Общие положения
Учитывая пуассоновское распределение микроорганизмов в субстрате, доверительные интервалы этого метода варьируются в зависимости от количества колоний от +/- 16 до +/- 52%. На практике могут наблюдаться даже бо́льшие вариации. В различных совместных исследованиях согласно IDF 135 стандартное отклонение повторяемости (sr) составило 0,20 логарифмической единицы, а стандартное отклонение воспроизводимости (sR) — 0,35 логарифмической единицы по [2] и [3].
В ISO 7218 приведена более подробная информация о доверительных интервалах расчета низких значений микроорганизмов.
Примечание - IDF 135 основан на ISO 5725.
11.2 Повторяемость
Как показывает опыт, если наибольшее значение двух независимых испытаний одной пробы превышает наименьшее значение на 30%, необходимо пересмотреть методики с целью обнаружения источника погрешностей.
Протокол испытаний должен содержать следующие данные:
a) всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
b) метод отбора проб, если он известен;
c) применяемый метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
d) все операции, не оговоренные в настоящем стандарте или рассматриваемые как дополнительные, а также детали любых инцидентов, которые могли повлиять на результат(ы) испытания;
e) результат(ы) испытания или, если проводилась проверка повторяемости, то окончательный полученный результат.
Ни одна из двух рекомендованных питательных сред (окисленная MRS и M17) не является полностью селективной.
Большинство штаммов S. thermophillus не образует видимых колоний в окисленной среде MRS в разведениях, которые обычно используются для подсчета L. delbrueckii subsp. bulgaricus. Но когда количество молочнокислых бактерий в образце йогурта существенно ниже количества стрептококков, для подсчета L. delbrueckii subsp. bulgaricus следует использовать слабые разведения.
В этих условиях некоторые S. thermophillus могут образовывать незначительные или мелкие колонии в окисленной среде MRS. Эти колонии можно легко отличить невооруженным глазом от колоний L. delbrueckii subsp. bulgaricus (последние большего размера) и дополнительно проверить под микроскопом. В дополнение некоторые штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus проявляют слабый рост или не проявляют его вообще в MRS, и иногда их трудно отличить от S. thermophillus.
Если штаммы S. thermophillus растут медленно или не способны к росту, рекомендуется использование следующих условий:
- более высокая температура инкубации (39 — 42 °C и 45 °C в течение 24 ч в аэробных условиях);
- снижение содержания \beta - \text{глицерофосфата} ;
- изменение pH;
- особая осторожность при перемешивании.
Если штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus растут медленно или не способны к росту, рекомендуется использование следующих условий:
- инкубация в течение более 3 дней до 5 или 6 дней;
- более высокая температура инкубации (40 — 42 °C и 45 °C в течение 48 ч в анаэробных условиях);
- изменение pH;
- особая осторожность при перемешивании;
- газовая среда (насыщение CO2, только CO2 и т.д.).
L. delbrueckii subsp. bulgaricus при культивировании в анаэробных условиях в йогурте невозможно подсчитать в MRS. Этой проблемы не возникает при использовании среды LBA (см. примечание к 9.7.1) в анаэробных условиях при температуре 50 °C +/- 0,5 °C в течение 72 ч.
С другой стороны, большинство штаммов L. delbrueckii subsp. bulgaricus не образует видимых колоний в среде M17 в разведениях, которые обычно используются для подсчета S. thermophillus. Это подтверждает ранее полученные результаты (см. [9]).
Однако некоторые штаммы L. delbrueckii subsp. bulgaricus могут образовывать мелкие колонии в среде M17, особенно если речь идет об образцах йогурта с большим количеством молочнокислых бактерий, по сравнению с количеством стрептококков. Эти небольшие неравномерные колонии обычно имеют хлопьевидный или ворсистый внешний вид. Их легко можно отличить невооруженным глазом (или при помощи увеличительных стекол), дополнительно проверив под микроскопом, от равномерных чечевицеобразных колоний S. thermophillus, которые больше по размеру.
Выбор питательной среды, приготовление образца, методики инкубации и подсчета являются наиболее важными составляющими количественного анализа. После ознакомления технических специалистов с методами сразу же повышается точность.
Кроме того, нет ни одного исследуемого штамма, который можно было бы использовать для проверки селективности штаммов, так как штаммов, используемых в йогуртах, бесчисленное множество, которые отличаются от используемых при испытаниях, поэтому некоторые штаммы определенных видов (например, S. thermophillus) могут расти даже в средах, селективных к другим видам (например, L. delbrueckii subsp. bulgaricus).
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение ссылочного международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование межгосударственного стандарта |
| ISO 68871:1999 | - | <*> |
| ISO 7218:2007 | IDT | ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям» |
| ISO 8261:2001/IDF 122:2001 | - | <*> |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его утверждения рекомендуется использовать перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандартов: IDT — идентичный стандарт. | ||