ГОСТ ISO 21149-2013. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Подсчет и обнаружение мезофильных аэробных микроорганизмов

(введен в действие Приказом Росстандарта от 10.06.2016 № 613-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ ISO 21149-2013"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-iso-21149-2013" "ГОСТ ISO 21149-2013. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Подсчет и обнаружение мезофильных аэробных микроорганизмов (введен в действие П"
  n1["ГОСТ ISO 21149-2020"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-iso-21149-2020" "ГОСТ ISO 21149-2020. Межгосударственный стандарт. Продукция парфюмерно-косметическая. Микробиология. Подсчет и обнаружение мезофильных аэробных бактерий (введен в действие Приказом"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 июня 2016 г. № 613-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКАЯ. МИКРОБИОЛОГИЯ

ПОДСЧЕТ И ОБНАРУЖЕНИЕ МЕЗОФИЛЬНЫХ АЭРОБНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

Perfume and cosmetic products. Microbiology. Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria

(ISO 21149:2006, Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria, IDT)

ГОСТ ISO 21149-2013

МКС 07.100.99

71.100.70

Дата введения 1 июля 2017 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе перевода на русский язык англоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 7 июня 2013 г. № 43)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 10 июня 2016 г. № 613-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 21149-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 21149:2006 «Косметика. Микробиология. Подсчет и обнаружение мезофильных аэробных микроорганизмов» (Cosmetics — Microbiology — Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria, IDT).

Международный стандарт ISO 21149:2006 разработан Техническим комитетом ISO/TC 217 «Косметика» Международной организации по стандартизации (ISO).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1. Область применения

Настоящий стандарт устанавливает общие требования к методу обнаружения и подсчету мезофильных аэробных микроорганизмов, присутствующих в парфюмерно-косметической продукции, путем подсчета колоний на агаризованной среде после инкубации в аэробных условиях или путем проверки отсутствия бактериального роста после обогащения.

Из-за большого разнообразия парфюмерно-косметической продукции в рассматриваемой области применения отдельные детали данного метода могут быть непригодными для некоторых видов продукции (например, для нерастворимой в воде продукции). Другие методы (например, автоматизированные) могут заменить метод, представленный в настоящем стандарте, при условии, что продемонстрирована их равнозначность или что альтернативный метод валидирован иным образом.

Если необходимо, подсчитанные и обнаруженные микроорганизмы могут быть идентифицированы с помощью соответствующих идентификационных методов, описанных в стандартах, приведенных в библиографии.

Чтобы обеспечить качество и безопасность продукции для потребителя, рекомендуется проводить соответствующий анализ микробиологического риска с целью определения типов парфюмерно-косметической продукции, к которой применим настоящий стандарт. К продукции с низкой степенью микробиологического риска относится продукция с низкой водной активностью, продукция на спиртовой основе, продукция с крайними значениями pH и т.д.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на межгосударственные стандарты, которые являются обязательными. Для датированных ссылок применяют только указанное издание, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения):

ISO 21148:2005 Косметика. Микробиология. Общие указания по микробиологическому контролю

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 мезофильные аэробные микроорганизмы (aerobic mesophilic bacteria): Мезофильные микроорганизмы, способные к росту в аэробных условиях, установленных в настоящем стандарте.

Примечание - В указанных условиях могут быть обнаружены другие типы микроорганизмов (например, дрожжи, плесень).

3.2 продукция (product): Часть идентифицированной парфюмерно-косметической продукции, полученная лабораторией для испытания (анализа).

3.3 проба (sample): Часть продукции в количестве не менее 1 г или 1 см3, которая используется при проведении испытаний для приготовления исходной суспензии.

3.4 исходная суспензия (initial suspension): Суспензия (или раствор) пробы в определенном объеме соответствующей жидкости (разбавитель, нейтрализатор, бульон или их сочетания).

3.5 разведение пробы (sample dilution): Разведение исходной суспензии.

4. Сущность метода

4.1. Общие положения

Данный метод касается подсчета колоний на неселективной агаризованной среде или определения наличия или отсутствия бактериального роста после обогащения. Вероятное ингибирование микробного роста пробой должно быть нейтрализовано, чтобы можно было обнаружить все жизнеспособные микроорганизмы [1]. Во всех случаях и независимо от применяемой методики нейтрализация антимикробных свойств продукции должна быть проверена и валидирована [2] - [4].

4.2. Подсчет микроорганизмов чашечным методом

Подсчет микроорганизмов чашечным методом состоит из следующих стадий:

• подготовка чашек Петри для культивирования определенного объема исходной суспензии или разведений пробы в соответствующей питательной среде;
• инкубация чашек Петри в аэробных условиях при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение (72 +/- 6) ч;
• подсчет числа колониеобразующих единиц (colony forming units) (КОЕ) и расчет количества мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм продукции.

4.3. Мембранная фильтрация

Мембранная фильтрация состоит из следующих стадий:

• внесение соответствующего количества пробы, установленного путем валидации, в фильтровальный аппарат, смоченный небольшим количеством соответствующего стерильного разбавителя, немедленное фильтрование и промывка в соответствии с валидированной методикой (см. 13.3.4). Затем мембранный фильтр переносится на поверхность определенной агаризованной среды согласно ISO 21148;
• инкубация мембранных фильтров в аэробных условиях при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение (72 +/- 6) ч;
• подсчет числа колониеобразующих единиц (КОЕ) и расчет количества мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм продукции.

4.4. Обнаружение бактерий с предварительным обогащением

Обнаружение бактерий с предварительным обогащением состоит из следующих стадий:

• инкубация при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение не менее 20 ч определенного количества исходной суспензии в неселективной жидкой среде, содержащей соответствующие нейтрализаторы и/или диспергирующие агенты;
• перенос определенного количества обогащенной суспензии на неселективную агаризованную среду;
• инкубация в аэробных условиях при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 48 — 72 ч;
• учет выросших колоний и выражение результатов как «присутствие/отсутствие» мезофильных аэробных микроорганизмов в определенной навеске S пробы продукции.

5. Разбавители, нейтрализаторы и питательные среды

5.1. Общие положения

Общие требования приведены в ISO 21148. Если в настоящем стандарте упоминается вода, то это означает, что применяют дистиллированную или очищенную воду, как установлено в ISO 21148.

Следующие разбавители, нейтрализаторы и питательные среды пригодны для обнаружения и подсчета мезофильных аэробных микроорганизмов. Допускается использовать другие разбавители, нейтрализаторы и питательные среды, если была продемонстрирована их пригодность.

5.2. Разбавители и нейтрализующие разбавители

5.2.1 Общие положения

Разбавитель используется для диспергирования пробы. Он может содержать нейтрализаторы, если тестируемая проба обладает антимикробными свойствами. Эффективность нейтрализации должна быть доказана перед подсчетом количества микроорганизмов (см. раздел 13). Информация относительно применяемых нейтрализаторов приведена в приложении D.

5.2.2 Нейтрализующие разбавители

5.2.2.1 Жидкая среда с гидролизатом казеина, соевым лецитином и полисорбатом 20 (SCDLP 20 бульон)

5.2.2.1.1 Состав

• панкреатический гидролизат казеина — 20,0 г;
• соевый лецитин — 5,0 г;
• полисорбат 20 — 40,0 см3;
• вода — 960,0 см3.

5.2.2.1.2 Приготовление

Растворяют полисорбат 20 в 960 см3 воды, помешивая при нагревании, на водяной бане при температуре (49 +/- 2) °C. Добавляют панкреатический гидролизат казеина и соевый лецитин. Нагревают приблизительно 30 мин до полного растворения. Перемешивают и разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,3 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.2.2.2 Прочие нейтрализирующие агенты

При необходимости могут использоваться другие нейтрализующие агенты (см. приложения A и D).

5.2.3 Разбавитель

5.2.3.1 Жидкость А

5.2.3.1.1 Состав

• пептический гидролизат животной ткани — 1,0 г;
• вода — 1000 см3.

5.2.3.1.2 Приготовление

Растворяют 1 г пептона в 1 дм3 воды. Нагревают при интенсивном перемешивании. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH раствора должен быть равен 7,1 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.2.3.2 Другие разбавители

Могут использоваться другие подходящие нейтрализаторы (см. приложение B).

5.3. Разбавитель для бактериальной суспензии (раствор хлорида натрия с триптоном)

5.3.1 Состав

• триптон, панкреатический гидролизат казеина — 1,0 г;
• хлорид натрия — 8,5 г;
• вода — 1000 см3.

5.3.2 Приготовление

Растворяют компоненты в воде, помешивая при нагревании. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH раствора должен быть равен 7,0 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.4. Питательные среды

5.4.1 Общие положения

Питательные среды могут быть приготовлены способом, описанным ниже, или из готовых сухих питательных сред согласно инструкциям изготовителя. Готовые к использованию среды могут применяться, если их состав и/или ростовые свойства соответствуют требованиям настоящего стандарта.

5.4.2 Питательные среды для подсчета микроорганизмов

5.4.2.1 Состав

• панкреатический гидролизат казеина — 15,0 г;
• папаический гидролизат соевой муки — 5,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• агар — 15,0 г;
• вода — 1000 см3.

5.4.2.1.1 Приготовление

Растворяют компоненты или готовую сухую питательную среду в воде, помешивая при нагревании. Разливают в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,3 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.4.2.2 Другие среды для подсчета микроорганизмов

Могут использоваться другие подходящие среды (см. приложение C).

5.4.3 Питательные среды для обнаружения микроорганизмов

5.4.3.1 Общие положения

Для обнаружения микроорганизмов могут быть использованы агаризованная среда или бульон для обогащения.

Бульон для обогащения используется для диспергирования пробы и увеличения исходной концентрации микроорганизмов. Он может содержать нейтрализаторы, если проба, подлежащая испытанию, обладает антимикробными свойствами.

5.4.3.2 Бульон для обогащения: бульон Eugon LT 100

5.4.3.2.1 Общие положения

Данная среда содержит ингредиенты: лецитин и полисорбат 80, которые нейтрализуют ингибиторы, присутствующие в пробе, а также диспергирующий агент — октоксинол 9.

5.4.3.2.2 Состав

• панкреатический гидролизат казеина — 15,0 г;
• папаический гидролизат соевой муки — 5,0 г;
• L-цистин — 0,7 г;
• хлорид натрия — 4,0 г;
• сульфит натрия — 0,2 г;
• глюкоза — 5,5 г;
• яичный лецитин — 1,0 г;
• полисорбат 80 — 5,0 г;
• октоксинол 9 — 1,0 г;
• вода — 1000 см3.

5.4.3.2.3 Приготовление

Растворяют последовательно полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин в кипящей воде до их полного растворения. Растворяют остальные компоненты в воде, перемешивая их при нагревании. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,0 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.4.3.3 Агаризованная среда для обнаружения микроорганизмов

5.4.3.3.1 Агаризованная среда Eugon LT 100

5.4.3.3.1.1 Состав

• панкреатический гидролизат казеина — 15,0 г;
• папаический гидролизат соевой муки — 5,0 г;
• L-цистин — 0,7 г;
• хлорид натрия — 4,0 г;
• сульфит натрия — 0,2 г;
• глюкоза — 5,5 г;
• яичный лецитин — 1,0 г;
• полисорбат 80 — 5,0 г;
• октоксинол 9 — 1,0 г;
• агар — 15,0 г;
• вода — 1000 см3.

5.4.3.3.1.2 Приготовление

Растворяют последовательно полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин в кипящей воде до полного их растворения. Растворяют остальные компоненты, перемешивая их при нагревании. Перемешивают осторожно во избежание пенообразования. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,0 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

5.4.3.3.2 Прочие агаризованные среды для обнаружения микроорганизмов

Могут использоваться другие подходящие среды (см. приложение C).

5.4.4 Агаризованная среда для культивирования эталонных штаммов

Используют агаризованную среду с соево-казеиновым гидролизатом (SCDA) или триптон-соевый агар (TSA) (5.4.2.1).

6. Инструменты и стеклянная лабораторная посуда

Лабораторное оборудование, инструменты и стеклянная посуда должны соответствовать ISO 21148.

7. Штаммы микроорганизмов

Для определения эффективности нейтрализаторов используют штаммы типичных представителей грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов [2], [5]:

• Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (эквивалентный штамм: CIP 82.118, или NCIMB 8626, или NBRC 13275, или KCTC 2513, или другой эквивалентный штамм из национальной коллекции);
• Staphylococcus aureus ATCC <1> 6538 (эквивалентный штамм: CIP <2> 4.83, или NCIMB <3> 9518, или NBRC <4> 13276, или KCTC <5> 1916, или другой эквивалентный штамм из национальной коллекции).

<1> ATCC — American Type Culture Collection (Американская коллекция типовых культур (микроорганизмов).

<2> CIP — Institut Pasteur Collection (Коллекция института Пастера).

<3> NCIMB — National Collection of Industrial and Marine Bacteria (Национальная коллекция промышленных и морских бактерий).

<4> NBRC — National Biological Resource center (Национальный центр биологических исследований).

<5> KCTC — Korean Collection for type culture (Корейская коллекция типовых культур).

В качестве альтернативного грамотрицательного штамма могут использоваться: Escherichia coli ATCC 8739 (эквивалентный штамм: CIP 53.126, или NCIMB 8545, или NBRC 3972, или KCTC 2571, или другой эквивалентный штамм из национальной коллекции).

Культура должна быть восстановлена согласно методикам, предусмотренным поставщиком штаммов.

Штаммы могут храниться в лаборатории в соответствии с [13].

8. Обращение с парфюмерно-косметической продукцией и лабораторными пробами

При необходимости продукцию, подлежащую испытаниям, хранят при комнатной температуре. Не следует выдерживать в термостате, охлаждать и замораживать продукцию (3.2) и пробы (3.3) ни до, ни после анализа.

Отбор проб парфюмерно-косметической продукции, подлежащей анализу, должен осуществляться согласно методике, приведенной в ISO 21148. Анализируют пробы в соответствии с ISO 21148 и нижеследующей методикой.

9. Методика

9.1. Общие рекомендации

Для подготовки пробы, приготовления исходной суспензии и разведений используют стерильные материалы, оборудование и асептические методы. В случае приготовления исходной суспензии в подходящем разбавителе время между окончанием приготовления суспензии и моментом ее внесения в бульон для обогащения не должно превышать 45 мин, если иное не оговорено в соответствующих протоколах или документах.

9.2. Приготовление исходной суспензии

9.2.1 Общие положения

Исходную суспензию готовят из навески пробы (3.3) в количестве не менее 1 г или 1 см3 хорошо перемешанной анализируемой продукции (3.2).

Отмечают S, точную массу или точный объем пробы.

Исходная суспензия обычно представляет собой разведение 1:10. Могут потребоваться большие объемы разбавителя или бульона для обогащения, если предполагают высокие уровни контаминации продукции и/или антимикробные свойства все еще присутствуют в разведении 1:10.

9.2.2 Водорастворимая продукция

Переносят навеску S пробы продукции в соответствующий объем (например, 9 см3) нейтрализирующего разбавителя (5.2.2), или разбавителя (5.2.3), или бульона для обогащения (5.4.3.2) в зависимости от используемого метода (9.3 или 9.4).

Регистрируют степень разведения d.

9.2.3 Нерастворимая в воде продукция

Переносят навеску S пробы продукции в подходящую посуду, содержащую определенное количество солюбилизирующего компонента (например, полисорбат 80). Диспергируют пробу и добавляют соответствующий объем (например, 9 см3) нейтрализирующего разбавителя (5.2.2), или разбавителя (5.2.3), или бульона для обогащения (5.4.3.2) в зависимости от используемого метода (9.3 или 9.4).

Регистрируют степень разведения d.

9.3. Методы подсчета

9.3.1 Разведения для методов подсчета

Обычно исходная суспензия является первым разведением (10-1). При необходимости готовят дополнительный ряд десятикратных разведений (1:10) из исходной суспензии, используя тот же разбавитель (согласно ожидаемому уровню контаминации продукции).

Как правило, подсчет проводят, используя не менее двух параллельных чашек Петри. Но можно использовать и одну чашку Петри в случае использования общепринятой практики испытаний или если подсчет проводят на последовательных разведениях одной и той же пробы или в соответствии с ранее полученными результатами.

9.3.2 Чашечные методы

9.3.2.1 Метод с использованием глубинного посева

В чашки Петри диаметром 85 — 100 мм вносят 1 см3 исходной суспензии и/или ее разведения, приготовленного соответствующим образом (см. раздел 13), и заливают 15 — 20 см3 расплавленной агаризованной среды (5.4.2), которая поддерживалась в таком состоянии на водяной бане при температуре не более чем 48 °C. Если используются чашки Петри большего диаметра, соответственно увеличивается количество агаризованной среды на чашку.

Перемешивают исходную суспензию и/или ее разведение со средой, осторожно вращая чашки круговыми движениями для полного распределения пробы. Дают среде в чашках Петри застыть на горизонтальной поверхности при комнатной температуре.

9.3.2.2 Метод с использованием поверхностного посева

В чашки Петри диаметром 85 — 100 мм заливают по 15 — 20 см3 расплавленной агаризованной среды (5.4.2), которая поддерживалась в таком состоянии на водяной бане при температуре не более чем 48 °C. Если применяются чашки Петри большего диаметра, соответственно увеличивается количество агаризованной среды на чашку. Дают среде застыть, например в ламинарном шкафу или в термостате. Шпателем распределяют по поверхности среды не менее 0,1 см3 исходной суспензии и/или ее разведения, приготовленного соответствующим образом (см. раздел 13).

9.3.2.3 Метод мембранной фильтрации

Используют мембранные фильтры с размером пор не более 0,45 мкм.

Переносят соответствующее количество исходной суспензии или ее разведения, приготовленного соответствующим образом (предпочтительно не менее 1 г или 1 см3 продукции) на мембранный фильтр. Фильтруют сразу же и промывают мембранный фильтр (следуя методике, разработанной в процессе валидации, см. раздел 13).

Переносят мембранный фильтр на поверхность агаризованной среды (5.4.2).

9.3.2.4 Инкубация

Если не оговорено иное, переворачивают инокулированные чашки вверх дном и помещают их в термостат, поддерживающий температуру (32,5 +/- 2,5) °C, на (72 +/- 6) ч. После термостатирования, если это возможно, посевы сразу же исследуют. В противном случае их следует хранить в холодильнике не более 24 ч.

Примечание - В некоторых случаях, если существует вероятность того, что частицы продукции будут приняты за колонии, целесообразно приготовить дублирующие чашки, содержащие те же разведения пробы и агаризованную среду, которые хранят в холодильнике для сравнения с инкубированными чашками.

9.4. Обогащение

9.4.1 Общие положения

Исходную суспензию готовят (см. 9.2) в бульоне для обогащения (5.4.3.2), выбранном согласно методике, разработанной во время валидации (см. раздел 13).

9.4.2 Инкубация пробы

9.4.2.1 Общие положения

Инкубируют исходную суспензию, приготовленную в бульоне (5.4.3.2), при температуре (32,5 +/- 2,5) °C не менее 20 ч.

9.4.2.2 Субкультура

С помощью стерильной пипетки переносят 0,1 — 0,5 см3 инокулированной суспензии на поверхность чашки Петри (диаметром 85 — 100 мм), содержащей приблизительно 15 — 20 см3 соответствующей агаризованной среды (5.4.2.1). Если используются большие чашки Петри, соответственно объем среды на чашку возрастает.

9.4.2.3 Инкубация субкультуры

Не переворачивают инокулированную чашку Петри до тех пор, пока агаризованная среда в ней не застынет, затем субкультуру инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 48 — 72 ч.

10. Подсчет колоний (чашечным методом и методом мембранной фильтрации)

После инкубации подсчитывают колонии:

• на чашках Петри, содержащих от 30 до 300 колоний; при подсчете менее чем 30 колоний см. 12.2.3;
• на мембранных фильтрах, содержащих от 15 до 150 колоний; при подсчете менее чем 15 колоний см. 12.2.3.

11. Обнаружение роста (с использованием обогащения)

После инкубирования субкультуры проверяют поверхность агара и регистрируют присутствие или отсутствие роста.

12. Обработка результатов

12.1. Определение количества микроорганизмов при посеве чашечным методом

Вычисляют число № микроорганизмов, присутствующих в пробе S, используя:

m — среднеарифметическое округленное число колоний из двух чашек Петри по формуле (1);

c — число колоний, подсчитанных на одной чашке по формуле (2), или

\overline{x_{c}} — среднее взвешенное число колоний, полученное из двух последовательных разведений по формуле (3):

N = m/(V·d), (1)

N = c/(V·d), (2)

N = \overline{x_{c}}(V \cdot d), (3)

где m — среднеарифметическое число колоний, полученное из двух чашек Петри;

V — объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см3;

d — коэффициент разведения, соответствующий разведению при приготовлении исходной суспензии (9.2) или при первом подсчитанном разведении;

c — число колоний, подсчитанных на одной чашке;

\overline{x_{c}} — среднее число колоний, полученное из двух последовательных разведений и вычисленное следующим образом:

\overline{x_{c}} = \frac{\sum c}{n_{1} + 0,1n_{2}} , (4)

где \sum c — сумма колоний, подсчитанных на всех чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений;

n1 — количество чашек, использованное для подсчета количества микроорганизмов в исходной суспензии (или в первом из подсчитанных разведений);

n2 — количество чашек, на которых подсчитано количество микроорганизмов для 10-1 разведения исходной суспензии (или для второго подсчитанного разведения).

Округляют вычисленный результат до двух значащих цифр. При этом, если последняя цифра менее 5, предшествующая цифра не изменяется; если последняя цифра 5 или более, предшествующую цифру увеличивают на единицу. Продолжают поэтапно до тех пор, пока две значащие цифры не будут получены. Отмечают полученное число N.

12.2. Интерпретация результатов

12.2.1 Принимают во внимание изменчивость, которая свойственна чашечным методам подсчета. Два результата должны рассматриваться как различные только тогда, когда разность превышает 50% или когда эта разность, выраженная логарифмически, более 0,3.

Для более точного подсчета учитывают только чашки, на которых содержится от 30 до 300 колоний, и мембранные фильтры, содержащие от 15 до 150 колоний. Проверяют, чтобы подсчеты были получены из разведений, подтвержденных путем валидации выбранного метода (см. раздел 13).

12.2.2 Если число КОЕ более 30 и менее чем 300 на чашках или более чем 15 и менее чем 150 на мембранных фильтрах, где S — масса или объем пробы (9.2), результат выражают следующим образом:

• если S не менее 1 г или 1 см3, а V не менее 1 см3: количество мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы = N/S;
• если S менее 1 г или 1 см3 и/или V менее 1 см3: количество мезофильных аэробных микроорганизмов в пробе (отмечают тестируемое количество пробы, принимая во внимание S и V) = N.

Выражают результат как число между 1,0 и 9,9, умноженное на соответствующую степень 10 (см. примеры 1, 2, 3, 7).

12.2.3 Если КОЕ менее 30 на чашках или менее 15 на мембранных фильтрах, выражают результат следующим образом:

• если S не менее 1 г или 1 см3 и/или V не менее 1 см3: количество мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы = N/S;
• если S менее 1 г или 1 см3 и/или V менее 1 см3: количество мезофильных аэробных микроорганизмов в пробе = N,

где S масса или объем пробы (9.2). Выражают результат как число между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени (см. примеры 4 - 6).

12.2.4 Если на чашках отсутствует рост, результат выражают следующим образом:

• менее чем 1/d·V·S мезофильных аэробных микроорганизмов на грамм или кубический сантиметр продукции (S не менее 1 г или 1 см3);
• менее чем 1/d·V мезофильных аэробных микроорганизмов в пробе S (отмечают исследуемое количество пробы, принимая во внимание S и V) (S менее 1 г или 1 см3),

где d — коэффициент разведения исходной суспензии (9.2) и V равен 1 (для метода с использованием глубинного посева и для мембранной фильтрации) или 0,1 (для метода с использованием поверхностного посева) (см. пример 8).

12.3. Примеры

12.3.1 Пример 1. Учет по двум чашкам одного разведения

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученные подсчеты: для разведения 10-1 — 38 и 42.

Для формулы (1):

N = m/(V·d) = 40/(1·10-1) = 40/0,1 = 400 или 4·102 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.2 Пример 2. Учет по одной чашке

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 60.

Для формулы (2):

N = c/(V·d) = 60/(1·10-1) = 60/0,1 = 600 или 6·102 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.3 Пример 3. Учет по двум чашкам двух последовательных разведений

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-2 — 235 и 282; для разведения 10-3 — 31 и 39.

Для формулы (3):

N = \overline{x_{c}}/(V \cdot d) = 235 + 282 + 31 + 39/1(2 + 0,1 \cdot 2) \cdot 10^{- 2} = 587/0,022 = 26682.

Округляя результат, как установлено выше, получаем 27000, или 2,7·104 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.4 Пример 4. Учет по двум мембранным фильтрам одного разведения

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 18 и 22.

Для формулы (1):

N = m/(V·d) = 20/(1·10-1) = 20/0,1 = 200 или 2·102 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.5 Пример 5. Учет по одному мембранному фильтру

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 65.

Для формулы (2):

N = c/(V·d) = 65/(1·10-1) = 65/0,1 = 650, или 6,5·102 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.6 Пример 6. Учет по двум мембранным фильтрам из двух последовательных разведений

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 121 и 105; для разведения 10-2 — 15 и 25.

Для формулы (3):

N = \overline{x_{c}}/(V \cdot d) = 121 + 105 + 15 + 25/1(2 + 0,1 \cdot 2) \cdot 10^{- 1} = 266/0,22 = 1209.

Округляя результат, как указано выше, получаем 1200, или 1,2·103 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.7 Пример 7. Учет по двум чашкам одного разведения

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 28 и 22.

Для формулы (1):

N = m/(V·d) = 25/(1·10-1) = 25/0,1 = 250.

Полученное число равно 250, или 2,5·102 мезофильных аэробных микроорганизмов на сантиметр кубический или грамм пробы.

12.3.8 Пример 8

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 0 и 0 (отсутствие роста на двух чашках).

Для формулы (1):

N <= 1/(V·d),

<= 1/(1·10-1),

<= 1/0,1,

<= 10.

Полученное число равно менее чем 10 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.3.9 Пример 9

S = 1 г или 1 см3; V = 1; полученный подсчет: для разведения 10-1 — 0 и 3.

Для формулы (1):

N <= m(V·d),

<= 1,5/(1·10-1),

<= 1,5/0,1,

<= 15.

Полученное число менее чем 15 мезофильных аэробных микроорганизмов на кубический сантиметр или грамм пробы.

12.4. Обнаружение после обогащения

В случае обнаружения роста (см. раздел 11) результат представляют как: мезофильные аэробные микроорганизмы обнаружены в навеске S пробы, и продолжают подсчет, используя один из предлагаемых методов (см. 9.3). Если рост не обнаружен (см. раздел 11), результаты представляют как: мезофильные аэробные микроорганизмы не обнаружены в навеске S пробы.

13. Нейтрализация антимикробных свойств продукции

13.1. Общие положения

Описанные ниже процедуры демонстрируют, что микроорганизмы могут расти в условиях проведения анализа.

Два штамма (см. раздел 7), используемые для подтверждения этих свойств, обычно чувствительны к антимикробным агентам.

13.2. Приготовление инокулята

Перед проведением испытаний (для каждого штамма) засевают поверхность агаризованной среды, содержащей соево-казеиновый гидролизат (SCDA), или другой соответствующей (неселективной, ненейтрализирующей) среды. Инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 18 — 24 ч. Кончиком стерильной петли отбирают часть культуры и ресуспендируют ее в разбавителе для приготовления бактериальных суспензий (5.3), чтобы получить калиброванную суспензию с количеством клеток около 1·108 КОЕ/см3 [например, количество клеток можно измерить, используя спектрофотометр, по ISO 21148 (приложение C)]. Используют данную суспензию и ее разведения в течение 2 ч.

13.3. Валидация метода глубинного посева

13.3.1 Сущность метода

Для каждого штамма смешивают нейтрализованную пробу (исходную суспензию или ее разведение в соответствии с антимикробной активностью или низкой растворимостью продукции) с разведением культуры микроорганизма. Высевают на чашку Петри или фильтруют через мембранный фильтр. После инкубирования проверяют морфологию колоний и сравнивают полученное число колоний с контрольным (без пробы).

Если количество микроорганизмов составляет менее 50% (0,3 log) от количества в контрольной пробе, модифицируют методику (используя другие разбавители, средства для нейтрализации или сочетания того и другого, см. приложение D). Необходимо принимать во внимание изменчивость, свойственную для чашечного метода подсчета. Два результата должны рассматриваться как различные, только если разность превышает 50%, или, будучи выражена логарифмически, превышает 0,3. Отсутствие роста инокулята делает испытание недействительным, если только не учитывать контаминацию продукции этим микроорганизмом как маловероятную.

13.3.2 Валидация глубинного метода посева

Смешивают 9 см3 исходной суспензии и/или ее разведения (разведений) в нейтрализирующем разбавителе (или в другом, см. 5.2) с 1 см3 суспензии микроорганизмов, содержащих от 1000 до 3000 КОЕ/см3. Переносят 1 см3 в чашку Петри (предпочтительно в две параллельные чашки) и заливают 15 — 20 см3 расплавленной агаризованной среды (5.4.2), выдержанной на водяной бане при температуре не выше чем 48 °C. Параллельно приготавливают и делают контрольный посев, используя тот же самый разбавитель и ту же самую суспензию микроорганизмов, но без пробы.

После инкубации в течение 24 — 72 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) °C подсчитывают колонии на чашках и сравнивают с результатами, полученными при испытании, и результатами контрольного испытания. Разбавитель и метод подсчета считают подходящими при разведении 1:10 (когда используется 1 см3 исходной суспензии), если количество микроорганизмов составляет не менее 50% (0,3 log) от количества микроорганизмов в контрольном посеве.

13.3.3 Валидация поверхностного метода посева

Смешивают 9 см3 исходной суспензии и/или ее разведения (разведений) в нейтрализирующем разбавителе (или в другом, см. 5.1) с 1 см3 суспензии микроорганизмов, содержащих от 10000 до 30000 КОЕ/см3 клеток (или менее, если распределяют 0,5 см3 или 1 см3). Распределяют не менее 0,1 см3 по поверхности твердой агаризованной среды (5.4.2) (предпочтительно в две параллельные чашки). Параллельно приготавливают и делают контрольный посев, используя тот же самый разбавитель и ту же самую суспензию микроорганизмов, но без пробы.

После инкубации в течение 24 — 72 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) °C подсчитывают колонии на чашках и сравнивают с результатами, полученными при испытании, и результатами контрольного испытания. Разбавитель и метод подсчета считают действительными при разведении 1:10 (когда используется 1 см3 исходной суспензии), если количество микроорганизмов составляет не менее 50% (0,3 log) от количества микроорганизмов в контрольном посеве.

13.3.4 Валидация метода мембранной фильтрации

Смешивают соответствующее количество исходной суспензии пробы или ее разведения, использованного в испытании (см. 9.3.2.3), и соответствующее количество калиброванной суспензии микроорганизмов, количество клеток в которой соответствует приблизительно 100 КОЕ/см3.

Фильтруют сразу же весь объем и промывают мембранный фильтр, используя необходимые объемы воды (5.1), разбавителя (5.2.3) или нейтрализатора (5.2.2). Переносят мембранный фильтр на поверхность соответствующей агаризованной среды (5.4.2).

Параллельно готовят контрольный посев при условиях, описанных выше, но без пробы продукции. Фильтруют и промывают контроль при тех же условиях.

После инкубации в течение 24 — 72 ч при температуре (32,5 +/- 2,5) °C подсчитывают колонии на мембранных фильтрах и сравнивают с результатами, полученными при испытании, и результатами контрольного испытания. Метод мембранной фильтрации и разбавитель считают подходящими, если количество микроорганизмов составляет по крайней мере 50% (0,3 log) от количества микроорганизмов в контрольной пробе.

13.4. Валидация метода обнаружения микроорганизмов с использованием обогащения

13.4.1 Проведение испытания

В пробирках, содержащих по 9 см3 разбавителя для бактериальных суспензий (5.3), готовят ряд разведений штамма каждой калиброванной суспензии, для того чтобы получить количество клеток от 100 до 500 КОЕ/см3. Для подсчета окончательной концентрации жизнеспособных микроорганизмов в стандартной суспензии переносят 1 см3 суспензии в чашку Петри и заливают 15 — 20 см3 расплавленной агаризованной среды (5.4.2), выдержанной на водяной бане при температуре не выше 48 °C.

Инкубируют при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 20 — 24 ч.

Выполняют два параллельных приготовления (две повторности) исходной суспензии пробы (3.3) в условиях, выбранных для анализа [не менее 1 г или 1 см3 продукции, определенный объем бульона для обогащения (5.4.3.2)], используя пробирки или колбы. В одну пробирку (испытание на подтверждение) асептически вносят 0,1 см3 стандартной суспензии микроорганизмов. Смешивают, затем инкубируют каждую пробирку (тестирование на валидацию и контроль) при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 20 — 24 ч.

Используя стерильную пипетку, из каждой пробирки или колбы переносят по 0,1 — 0,5 см3 (при тех же условиях, что и в испытании) инкубированной смеси на поверхность чашки Петри (диаметром 85 — 100 мм), содержащей приблизительно 15 — 20 см3 соответствующей агаризованной среды.

Инкубируют чашки при температуре (32,5 +/- 2,5) °C в течение 24 — 72 ч.

13.4.2 Интерпретация результатов

В отношении каждого штамма проверяют, чтобы стандартная суспензия микроорганизмов содержала от 100 до 500 КОЕ/см3.

Нейтрализация и метод обнаружения валидируются, если детектируется характерный рост микроорганизмов, такой как:

• для Staphylococcus aureus: культура пигментирована в желтый цвет;
• для Pseudomonas aeruginosa: зеленовато-желтая культура.

Культура инокулированного микроорганизма отмечается на чашке для подтверждения, рост на контрольной чашке не отмечается.

Когда рост отмечается на контрольной чашке (контаминированная продукция), нейтрализация и метод обнаружения подтверждаются в случае, если инокулированный микроорганизм был выделен на валидационной чашке.

13.5. Интерпретация результатов валидации

Отсутствие роста на валидационных чашках Петри указывает на то, что антимикробная активность по-прежнему присутствует и делает необходимым изменение условий данного метода. Это может быть достигнуто увеличением объема питательного бульона (количество продукции остается одинаковым), или введением достаточного количества инактивирующего агента в питательный бульон, или соответствующей комбинацией изменений, для того чтобы обеспечить рост микроорганизмов.

Если, несмотря на введение соответствующих инактивирующих агентов и значительное увеличение объема бульона, все еще невозможно регенерировать жизнеспособные культуры, как описано выше, это указывает на то, что данная продукция, вероятно, не может быть контаминирована определенным видом микроорганизма.

14. Протокол испытания

Протокол испытания должен включать следующее:

a) всю информацию, необходимую для полной идентификации продукции;

b) используемый метод;

c) полученные результаты;

d) все детали приготовления исходной суспензии;

e) описание метода с используемыми нейтрализаторами и питательными средами;

f) подтверждение метода, даже если испытание проводилось отдельно;

g) любые моменты, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с деталями, которые могут повлиять на полученные результаты.

Приложение A (справочное)

ПРОЧИЕ НЕЙТРАЛИЗИРУЮЩИЕ РАЗБАВИТЕЛИ

A.1 Общие положения

Любой нейтрализующий разбавитель может использоваться для приготовления исходной суспензии, если он будет проверен и подтвержден. Нижеприведенные разбавители являются примерами соответствующих растворов требуемого состава. Общая информация по нейтрализации приводится в приложении D.

A.2 Жидкий бульон Eugon LT 100

См. 5.4.3.2.

A.3 Лецитин — полисорбатный (LP) разбавитель

A.3.1 Состав

• полипептон — 1,0 г;
• яичный лецитин — 0,7 г;
• полисорбат 80 — 20,0 г;
• вода — 980 см3.

A.3.2 Приготовление

Растворяют ингредиенты путем перемешивания при нагревании. Охлаждают до температуры 25 °C перед тем, как разлить раствор в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH раствора должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

A.4 Модифицированный бульон Letheen [5]

A.4.1 Состав

• пептический гидролизат мяса — 20,0 г;
• панкреатический гидролизат казеина — 5,0 г;
• мясной экстракт — 5,0 г;
• дрожжевой экстракт — 2,0 г;
• лецитин — 0,7 г;
• полисорбат 80 — 5,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• бисульфит натрия — 0,1 г;
• вода — 1000 см3.

A.4.2 Приготовление

Растворяют полисорбат 80 и лецитин последовательно в кипящей воде до их полного растворения. Растворяют другие компоненты путем перемешивания при нагревании. Растворяют осторожно во избежание пенообразования. Разливают полученную среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,2 +/- 0,2 ед. pH при измерении при комнатной температуре.

Приложение B (справочное)

ПРОЧИЕ РАЗБАВИТЕЛИ

B.1 Общие положения

Любой нейтрализующий разбавитель может использоваться для приготовления исходной суспензии, если он будет проверен и подтвержден. Нижеприведенный разбавитель является примером раствора требуемого состава.

B.2 Забуференная пептонная вода (pH 7)

B.2.1 Состав

• мясной пептон — 1,0 г;
• хлорид натрия — 4,3 г;
• однозамещенный фосфорнокислый калий — 3,6 г;
• двузамещенный фосфорнокислый натрий — 7,2 г;
• вода — 1000 см3.

B.2.2 Приготовление

Растворяют ингредиенты в кипящей воде. Перемешивают. Охлаждают до температуры 25 °C, перед тем как разлить раствор в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH раствора должен быть равен 7,1 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

Приложение C (справочное)

ПРОЧИЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

C.1 Общие положения

Любая питательная среда может использоваться, если она проверена и валидирована. Нижеприведенные среды являются примерами сред требуемого состава.

C.2 Агаризованные среды для подсчета

C.2.₁ Eugon LT 100 агаризованная среда

См. 5.4.3.3.1.

C.2.2 Агар LT 100

C.2.2.1 Состав

• панкреатический гидролизат казеина — 15,0 г;
• папаиновый гидролизат соевой муки — 5,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• яичный лецитин — 1,0 г;
• полисорбат 80 — 5,0 г;
• октоксинол 9 — 1,0 г;
• агар — 15,0 г;
• вода — 1000 см3.

C.2.2.2 Приготовление

Растворяют полисорбат 80, октоксинол 9 и яичный лецитин последовательно в кипящей воде до их полного растворения. Растворяют оставшиеся компоненты, перемешивая при нагревании. Перемешивают осторожно во избежание пенообразования. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,0 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

C.2.3 Агаризованная среда с соево-казеиновым гидролизатом (бульон SCD с добавлением агара)

C.2.3.1 Состав

• казеиновый пептон — 17,0 г;
• соевый пептон — 3,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• двузамещенный фосфорнокислый калий — 2,5 г;
• глюкоза — 2,5 г;
• агар — 15,0 г;
• вода — 1000 см3.

C.2.3.2 Приготовление

Последовательно растворяют все компоненты или готовую сухую среду в кипящей воде до их полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

C.3 Бульоны для обогащения

C.3.1 Модифицированный бульон Letheen [5]

См. A.4.

C.3.2 Среда с соей, казеином, гидролизатом, лецитином и полисорбатом 80 (бульон SCDLP 80)

C.3.2.1 Состав

• казеиновый пептон — 17,0 г;
• соевый пептон — 3,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• двузамещенный фосфорнокислый калий — 2,5 г;
• глюкоза — 2,5 г;
• лецитин — 1,0 г;
• полисорбат 80 — 7,0 г;
• вода — 1000 см3.

C.3.2.2 Приготовление

Последовательно растворяют все компоненты или готовую сухую среду в кипящей воде до их полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,2 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

C.3.3 D/E-нейтрализирующий бульон (Dey/Engley-нейтрализирующий бульон) [5]

C.3.3.1 Состав

• глюкоза — 10,0 г;
• соевый лецитин — 7,0 г;
• Na2S2O3·5H2O — 6,0 г;
• полисорбат 80 — 5,0 г;
• панкреатический гидролизат казеина — 5,0 г;
• NaHSO3 — 2,5 г;
• дрожжевой экстракт — 2,5 г;
• тиогликолят натрия — 1,0 г;
• бромкрезоловый пурпурный — 0,02 г;
• вода — 1000 см3.

C.3.3.2 Приготовление

Последовательно растворяют все компоненты или готовую сухую среду в кипящей воде до их полного растворения. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации и охлаждения pH среды должен быть равен 7,6 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

C.4 Агаризованная среда с соей, казеином, гидролизатом, лецитином и полисорбатом 80 (SCDLPA) для обнаружения микроорганизмов

C.4.1 Состав

• казеиновый пептон — 15,0 г;
• соевый пептон — 5,0 г;
• хлорид натрия — 5,0 г;
• яичный лецитин — 1,0 г;
• полисорбат 80 — 7,0 г;
• агар — 15,0 г;
• вода — 1000 см3.

C.4.2 Приготовление

Смешивают и растворяют ингредиенты путем нагревания. Разливают среду в подходящую лабораторную посуду. Стерилизуют в автоклаве при 121 °C в течение 15 мин. После стерилизации pH среды должен быть равен 7,0 +/- 0,2 при измерении при комнатной температуре.

Приложение D (справочное)

НЕЙТРАЛИЗАТОРЫ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ КОНСЕРВАНТОВ И ПРОМЫВНЫХ ЖИДКОСТЕЙ

Приложение ДА (справочное)

СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНОГО МЕЖДУНАРОДНОГО СТАНДАРТА МЕЖГОСУДАРСТВЕННОМУ СТАНДАРТУ

Таблица ДА.1

БИБЛИОГРАФИЯ