ГОСТ 34461-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение содержания гесперидина и нарингина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(введен в действие Приказом Росстандарта от 12.10.2018 № 755-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 51427-99"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-51427-99" "ГОСТ Р 51427-99. Государственный стандарт Российской Федерации. Соки цитрусовые. Метод определения массовой концентрации гесперидина и нарингина с помощью... (принят и введен в дей"
  n1["ГОСТ Р 54742-2011"]:::rst
  click n1 "https://bukva.ai/docs/2732-83" "ГОСТ Р 54742-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение нарингина и неогесперидина в апельсиновом соке методом высокоэффективной жидкостной хр"
  n2["ГОСТ 34461-2018"]:::doc
  click n2 "https://bukva.ai/docs/gost-34461-2018" "ГОСТ 34461-2018. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение содержания гесперидина и нарингина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (введен в действи"
  n0 --> n2
  n1 --> n2
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 октября 2018 г. № 755-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГЕСПЕРИДИНА И НАРИНГИНА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Juice products. Determination of hesperidin and naringin content by HPLC method

ГОСТ 34461-2018

МКС 67.080.01

Дата введения 1 ноября 2019 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Некоммерческой организацией «Российский союз производителей соков» (РСПС) при участии Общества с ограниченной ответственностью «Люмэкс-маркетинг» (ООО «Люмэкс-маркетинг»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 августа 2018 г. № 111-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 октября 2018 г. № 755-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34461-2018 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 ноября 2019 г.

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию (соки, концентрированные соки, нектары, сокосодержащие напитки), произведенную на основе или с добавлением цитрусовых фруктов (апельсина, грейпфрута, мандарина, лимона и лайма), и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) для определения содержания (массовой концентрации и массовой доли) гесперидина и нарингина.

Диапазон измерений массовой концентрации нарингина в готовой соковой продукции (соки, нектары и сокосодержащие напитки) составляет от 30 до 1000 мг/дм3, а гесперидина — от 100 до 1000 мг/дм3.

Диапазон измерений массовой доли нарингина в концентрированных соках составляет от 150 до 5000 млн-1, а гесперидина — от 500 до 5000 млн-1.

Примечание - 1 млн-1 соответствует 1 мг/кг.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 <**> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».

ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия

ГОСТ 5712-78 Реактивы. Аммоний щавелевокислый 1-водный. Технические условия

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002.

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <**> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 20289-74 Реактивы. Диметилформамид. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Сущность метода

Метод основан на экстракции гесперидина и нарингина из проб соковой продукции смесью N,N-диметилформамида и водного раствора щавелевокислого аммония с последующим измерением массовой концентрации указанных соединений в экстракте методом ВЭЖХ с фотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области спектра.

4 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы, посуда и материалы

4.1 Хроматограф жидкостный со спектрофотометрическим детектором, обеспечивающим проведение измерений при 287 нм или диодно-матричным детектором в диапазоне длин волн от 190 до 600 нм, снабженный программным обеспечением для сбора и обработки данных, со следующими метрологическими характеристиками:

• относительное среднеквадратическое отклонение выходного сигнала по высоте и площади пика — не более 3%;
• относительное среднеквадратическое отклонение выходного сигнала по времени удерживания — не более 1,0%.

Предел детектирования гесперидина и нарингина (при соотношении сигнал/шум, равном трем) должен быть не более 0,2 мг/дм3.

Рекомендуется использование термостата колонок.

4.2 Колонка хроматографическая <***>, заполненная обращенно-фазовым сорбентом C18, обеспечивающая число теоретических тарелок по пикам гесперидина и нарингина не менее 3000.

<***> Например, хроматографические колонки Nucleosil 100-5C18 и Agilent ZORBAX SB-C18. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанных продуктов. Допускается использование аналогичных хроматографических колонок, в том числе с иными типоразмерами при соблюдении указанных требований.

4.3 Колонка защитная (предколонка), заполненная обращенно-фазовым сорбентом.

4.4 Весы неавтоматического действия специального класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности измерений +/- 0,0001 г.

4.5 Весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1, пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения +/- 0,001 г.

4.6 Пипетки градуированные 2-1-2-1, 2-1-2-2, 2-1-2-5 и 2-1-2-10 по ГОСТ 29227.

Примечание — Допускается использование дозаторов с метрологическими характеристиками, соответствующими ГОСТ 28311.

4.7 Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-1000-2 по ГОСТ 1770.

4.8 Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250, 1000 см3, 2-го класса точности, исполнений 2 или 2а по ГОСТ 1770.

4.9 Центрифуга лабораторная с частотой вращения не менее 83 с-1 (5000 об/мин), обеспечивающая фактор разделения (g-фактор) не менее 1000.

4.10 Шкаф сушильный с диапазоном рабочих температур от 50 °C до 200 °C.

4.11 Насос лабораторный вакуумный, мембранный или водоструйный по ГОСТ 25336, обеспечивающий разрежение от 2,5 до 10 кПа.

4.12 Баня водяная с регулятором температуры, обеспечивающая поддержание температуры в диапазоне от 40 °C до 100 °C.

4.13 Стаканы любого типа исполнения 1 вместимостью 50, 100 см3 по ГОСТ 25336.

4.14 Колбы плоскодонные П-1-1000-29/32 или конические Кн-1-250-29/32, Кн-1-1000-29/32 по ГОСТ 25336.

4.15 Сосуды стеклянные с завинчивающимися крышками (виалы) с инертным материалом септы вместимостью от 10 до 20 см3.

4.16 Пробирки одноразовые из полимерного материала типа Эппендороф или аналогичные вместимостью от 1 до 2 см3.

4.17 Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3.

4.18 Фильтры мембранные с диаметром пор 0,20 и 0,45 мкм.

4.19 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696 1-й степени чистоты (далее — вода для анализа).

4.20 Ацетонитрил для жидкостной хроматографии (оптическая плотность при 200 нм относительно дистиллированной воды должна быть не более 0,05 единиц оптической плотности), ос.ч.

4.21 N,N-Диметилформамид по ГОСТ 20289, х.ч.

4.22 Аммоний щавелевокислый 1-водный по ГОСТ 5712, х.ч.

4.23 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.

4.24 Кислота серная по ГОСТ 4204, х.ч. или ч.д.а.

4.25 Гесперидин <*> с массовой долей основного вещества не менее 95%.

<*> CAS 520-26-3 (CAS — код соединения в американской реферативной системе по химии (Chemical Abstracts).

4.26 Нарингин <**> с массовой долей основного вещества не менее 95%.

<> CAS 10236-47-2**

Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательного оборудования, посуды, материалов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных и химических реактивов аналогичной квалификации.

5 Отбор проб

Отбор проб соковой продукции — по ГОСТ 26313.

6 Условия проведения измерений

При подготовке к проведению измерений и проведении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха ............. (20 +/- 5) °C;
• атмосферное давление ........................ от 84,0 до 106,7 кПа;
• влажность воздуха ........................... не более 80%.

В лабораторных помещениях не должно быть загрязненности воздуха рабочей зоны пылью и агрессивными веществами, должны отсутствовать вибрация или другие факторы, влияющие на результаты измерений.

7 Подготовка к проведению измерений

7.1 Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы моют только серной кислотой (см. 4.24) без применения других моющих средств, тщательно промывают водопроводной водой и ополаскивают водой для анализа.

Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают водой для анализа и сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °C.

7.2 Приготовление вспомогательных растворов

7.2.1 Приготовление раствора уксусной кислоты молярной концентрации 0,2 моль/дм3

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают приблизительно 200 см3 дистиллированной воды, добавляют 12 см3 концентрированной уксусной кислоты, разбавляют дистиллированной водой до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянном сосуде при температуре (4 +/- 2) °C — 3 мес.

7.2.2 Приготовление подвижной фазы

Подвижную фазу готовят смешиванием 200 см3 ацетонитрила (см. 4.20) и 800 см3 раствора уксусной кислоты (см. 7.2.1) в плоскодонной колбе вместимостью 1000 см3 (см. 4.14).

Срок хранения подвижной фазы в стеклянном сосуде при температуре (4 +/- 2) °C — 14 сут.

Перед использованием подвижную фазу дегазируют и фильтруют в соответствии с указаниями изготовителя хроматографа и (или) колонки.

Примечания

1 В зависимости от типа сорбента и типоразмера применяемых колонок допускается варьирование состава подвижной фазы с целью разделения пиков гесперидина и нарингина и их отделения от пиков компонентов матрицы пробы.

2 Допускается приготовление иных объемов подвижной фазы в зависимости от потребности.

7.2.3 Приготовление раствора щавелевокислого аммония молярной концентрации 0,025 моль/дм3

В химическом стакане вместимостью 50 или 100 см3 взвешивают (3,55 +/- 0,05) г щавелевокислого аммония 1-водного (см. 4.22) и растворяют приблизительно в 30 см3 воды для анализа. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3. Доводят до метки водой для анализа и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянном сосуде при температуре (20 +/- 5) °C — 3 мес.

Примечание - Допускается изменять объем приготавливаемого раствора в зависимости от потребности.

7.3 Приготовление градуировочных и контрольных растворов

7.3.1 Общие положения

Растворы гесперидина и нарингина следует хранить в темном месте при температуре от 2 °C до 6 °C в герметичной посуде, исключающей возможность испарения растворителя и контакт раствора с материалами иными, чем стекло. Растворы каждой концентрации готовят по потребности.

7.3.2 Приготовление основного раствора гесперидина номинального значения массовой концентрации 500 мг/дм3

В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают (25,0 +/- 0,5) мг гесперидина (см. 4.25), добавляют 10 см3 N,N-диметилформамида (см. 4.21), тщательно перемешивают до полного растворения (при необходимости нагревают на водяной бане при температуре от 40 °C до 45 °C). Содержимое колбы доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в условиях по 7.3.1 - 4 сут.

7.3.3 Приготовление основного раствора нарингина номинального значения массовой концентрации 1000 мг/дм3

В мерную колбу вместимостью 25 см3 помещают (25,0 +/- 0,5) мг нарингина (см. 4.26), добавляют 5 см3 N,N-диметилформамида (см. 4.21) и перемешивают до полного растворения нарингина. Содержимое колбы доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в условиях по 7.3.1 - 4 сут.

7.3.4 Фактическое значение массовой концентрации гесперидина (нарингина) в основном растворе Cосн, мг/дм3, вычисляют по формуле

C_{\text{осн}} = \frac{M \cdot 1000 \cdot \theta}{V_{1} \cdot 100} , (1)

где M — масса гесперидина (нарингина), мг;

1000 — коэффициент согласования размерности единиц объема;

\theta — массовая доля основного вещества в исходном реактиве, использованном для приготовления основного раствора (указано в паспорте изготовителя), %;

V1 — объем основного раствора, см3;

100 — коэффициент для перевода массовой доли основного вещества из процентов в безразмерную величину.

7.3.5 Приготовление градуировочных растворов

7.3.5.1 Приготовление градуировочного раствора № 1

В стеклянный сосуд с завинчивающейся крышкой (виалу) вместимостью от 10 до 20 см3 помещают пипеткой или дозатором 2 см3 основного раствора гесперидина (см. 7.3.2) и 1 см3 основного раствора нарингина (см. 7.3.3), добавляют пипеткой или дозатором 7 см3 подвижной фазы, приготовленной по 7.2.2, и тщательно перемешивают.

Номинальное значение массовой концентрации компонентов в градуировочном растворе № 1 составляет 100 мг/дм3. Фактическое значение массовой концентрации компонентов C1, мг/дм3, вычисляют по формуле

C_{1} = \frac{C_{\text{осн}} \cdot V_{\text{осн}}}{V_{\text{гр}}} , (2)

где Cосн — фактическое значение массовой концентрации компонента в основном растворе (см. 7.3.4), мг/дм3;

Vосн — объем основного раствора компонента, использованный для приготовления градуировочного раствора № 1, см3;

Vгр — объем приготовленного градуировочного раствора № 1, см3 (10 см3).

Раствор используют в день приготовления.

7.3.5.2 Приготовление градуировочных растворов № 2 — 5

В стеклянные сосуды с завинчивающейся крышкой (виалы) вместимостью от 10 до 20 см3 помещают пипеткой или дозатором градуировочный раствор № 1 (см. 7.3.5.1), добавляют пипеткой или дозатором подвижную фазу, приготовленную по 7.2.2 (см. таблицу 1), и тщательно перемешивают.

Таблица 1

Фактическое значение массовой концентрации компонента в приготовленном градуировочном растворе Cj, мг/дм3, вычисляют по формуле

C_{j} = \frac{C_{1} \cdot V_{\text{ал}}}{V_{j}} , (3)

где C1 — фактическое значение массовой концентрации компонента в градуировочном растворе № 1 (см. 7.3.5.1), мг/дм3;

Vал — объем аликвоты градуировочного раствора № 1, использованный для приготовления данного градуировочного раствора (см. таблицу 1), см3;

Vj — объем приготовленного градуировочного раствора, см3 (10 см3).

Растворы используют в день приготовления.

7.4 Подготовка хроматографа к работе

Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на рабочий режим, включая кондиционирование колонки, а также промывку гидравлической линии хроматографа и выключение хроматографа по окончании работы осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.

7.5 Условия хроматографического анализа

При проведении хроматографического анализа создают и поддерживают следующие условия:

• температура колонки — 25 °C (при наличии термостата колонок);
• длина волны детектирования при использовании спектрофотометрического детектора — 287 нм;
• объем дозирования пробы — полное заполнение дозирующей петли (от 10 до 20 мм3);
• режим элюирования — изократический, подвижная фаза — по 7.2.2;
• объемную скорость потока подвижной фазы определяют типоразмерами хроматографической колонки. Рекомендуемое значение составляет 1,0 см3/мин для колонок длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм и 0,2 см3/мин — для колонок длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм.

7.6 Градуировка хроматографа

Для градуировки хроматографа регистрируют по две хроматограммы градуировочных растворов № 1 — 5 (см. 7.3.5) и, используя программное обеспечение к хроматографу, находят площади пиков компонентов, а затем устанавливают градуировочную характеристику для каждого компонента в виде функциональной зависимости площади пика от массовой концентрации компонента.

Градуировку проводят при освоении метода и далее — при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа, при значительном изменении параметров хроматографического процесса (времени удерживания, эффективности, разрешения и асимметрии пиков), после ремонта хроматографа или при неудовлетворительных результатах контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.7).

Примечание - После длительного перерыва в работе рекомендуется проверить стабильность градуировочной характеристики в нескольких точках (не менее двух) диапазона.

7.7 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работы, используя заново приготовленный градуировочный раствор № 2.

Регистрируют не менее двух хроматограмм этого раствора, идентифицируют пики компонентов, внося при необходимости коррекцию времен удерживания и принимая во внимание параметры хроматографического процесса (эффективность колонки, время удерживания пиков, разрешение пиков, асимметрию пиков), и вычисляют массовую концентрацию гесперидина и нарингина с использованием действующей градуировочной характеристики.

Проверяют сходимость времен удерживания

|t_{1} - t_{2}| \leq 0,05 \cdot \overline{t} , (4)

где t₁ и t₂ - время удерживания пика компонента на первой и второй хроматограммах соответственно, мин;

\overline{t} — среднеарифметическое значение времен удерживания t и t2, мин.

Проверяют сходимость значений массовой концентрации компонентов

|C_{\text{к}1} - C_{\text{к}2}| \leq 0,06 \cdot \overline{C_{\text{к}}} , (5)

где Cк1 и Cк2 — измеренное значение массовой концентрации компонентов в пробе для контроля по первой и второй хроматограммам соответственно, мг/дм3;

\overline{C_{\text{к}}} — среднеарифметическое значение массовой концентрации Cк1 и cк2, мг/дм3.

Градуировочная характеристика признается стабильной, если выполняется условие

|C_{\text{к}} - C_{\text{к}0}| \leq 0,08 \cdot C_{\text{к}0} , (6)

где Cк — фактическое значение массовой концентрации компонента в растворе, используемом для контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.3.4), мг/дм3;

Cк0 — фактическое значение массовой концентрации компонента в растворе, используемом для контроля стабильности градуировочной характеристики (см. 7.3.4), мг/дм3.

Если условие (6) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при получении неудовлетворительного результата градуировку хроматографа проводят заново.

8 Проведение измерений

8.1 Подготовка проб к измерениям

8.1.1 Измерения проводят два раза в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-1.

8.1.2 Пробу соков, нектаров или сокосодержащих напитков интенсивно перемешивают и в две мерные колбы вместимостью 25 см3 (V2) отбирают аликвоты объемом 5 см3 (V3) для проведения параллельных определений (см. 8.1.1).

Примечание - Аликвоты для параллельных определений должны быть отобраны одна за другой без задержки.

В каждую мерную колбу вместимостью 25 см3 добавляют по 5 см3 раствора щавелевокислого аммония, приготовленного по 7.2.3, 5 см3 N,N-диметилформамида (см. 4.21). Содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры, доводят до метки водой для анализа и тщательно перемешивают.

Нагревают в течение 10 мин на водяной бане при температуре от 90 °C до 100 °C и охлаждают до комнатной температуры.

Приблизительно 1,5 см3 полученного раствора помещают в одноразовую пробирку (см. 4.16), центрифугируют при скорости вращения 5000 об/мин (фактор разделения не менее 1000) в течение 5 мин и подвергают хроматографическому анализу по 8.2.

Примечание - Допускается замена центрифугирования фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,20 или 0,45 мкм. Не допускается использование мембранных фильтров из полисульфона, так как они не устойчивы к ацетонитрилу, а также на основе политетрафторэтилена (PTFE) и его аналогов, поскольку эти материалы адсорбируют нарингин и гесперидин.

8.1.3 Концентрированные соки предварительно разбавляют. В стакане вместимостью 50 см3 взвешивают от 4,5 до 5,5 г пробы концентрированного сока, добавляют от 5 до 10 см3 воды для анализа и перемешивают. Полученный раствор количественно (многократно ополаскивая стенки стакана водой для анализа) переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 (V4), доводят водой для анализа до метки и тщательно перемешивают. Затем проводят все процедуры, предусмотренные 8.1.2.

8.2 Проведение хроматографического анализа

8.2.1 Подготовленную по 8.1 пробу дозируют в хроматограф и регистрируют две хроматограммы в тех же условиях, в которых были зарегистрированы хроматограммы градуировочных растворов (см. 7.5). На полученных хроматограммах идентифицируют пики определяемых компонентов, установив ширину окна идентификации 5%, используя значения площадей пиков. Вычисляют значения массовой концентрации идентифицированных компонентов при помощи градуировочных характеристик, установленных по 7.6.

8.2.2 Проверяют выполнение условия (5). Если это условие выполняется, то в качестве значения массовой концентрации компонента в подготовленной по 8.1 пробе принимают среднеарифметическое полученных значений. Если условие не выполняется, находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод подготовленной пробы повторяют.

8.2.3 Если массовая концентрация гесперидина (нарингина) в подготовленной по 8.1.2 или 8.1.3 пробе превышает верхнюю границу диапазона градуировочной характеристики (100 мг/дм3), то подготовленную пробу разбавляют водой для анализа. Коэффициент разбавления Q вычисляют по формуле

Q = \frac{V_{p}}{V_{a}} , (7)

где Vр — объем разбавленной пробы, см3;

Va — объем аликвоты подготовленной по 8.1 пробы, взятый для разбавления, см3.

8.2.4 Примеры хроматограмм приведены в приложении А.

9 Обработка и оформление результатов измерений

9.1 Если подготовка пробы была проведена по 8.1.2, то массовую концентрацию гесперидина (нарингина) в пробе C, мг/дм3, вычисляют по формуле

\text{С } = \frac{\text{С}_{x} \cdot V_{2} \cdot Q}{V_{3}} , (8)

где Cх — массовая концентрация гесперидина (нарингина) (см. 8.2.2), мг/дм3;

V2 — вместимость мерной колбы, используемой при подготовке пробы по 8.1.2, см3 (25 см3);

Q — коэффициент дополнительного разбавления подготовленной пробы по 8.2.3. Если подготовленная проба дополнительно не была разбавлена, то Q = 1;

V3 — объем аликвоты исходной пробы, см3 (5 см3).

За результат измерений массовой концентрации гесперидина (нарингина) в пробе принимают среднеарифметическое значение \overline{C} , мг/дм3, результатов двух параллельных измерений C1 и C2, мг/дм3, при выполнении условия

100 \cdot \frac{|C_{1} - C_{2}|}{\overline{C}} \leq r_{\text{отн}} , (9)

где rотн — предел повторяемости (см. таблицу 2), %.

Результат измерений округляют до целого числа.

Таблица 2

Метрологические характеристики метода при P = 0,95

9.2 Если подготовка пробы была проведена по 8.1.3, то массовую долю гесперидина (нарингина) в пробе X, млн-1, вычисляют по формуле

X = \frac{C_{x} \cdot V_{4} \cdot V_{2} \cdot Q}{m \cdot V_{3}} , (10)

где V4 — объем подготовленной по 8.1.3 пробы, равный 50 см3;

m — масса пробы, г.

За результат измерений массовой доли гесперидина (нарингина) в пробе принимают среднеарифметическое значение \overline{X} , млн-1, результатов двух параллельных измерений X1 и X2, млн-1, при выполнении условия

100 \cdot \frac{|X_{1} - X_{2}|}{\overline{X}} \leq r_{\text{отн}} , (11)

где rотн — предел повторяемости (см. таблицу 2), %.

Результат измерения округляют до целого числа.

При невыполнении условий (9) или (11) получают еще два результата измерений в соответствии с разделом 8 и затем устанавливают результат измерений в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 5.2).

9.3 Результаты измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием настоящего стандарта. В протоколе испытаний результат измерений представляют в следующем виде (с указанием компонента)

( \overline{C} +/- \Delta_{C} ), мг/дм3 (P = 0,95) (12) ( \overline{X} +/- \Delta_{X} ), млн-1 (P = 0,95), (13)

где \overline{C}(\overline{X}) — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений (см. 9.1 и 9.2), мг/дм3 (млн-1);

\Delta_{C} — значение границ абсолютной погрешности измерений массовой концентрации для доверительной вероятности P = 0,95, мг/дм3, вычисляемое по формуле

\Delta_{C} = \frac{\delta \cdot \overline{C}}{100} , (14)

где \delta — значение границ относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) для доверительной вероятности P = 0,95 (см. таблицу 2), %;

\Delta_{X} — значение границ абсолютной погрешности измерений массовой доли для доверительной вероятности P = 0,95, млн-1, вычисляемое по формуле

\Delta_{X} = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} . (15)

9.4 Результат измерений при содержании гесперидина (нарингина) менее нижней границы диапазона измерений представляют в протоколе в виде: «Менее Cн, мг/дм3» или «менее Xн, млн-1». Результат измерений при содержании гесперидина (нарингина) выше верхней границы диапазона измерений представляют в протоколе в виде: «Более Cв, мг/дм3» или «более Xв, млн-1», где Cн (Xн) и Cв (Xв) — нижняя и верхняя границы диапазона измерений массовой концентрации (массовой доли) гесперидина (нарингина) (см. раздел 1).

9.5 Результаты измерений, полученные в двух лабораториях, признают совместимыми при выполнении условий

2 \cdot \frac{|\overline{C_{1}} - \overline{C_{2}}|}{\overline{C_{1}} + \overline{C_{2}}} \leq 0,01 \cdot CD_{0,95} , (16)

где \overline{C_{1}} и \overline{C_{2}} — результаты измерений массовой концентрации компонента в первой и второй лабораториях соответственно, полученные по 9.1, мг/дм3;

CD0,95 — критическая разность, %,

или

2 \cdot \frac{|\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}|}{\overline{X_{1}} + \overline{X_{2}}} \leq 0,01 \cdot CD_{0,95} , (17)

где \overline{X_{1}} и \overline{X_{2}} — результаты измерений массовой доли компонента в первой и второй лабораториях соответственно, полученные по 9.2, млн-1.

Значение критической разности вычисляют по формуле

CD_{0,95} = \sqrt{R_{\text{отн}}^{2} - r_{\text{отн}}^{2} \cdot (1 - \frac{1}{n_{1}} - \frac{1}{n_{2}})} , (18)

где Rотн — предел воспроизводимости (см. таблицу 2), %;

rотн — предел повторяемости (см. таблицу 2), %;

n1 и n2 — число параллельных измерений в первой и второй лабораториях соответственно.

Если условия (16) и (17) не выполняются, то лабораториям рекомендуется провести процедуры, предусмотренные ГОСТ 5725-6 (пункты 5.3.3 и 5.3.4).

10 Контроль качества результатов измерений

Контроль качества результатов измерений осуществляют, используя методы контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости и контроля стабильности среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности с применением контрольных карт Шухарта по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 6.2.2, 6.2.3).

Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).

11 Требования безопасности

При выполнении измерений следует соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004.

Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.

12 Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории, изучившие руководство по эксплуатации жидкостного хроматографа и освоившие метод. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией ВЭЖХ и имеющего практические навыки в этой области.

Приложение А (справочное)

ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАММ

А.1 Примеры хроматограмм, полученных на колонке Alltima C18 (внутренний диаметр 2,1 мм, длина 120 мм, размер частиц 5 мкм), приведены на рисунках А.1, А.2.

1 — пик нарингина; 2 — пик гесперидина

Рисунок А.1 — Хроматограмма градуировочного раствора № 2 (см. 7.3.5)

1 — пик нарингина; 2 — пик гесперидина

Рисунок А.2 — Хроматограмма пробы соковой продукции — нектара из соков цитрусовых фруктов (апельсина, лимона, лайма), подготовленной по 8.1.2

А.2 Пример хроматограммы, подготовленной по 8.1.2 пробы соковой продукции, полученной на колонке Agilent ZORBAX SB-C18 (внутренний диаметр 4,6 мм, длина 250 мм, размер частиц 5 мкм), приведен на рисунке А.3.

1 — пик нарингина, 2 — пик гесперидина

Рисунок А.3 — Хроматограмма подготовленной пробы сокосодержащего напитка из апельсинов и грейпфрутов