ГОСТ ISO 16649-2-2015. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевой продукции и кормов. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка). Часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида
(введен в действие Приказом Росстандарта от 29.08.2016 № 955-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности отдельных видов специализированной пищевой продукции, в том числе диетического лечебного и диетического профилактического питания» (ТР ТС 027/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 16.10.2018 № 168). Текст данного документа приведен с учетом поправки, опубликованной в «ИУС», № 4, 2020. Документ введен в действие с 1 июля 2017 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 августа 2016 г. № 955-ст
МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ И КОРМОВ
ГОРИЗОНТАЛЬНЫЙ МЕТОД ПОДСЧЕТА БЕТА-ГЛЮКУРОНИДАЗА-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ ESCHERICHIA COLI (КИШЕЧНАЯ ПАЛОЧКА)
МЕТОДИКА ПОДСЧЕТА КОЛОНИЙ ПРИ ТЕМПЕРАТУРЕ 44 °C С ПРИМЕНЕНИЕМ 5-БРОМ-4-ХЛОР-3-ИНДОЛИЛ-БЕТА-D-ГЛЮКУРОНИДА
Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of \beta - glucuronidase - positive Escherichia coli. Part 2. Colony-count technique at 44 °C using 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - \beta - D - glucuronide
(ISO 16649-2:2001, Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of \beta - glucuronidase - positive Escherichia coli. Part 2. Colony-count technique at 44 °C using 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - \beta - D - glucuronide , IDT)
Дата введения 1 июля 2017 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским унитарным предприятием «Белорусский государственный институт метрологии» (БелГИМ) на основе собственного перевода на русский язык англоязычной версии международного стандарта, указанного в пункте 5
2 ВНЕСЕН Государственным комитетом по стандартизации Республики Беларусь
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 января 2015 г. № 74-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 29 августа 2016 г. № 955-ст межгосударственный стандарт ГОСТ ISO 16649-2-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.
5 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 16649-2:2001 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка). Часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида» («Microbiology of food and animal feeding stuffs. Horizontal method for the enumeration of \beta - glucuronidase - positive Escherichia coli. Part 2. Colony-count technique at 44 °C using 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - \beta - D - glucuronide », IDT).
Международный стандарт разработан подкомитетом SC 9 «Микробиология» Технического комитета по стандартизации ISO/TC 34 «Пищевые продукты» Международной организации по стандартизации (ISO).
Официальные экземпляры международного стандарта, на основе которого подготовлен настоящий государственный стандарт, и международных стандартов, на которые даны ссылки, имеются в Федеральном агентстве по техническому регулированию и метрологии.
Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования международного стандарта с целью применения обобщающего понятия в наименовании стандарта в соответствии с ГОСТ 1.5-2001.
В стандарт внесены следующие редакционные изменения: единица измерения миллилитр (мл) заменена на кубический сантиметр (см3); 5.2.1 и 5.2.2 дополнены примечаниями.
В разделе «Нормативные ссылки» ссылки на международные стандарты актуализированы.
При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Введение
Международный стандарт ISO 16649 состоит из следующих частей под общим наименованием «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка)»:
- часть 1. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением мембран и 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;
- часть 2. Методика подсчета колоний при температуре 44 °C с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида;
- часть 3. Метод наиболее вероятного числа с применением 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуронида.
В данном стандарте описаны два горизонтальных метода (ISO 16649-1 и ISO 16649-2) для подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (кишечная палочка).
Пользователь может выбрать либо ISO 16649-1, либо ISO 16649-2. Каждая часть предназначена для общего применения. Однако необходимо использовать ISO 16649-1 для пищевой продукции, которая может содержать микроорганизмы, подвергшиеся шоковому воздействию.
1 Область применения
В настоящем стандарте приводится горизонтальный метод подсчета бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в продуктах, предназначенных для потребления человеком в пищу, или в продуктах, предназначенных для корма животных. В нем используется методика подсчета колоний при температуре 44 °C на плотной питательной среде, содержащей хромогенный компонент для обнаружения фермента бета-глюкуронидазы.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Штаммы Escherichia coli, которые не растут при 44 °C, в частности бета-глюкуронидаза-отрицательные, такие как Escherichia coli O 157, не будут обнаружены.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы ссылки на межгосударственные стандарты, которые являются обязательными. Для датированных ссылок применяют только указанное издание, для недатированных ссылок применяют последнее издание ссылочного стандарта (включая все его изменения):
ISO 6887-1:1999 Microbiology of food and animal feeding stuffs. Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Подготовка образцов для испытания, исходной суспензии и десятичных разведений для микробиологических исследований. Часть 1. Общие правила подготовки исходной суспензии и десятичных разведений)
ISO 7218:2007 Microbiology of food and animal feeding stuffs. General rules for microbiological examinations (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям)
3 Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1 бета-глюкуронидаза-положительные Escherichia coli ( \beta - glucuronidase - positive Escherichia coli): Бактерии, которые при температуре 44 °C образуют типичные колонии синего цвета в среде с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX) в условиях, описанных в настоящем стандарте.
3.2 подсчет бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli (enumeration of \beta - glucuronidase - positive Escherichia coli): Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр или грамм образца, когда испытание и вычисления проводятся в соответствии с настоящим стандартом.
4 Сущность метода
4.1 Заданное количество исследуемого образца или исходной суспензии засевают в две параллельные чашки Петри со средой с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX).
При таких же условиях каждое последующее десятичное разведение образца или исходной суспензии засевают в две чашки Петри со средой TBX.
Чашки инкубируют в течение 18 — 24 ч при температуре (44 +/- 1) °C, затем исследуют на наличие колоний, типичных для бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli.
4.2 Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на грамм или кубический сантиметр образца (см. пункт 10).
5 Разбавитель и питательная среда
См. действующую лабораторную практику в ISO 7218.
5.1 Разбавитель
См. ISO 6887-1 или соответствующий стандарт, касающийся подлежащего исследованию продукта.
5.2 Питательная среда: среда с триптоном, солями желчных кислот и X-глюкуронидом (TBX)
5.2.1 Состав
| Ферментативный гидролизат казеина | 20,0 г |
| Соли желчных кислот № 3 | 1,5 г |
| 5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-глюкуроновая кислота (BCIG) | 144 мкмоль a |
| Диметилсульфоксид (DMSO) b | 3 см3 |
| Агар | от 9 до 18 г c |
| Вода | 1000 см3 |
| a Например, 0,075 г соли циклогексиламмония. b Диметилсульфоксид вреден при вдыхании и контакте. При работе с ним рекомендуется использовать вытяжной шкаф. Ввиду токсичности можно использовать рекомендованный изготовителем разбавитель. c В зависимости от прочности агарового геля. Примечание — Используемые реактивы должны быть признанного аналитического качества и пригодными для микробиологических исследований. | |
5.2.2 Подготовка
Растворяют BCIG в диметилсульфоксиде или в рекомендованном изготовителем разбавителе.
Растворяют все компоненты в воде и нагревают до кипения.
При необходимости отрегулировать pH таким образом, чтобы после стерилизации он составлял (7,2 +/- 0,2) при температуре 25 °C.
Производят стерилизацию в автоклаве при температуре 121 °C в течение 15 мин. Сразу же охлаждают среду в водяной бане (6.3) при температуре от 44 °C до 47 °C.
6 Оборудование и стеклянная посуда
Обычное микробиологическое лабораторное оборудование (см. ISO 7218):
6.1 Устройство для суховоздушной стерилизации (печь) или паровой стерилизации (автоклав).
6.2 Инкубаторы, способные поддерживать температуру (44 +/- 1) °C.
6.3 Водяная баня, способная поддерживать температуру от 44 °C до 47 °C.
6.4 Пробирки, бутылки или колбы необходимой вместимости.
6.5 Пипетки или микропипетки с одной меткой (выдувные), с широкими отверстиями и номинальной вместимостью 1 и 10 см3, с ценой деления 0,1 и 0,5 см3 соответственно.
6.6 Чашки Петри диаметром приблизительно 90 мм.
6.7 pH-метр, способный проводить измерения с точностью до +/- 0,1 ед. pH.
Его минимальный порог измерения должен составлять 0,01 ед. pH. pH-метр должен быть оснащен устройством ручного или автоматического выравнивания температуры.
7 Отбор проб
Очень важно, чтобы лаборатория получила представительную, не поврежденную и не измененную во время транспортировки или хранения, пробу.
Отбор проб не является частью метода, описанного в настоящем стандарте. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.
8 Подготовка анализируемой пробы
Подготовку анализируемой пробы проводят в соответствии со стандартом, подходящим для рассматриваемого продукта. Если соответствующий стандарт отсутствует, рекомендуется, чтобы заинтересованные стороны пришли к определенному соглашению по данному вопросу.
9 Методика
9.1 Исследуемая часть пробы, исходная суспензия и разведения
См. ISO 6887-1 и любой соответствующий стандарт, подходящий для рассматриваемого продукта.
9.2 Посев и инкубация
9.2.1 Используя стерильные пипетки или микропипетки (6.5), внести в стерильную чашку Петри (6.6) 1 см3 исследуемой пробы (в случае с жидкостью) или 1 см3 исходного разведения (10-1) в случае с другими продуктами.
Засевают по две чашки Петри для каждого разведения.
При необходимости повторяют процедуру с последующими десятичными разведениями, используя новую стерильную пипетку для каждого разведения.
9.2.2 Заливают в каждую чашку Петри приблизительно 15 см3 среды ТВХ (5.2), предварительно охлажденной до температуры от 44 °C до 47 °C на водяной бане (6.3).
Аккуратно смешивают инокулят со средой и дают застыть, разместив чашки Петри на прохладной горизонтальной поверхности.
Промежуток времени от момента распределения инокулята в чашке и до внесения среды не должен превышать 15 мин.
9.2.3 Переворачивают засеянные чашки (9.2.2) дном вверх и помещают их в инкубатор (6.2), настроенный на температуру (44 +/- 1) °C, на 18 — 24 ч. Общее время инкубации не должно превышать 24 ч.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ — Если есть предположение о присутствии подвергшихся шоковому воздействию клеток, вначале следует производить инкубацию в течение 4 ч при температуре (37 +/- 1) °C, а затем повышать температуру инкубации до (44 +/- 1) °C в течение 18 — 24 ч. Температура инкубации не должна превышать 45 °C.
9.3 Подсчет колоний (КОЕ)
После заданного периода инкубации (9.2.3) подсчитывают типичные колонии (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli в каждой чашке, содержащей менее 150 типичных колоний (КОЕ) и менее 300 общих (типичных и нетипичных) колоний (КОЕ).
Чашки, не содержащие типичных колоний (КОЕ), должны быть учтены при вычислениях, приведенных в пункте 10.
10 Обработка результатов
10.1 Общие положения
В ходе вычисления, описанного в 10.2, принимаются во внимание случаи, наиболее часто встречающиеся при проведении испытаний в соответствии с надлежащей лабораторной практикой. Могут возникать некоторые особые, маловероятные случаи (например, сильно различающиеся количества колоний КОЕ в двух чашках из одного разведения или пропорции, сильно отличающиеся от пропорции коэффициента разведения в чашках из двух последовательных разведений). В таком случае результаты подсчета должны быть переданы компетентному микробиологу для изучения, толкования и возможного отклонения.
10.2 Подсчет колоний
Для того чтобы результат был достоверным, необходимо подсчитать количество колоний КОЕ по крайней мере в одной чашке, содержащей не менее 15 типичных колоний КОЕ.
Рассчитывают количество КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в исследуемой пробе, на кубический сантиметр или на грамм № как средневзвешенное из двух последовательных разведений, используя следующую формулу:
N = \frac{\sum a}{V(n_{1} + 0,1n_{2})d} , (1)
где \sum a — сумма типичных колоний КОЕ во всех чашках, выбранных для подсчета из двух последовательных разведений, из которых хотя бы одна содержит не менее 15 типичных колоний (КОЕ);
n1 — количество чашек, выбранных для подсчета из первого разведения;
V — объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см3;
n2 — количество чашек, выбранных для подсчета из второго разведения;
d — коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
За результат принимают количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), выраженное как целое число, округленное до двух значащих цифр (если ниже 100), или как число между 1,0 и 9,9, умноженное на 10 в соответствующей степени.
10.3 Расчет малых количеств
10.3.1 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты) или первым засеянным разведением отсутствуют типичные колонии (КОЕ)] содержится менее 15 типичных колоний КОЕ, рассчитывают количество колоний (КОЕ) бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в испытуемой пробе, NE, как среднее арифметическое количество колоний в двух параллельных чашках, используя следующую формулу:
N_{E} = \frac{\sum c}{V \cdot n \cdot d} , (2)
где \sum c — сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках;
V — объем инокулята, внесенного в каждую чашку, см3;
n — количество выбранных для подсчета чашек (n = 2 в данном случае);
d — коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
Округляют результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
Выражают результаты следующим образом:
- рассчитанное количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты): NE = Y.
10.3.2 Если в двух чашках [с исследуемой пробой (жидкие продукты) или исходной суспензией (другие продукты), или первым засеянным или сохраненным разведением] отсутствуют типичные колонии КОЕ, результаты выражают следующим образом:
- менее 1/d бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d — коэффициент разведения, соответствующий первому выбранному разведению [d = 1 в случае (жидкие продукты), когда исследовался неразведенный жидкий продукт].
10.3.3 Если для двух чашек из первого разведения d1 общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 с видимыми типичными колониями КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d2, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии КОЕ, выражают результаты следующим образом:
- менее 1/d2 и более 1/d1 бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d1 и d2 — коэффициенты разведения, соответствующие первому и второму выбранным разведениям.
10.3.4 Если для двух чашек из первого разведения d1 общее количество типичных и нетипичных колоний КОЕ превышает 300 без видимых типичных колоний КОЕ и если для двух чашек из последующего разведения d2, содержащих менее 300 колоний, не могут быть подсчитаны типичные колонии КОЕ, выражают результаты следующим образом:
- менее 1/d2 колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d2 — коэффициент разведения, соответствующий второму разведению.
10.4 Метод подсчета
10.4.1 В случае, когда количество типичных колоний КОЕ превышает 150 для двух чашек из первого разведения d1 и когда количество типичных колоний КОЕ не превышает 15 для двух чашек из последующего разведения d2:
- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d1 находится в диапазоне от 167 до 150 (верхняя часть доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует использовать метод расчета для общего случая (10.2);
- если количество типичных колоний КОЕ в каждой из двух чашек из разведения d1 превышает 167 (верхний предел доверительного интервала средневзвешенного значения, равного 150 КОЕ), следует принять во внимание только результат подсчетов разведения d2 и произвести подсчет малых чисел (10.3).
10.4.2 Если в ходе подсчета типичных колоний КОЕ в каждой чашке из всех засеянных разведений получено число, превышающее 150, результат выражают следующим образом:
- более 150/d колоний КОЕ бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli на кубический сантиметр (жидкие продукты) или на грамм (другие продукты), где d — коэффициент разведения последнего засеянного разведения.
10.4.3 Если только в двух чашках из наименьшего разведения (самая высокая концентрация) содержится менее 150 типичных колоний КОЕ, следует рассчитать количество бета-глюкуронидаза-положительных Escherichia coli, присутствующих в анализируемой пробе, N', как среднее арифметическое число колоний, подсчитанных в двух чашках, используя следующую формулу:
N\prime = \frac{\sum c}{V \cdot n \cdot d} , (3)
где \sum c — сумма типичных колоний КОЕ, подсчитанных в двух чашках, в одной из которых содержится как минимум 15 типичных колоний КОЕ;
V — объем инокулята, примененного в каждой чашке, см3;
n — количество сохраненных чашек (n = 2 в данном случае);
d — коэффициент разведения, соответствующий сохраненному разведению.
Округлить результаты до двух значащих цифр (см. ISO 7218).
10.5 Границы доверительного интервала
11 Протокол испытания
В протоколе испытания необходимо указать:
- всю информацию, необходимую для полной идентификации пробы;
- использованный метод отбора проб, если известен;
- использованный метод испытания со ссылкой на настоящий стандарт;
- все рабочие детали, не указанные в настоящем стандарте или рассматриваемые как необязательные, вместе с деталями касающихся всех особых случаев, которые могли оказать влияние на результат(ы);
- полученный(е) результат(ы), четко указывающий(е) на использованный для его выражения метод;
- окончательный результат с учетом воспроизводимости, если она оценивалась.
СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖДУНАРОДНЫХ СТАНДАРТОВ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫМ СТАНДАРТАМ
| Обозначение ссылочного международного стандарта | Степень соответствия | Обозначение и наименование соответствующего межгосударственного стандарта |
| ISO 6887-1:1999 | - | <*> |
| ISO 7218:2007 | IDT | ГОСТ ISO 7218-2011 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования к выполнению микробиологических исследований» |
| <*> Соответствующий межгосударственный стандарт отсутствует. До его принятия рекомендуется использовать официальный перевод на русский язык данного международного стандарта. Перевод данного международного стандарта находится в Федеральном информационном фонде технических регламентов и стандартов. Для кормов рекомендуется использовать ГОСТ Р 51426-99. Примечание — В настоящей таблице использовано следующее условное обозначение степени соответствия стандарта: - IDT — идентичный стандарт. | ||